申宇嘉，傅小龍

1.上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院放療科，上海 200030；

2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200025

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是常見的惡性腫瘤，2年相對(duì)生存率約為42%［1］。惡性腫瘤不是腫瘤細(xì)胞簡(jiǎn)單的堆積，而是腫瘤細(xì)胞生活在由成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞、炎性細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞間質(zhì)、微血管以及眾多驅(qū)動(dòng)分子構(gòu)成的微環(huán)境中。腫瘤與其微環(huán)境存在著制約和反制約的關(guān)系，其中免疫微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密不可分。Burnet［2］于1970年提出“免疫監(jiān)視”概念：免疫系統(tǒng)自動(dòng)識(shí)別和消滅癌細(xì)胞，從而防止腫瘤的發(fā)展。之后的多項(xiàng)研究［3-5］將其概念擴(kuò)展為“免疫編輯”：免疫細(xì)胞通過(guò)與腫瘤細(xì)胞的相互作用，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)育施加選擇性壓力，腫瘤免疫原性被免疫系統(tǒng)編輯，包括消除、平衡和逃逸3個(gè)連續(xù)階段。在消除期，免疫細(xì)胞通過(guò)激活先天性免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)消除免疫原性腫瘤。在消除期存活的少數(shù)變異型腫瘤細(xì)胞進(jìn)入平衡期，由于不斷的免疫壓力，部分腫瘤細(xì)胞發(fā)生遺傳或表觀遺傳改變，腫瘤細(xì)胞免疫原性被適應(yīng)性免疫系統(tǒng)編輯，獲得規(guī)避免疫識(shí)別的能力，進(jìn)入逃逸期，最終發(fā)展為臨床可檢測(cè)到的腫瘤。腫瘤免疫微環(huán)境分析是研究腫瘤免疫逃逸機(jī)制的必經(jīng)之路。本文就NSCLC微環(huán)境中免疫細(xì)胞的性質(zhì)、密度、免疫功能定向和空間分布在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展不同階段的變化進(jìn)行綜述，進(jìn)一步闡述免疫與NSCLC腫瘤細(xì)胞相互作用在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演的角色及其臨床意義。

1 NSCLC免疫微環(huán)境概述

2018年Nature Medicine雜志首次展示肺癌細(xì)胞圖譜，Lambrechts等［6］使用單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)在原發(fā)性非轉(zhuǎn)移性肺腫瘤患者中共鑒定出52個(gè)基質(zhì)細(xì)胞亞群，反映了腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，主要細(xì)胞類型包括內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、肺泡細(xì)胞和上皮細(xì)胞。NSCLC免疫微環(huán)境中的免疫浸潤(rùn)細(xì)胞包括適應(yīng)性和先天性免疫細(xì)胞［7］。Stankovic等［8］在NSCLC中發(fā)現(xiàn)了13種不同的免疫細(xì)胞類型組成超過(guò)95%的CD45+白細(xì)胞：B細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，雙陰性T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，漿細(xì)胞樣、CD1c+髓樣及CD141+髓樣樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC），自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，以及肥大細(xì)胞。

1.1 先天性免疫細(xì)胞

DC作為一種專職抗原提呈細(xì)胞，其成熟狀態(tài)與抗腫瘤效應(yīng)密切相關(guān)。成熟DC可以促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的活化和增殖，而未成熟DC具有免疫抑制作用，可通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）依賴方式誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）生成，促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸［9-10］。NSCLC中DC分為漿細(xì)胞樣DC（plasmacytoid DC，pDC）和髓樣DC（myeloid DC，mDC），后者根據(jù)表面標(biāo)志分為CD141+DC和CD1c+DC。pDC具有通過(guò)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素（interferon，IFN）增強(qiáng)抗腫瘤免疫的潛力，CD1c+DC和CD141+DC用于抗原呈遞和幼稚T細(xì)胞的激活。NSCLC中，CD1c+DC較CD141+DC更常見［8］。

髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）是DC、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞的前體，可進(jìn)一步分為粒細(xì)胞樣MDSC（granulocytic or polymorphonuclear MDSC，PMN-MDSC）和單核細(xì)胞樣MDSC（monocytic MDSC，M-MDSC），消耗腫瘤微環(huán)境內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，阻礙免疫細(xì)胞的增殖，同時(shí)造成腫瘤微環(huán)境內(nèi)的氧化應(yīng)激，影響免疫細(xì)胞的活性，具有顯著抑制免疫細(xì)胞應(yīng)答的能力，可抑制T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生［11］。體外實(shí)驗(yàn)［12］證實(shí)，來(lái)自人肺鱗狀細(xì)胞癌的MDSC可促進(jìn)CD8+T細(xì)胞凋亡和降低腫瘤細(xì)胞凋亡。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）是影響腫瘤微環(huán)境的重要免疫細(xì)胞之一，主要有兩種類型：M1型巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌活性氧（reactive oxygen species，ROS）、活性氮（reactive nitrogen species）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、IL-12、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IFN等促炎癥因子來(lái)發(fā)揮抗腫瘤免疫作用。M2型巨噬細(xì)胞被腫瘤微環(huán)境所誘導(dǎo)分泌IL-10、CC族趨化因子配體（CC chemokine ligand，CCL）-18、CCL-12等抗炎癥因子抑制免疫反應(yīng)，具有促進(jìn)血管生成的作用，從而建立免疫耐受微環(huán)境［13-14］。TAM的定位與NSCLC患者預(yù)后有關(guān)，一項(xiàng)meta分析［15］指出，腫瘤癌巢中高密度的CD68+TAM是良好的預(yù)后因素，而腫瘤間質(zhì)中高密度的CD68+TAM是不良的預(yù)后因素，因此TAM的位置可能是NSCLC患者的潛在預(yù)后預(yù)測(cè)因子。集落刺激因子-1受體（colonystimulating factor-1 receptor，CSF1R）作為介導(dǎo)巨噬細(xì)胞在腫瘤組織中存活的蛋白，其抑制劑被認(rèn)為是消除TAM的一種治療策略，但Kumar等［16］研究發(fā)現(xiàn)，雖然CSF1R抑制劑有效地消除了TAM，但會(huì)引起腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞釋放趨化因子CXCL1數(shù)量增加，從而招募更多的免疫抑制PMN-MDSC，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（tumor-associated neutrophil，TAN）可以根據(jù)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)作用分為N1和N2 TAN。前者通過(guò)其表面Fc受體識(shí)別腫瘤，釋放細(xì)胞毒介質(zhì)從而殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)激活先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞［17］。N2 TAN則在慢性炎癥免疫應(yīng)答的過(guò)程中釋放有利于血管生成的細(xì)胞因子，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移［18-19］。Engblom等［20］研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌分泌可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體來(lái)激活成骨細(xì)胞，形成表達(dá)高水平唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素F的中性粒細(xì)胞，后者通過(guò)促進(jìn)血管生成、髓細(xì)胞分化、抑制T細(xì)胞來(lái)促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)。

NK細(xì)胞可直接釋放穿孔素和顆粒酶B破壞靶細(xì)胞，也可通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用或死亡受體途徑Fas（CD95）和FasL（CD95L）相互作用介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［21-22］。根據(jù)細(xì)胞表面分子表達(dá)與否可將CD56+NK細(xì)胞分為CD16+和CD16-兩個(gè)亞群，前者細(xì)胞內(nèi)穿孔素和顆粒酶B的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于后組，因此CD16+NK細(xì)胞主要參與免疫調(diào)節(jié)作用。研究［23-24］發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者腫瘤中的NK細(xì)胞顯著減少，主要是由于NK細(xì)胞CD16+亞群水平降低所致。Russick等［25］對(duì)比了NSCLC腫瘤區(qū)和非腫瘤區(qū)NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中NK細(xì)胞下調(diào)鞘氨醇-1-磷酸受體1（sphingosine-1-phosphate receptor 1，S1PR1）和CX3C族趨化因子受體1（CX3C chemokine receptor 1，CX3CR1），過(guò)表達(dá)CXC族趨化因子受體5（CXC chemokine receptor 5，CXCR5）和CXCR6，表明NK細(xì)胞被遷移出腫瘤核心。CTL相關(guān)抗原4（CTL associated antigen-4，CTLA-4）和殺傷細(xì)胞凝集素樣受體抑制分子在腫瘤NK細(xì)胞中升高，證明NSCLC中NK細(xì)胞功能受到抑制，使肺癌細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。

1.2 適應(yīng)性免疫細(xì)胞

T淋巴細(xì)胞普遍被認(rèn)為在免疫系統(tǒng)中占據(jù)主導(dǎo)地位［24，26］。T淋巴細(xì)胞主要包括CTL、輔助T細(xì)胞（help T cell，Th）和Treg。Th1/Th2平衡失調(diào)會(huì)造成免疫系統(tǒng)功能紊亂，使腫瘤逃避免疫攻擊，有研究［27］證實(shí)，NSCLC與Th1/Th2漂移密切相關(guān)。CD4+和CD8+T細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子發(fā)揮適應(yīng)性免疫效能，而腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子會(huì)誘導(dǎo)、擴(kuò)增和招募Treg至腫瘤部位［28-29］。Treg具有免疫抑制性和免疫無(wú)能性兩大功能特性，其可上調(diào)T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（T cell immunoglobulin and mucin domain-3，TIM-3）、淋巴細(xì)胞活化基因-3（lymphocyte activation gene 3，LAG-3）等免疫抑制信號(hào)，誘導(dǎo)TGF-β活化，進(jìn)一步促進(jìn)Treg分化，抑制T細(xì)胞活化［30］。

B淋巴細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生抗體、誘導(dǎo)T細(xì)胞活化及抗原提呈來(lái)調(diào)控免疫反應(yīng)，主要存在于腫瘤的侵襲性邊緣和鄰近瘤床的三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（tertiary lymphoid structure，TLS）中。B淋巴細(xì)胞在腫瘤中發(fā)揮著雙向調(diào)節(jié)作用。一方面，腫瘤浸潤(rùn)B淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating B lymphocyte，TIL-B）能夠通過(guò)抗原提呈，產(chǎn)生抗體或分泌多種細(xì)胞因子正向調(diào)控抗腫瘤免疫，活化的浸潤(rùn)性B細(xì)胞與效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)，耗竭的TIL-B與Treg表型相關(guān)［31］。另一方面，調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（regulatory B cell，Breg）通過(guò)分泌細(xì)胞因子（如IL-10、IL-35、TGF-β）、抑制功能性T細(xì)胞（CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞）、促進(jìn)Treg和表達(dá)抑制性配體如程序性死亡［蛋白］配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）等機(jī)制發(fā)揮免疫抑制作用［32-34］。

2 NSCLC的癌細(xì)胞如何重塑免疫微環(huán)境

Chen等［35］提出“腫瘤-免疫循環(huán)”概念，腫瘤細(xì)胞釋放的抗原被DC捕獲并提呈給T細(xì)胞，啟動(dòng)和活化效應(yīng)T細(xì)胞，在趨化因子引導(dǎo)下，效應(yīng)T細(xì)胞遷移至腫瘤部位，通過(guò)T細(xì)胞受體與新抗原-主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）之間的相互作用識(shí)別并清除腫瘤細(xì)胞，然而持續(xù)的免疫選擇使腫瘤細(xì)胞獲得了規(guī)避免疫識(shí)別的能力。

腫瘤浸潤(rùn)發(fā)生后，DC提呈抗原，激活幼稚T細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞通過(guò)釋放細(xì)胞因子（如IFN-γ和TNF）促進(jìn)細(xì)胞毒性CD8+T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，增強(qiáng)免疫應(yīng)答。CD8+T淋巴細(xì)胞活化過(guò)程中需要共刺激信號(hào)，這些激活/抑制信號(hào)之間的平衡至關(guān)重要。最典型的共刺激信號(hào)是在抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）和活化B細(xì)胞上表達(dá)的B7家族分子（CD80和CD86）和T細(xì)胞上表達(dá)的CD28和CTLA-4之間。CD28在識(shí)別特定抗原后激活效應(yīng)T細(xì)胞，誘導(dǎo)T細(xì)胞上的CTLA-4表達(dá)［36］。CTLA-4是關(guān)鍵的免疫檢查點(diǎn)分子之一，抑制免疫反應(yīng)，與CD28競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD80和CD86。

NSCLC的腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)調(diào)節(jié)CD205和CD103在CD1c+DC上的表達(dá)來(lái)影響CD1c+DC亞群的免疫功能，抑制CD40、CD80和CD86等共刺激信號(hào)分子在DC上的表達(dá)。腫瘤細(xì)胞還可通過(guò)在DC中下調(diào)促炎癥因子（IL-12和IL-23）與上調(diào)抗炎癥因子（IL-10、TGF-β）的分泌來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性CD1c+DC亞群，阻斷CD8+T細(xì)胞的活性并誘導(dǎo)CD4+Treg產(chǎn)生，形成免疫抑制微環(huán)境［37］。

NSCLC的腫瘤細(xì)胞可分泌IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)初始T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg，促進(jìn)Treg增殖［38］，同時(shí)分泌趨化因子CCL20，募集FOXP3+Treg到腫瘤微環(huán)境中［39］。Treg表達(dá)的CTLA-4與抗原提呈細(xì)胞上的CD80和CD86結(jié)合，導(dǎo)致其下調(diào)并抑制其T細(xì)胞活化能力［40］，抑制CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒殺傷作用，介導(dǎo)免疫耐受。腫瘤細(xì)胞還可上調(diào)T細(xì)胞免疫抑制性受體的表達(dá)，包括程序性死亡［蛋白］-1（programmed death-1，PD-1）、CTLA-4、LAG-3、TIM-3來(lái)逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)測(cè)。由于在腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞不斷暴露于抗原，腫瘤內(nèi)T細(xì)胞表現(xiàn)出廣泛的抑制和功能障礙狀態(tài)，稱為T細(xì)胞衰竭［41-43］。

NSCLC中的APC顯著降低MHC-Ⅱ的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞本身也通過(guò)下調(diào)MHC-Ⅰ類分子來(lái)減少內(nèi)源性抗原表達(dá)。人白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）是MHC的表達(dá)產(chǎn)物，MHC-Ⅰ類分子存在于腫瘤細(xì)胞表面，對(duì)CD8+T細(xì)胞免疫識(shí)別非常重要。McGranahan等［44］研究發(fā)現(xiàn)，40%的NSCLC患者具有HLA雜合性缺失（HLA loss of heterozygosity，HLA-LOH），導(dǎo)致新抗原呈遞能力降低，促使腫瘤免疫逃逸。HLA-LOH與較高的亞克隆新抗原負(fù)荷、細(xì)胞溶解活性上調(diào)和PD-L1陽(yáng)性相關(guān)聯(lián)，提示HLA-LOH是腫瘤為應(yīng)對(duì)活躍的免疫微環(huán)境而作出的免疫逃逸反應(yīng)。

腫瘤還可通過(guò)外泌體調(diào)節(jié)周圍免疫微環(huán)境。腫瘤源性外泌體（tumor-derived exosome，TEX）是腫瘤和宿主細(xì)胞之間實(shí)現(xiàn)通訊的主要機(jī)制，能夠通過(guò)轉(zhuǎn)移其內(nèi)含物，如RNA（mRNA和非編碼RNA）、DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞-細(xì)胞通訊［45］。TEX分泌的miR-21和miR-29a可以作為配體與免疫細(xì)胞表面的Toll樣受體結(jié)合，觸發(fā)其介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化，最終導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［46］。TEX可通過(guò)TGF-β1調(diào)節(jié)NK細(xì)胞和DC的功能，如下調(diào)NKG2D抑制NK細(xì)胞功能［47-48］及抑制DC成熟從而促進(jìn)腫瘤抗原特異性免疫抑制［49］。TEX與單核細(xì)胞相互作用從而維持單核細(xì)胞不成熟的狀態(tài)，自發(fā)分泌免疫抑制性細(xì)胞因子（如TGF-β和前列腺素E2）抑制T細(xì)胞增殖［50］。TEX還可通過(guò)TGF-β和IL-10依賴性機(jī)制促進(jìn)Treg和Breg增殖［51］，并誘導(dǎo)CD 4+CD 25-T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg［52］?？傮w來(lái)說(shuō)，外泌體含有多種不同的免疫刺激和免疫抑制因子，可協(xié)助腫瘤細(xì)胞調(diào)節(jié)自身周圍環(huán)境，參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。

綜上，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)編輯腫瘤微環(huán)境來(lái)逃避免疫監(jiān)測(cè)，而這種逃避機(jī)制的選擇可能與免疫微環(huán)境有關(guān)。英國(guó)TRACERx肺癌研究計(jì)劃［53］整合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀基因組學(xué)和病理學(xué)數(shù)據(jù)研究腫瘤進(jìn)化過(guò)程中如何利用免疫逃逸機(jī)制，對(duì)88例早期未經(jīng)治療的NSCLC患者進(jìn)行分析，每例患者病灶多點(diǎn)取樣，發(fā)現(xiàn)不同的免疫微環(huán)境有不同的新生抗原呈遞功能障礙機(jī)制。免疫細(xì)胞浸潤(rùn)低的腫瘤在進(jìn)化過(guò)程中表現(xiàn)出新生抗原編輯能力的減弱，通過(guò)拷貝數(shù)丟失作為亞克隆免疫編輯機(jī)制；免疫細(xì)胞浸潤(rùn)高的腫瘤區(qū)域表現(xiàn)出持續(xù)的免疫編輯作用，通過(guò)HLA-LOH或抑制新生抗原的表達(dá)（新生抗原啟動(dòng)子高甲基化）來(lái)逃避免疫監(jiān)視。免疫微環(huán)境在早期未治療的NSCLC中發(fā)揮強(qiáng)大的選擇壓力，其進(jìn)化是通過(guò)免疫編輯機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。

3 NSCLC驅(qū)動(dòng)基因突變?nèi)绾尉庉嬆[瘤周邊微環(huán)境

3.1 NSCLC的基因組學(xué)變化

肺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多階段、多步驟的過(guò)程，主要是由于細(xì)胞通路中異?；虮磉_(dá)所致。與癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）cohort 2014數(shù)據(jù)相比，中國(guó)肺腺癌患者表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變頻率較高，而KRAS、BRAF、TP53和KEAP1突變頻率較低［54-55］。分析非浸潤(rùn)性與早期浸潤(rùn)性肺腺癌基因組的差別，浸潤(rùn)性肺腺癌（invasive adenocarcinoma，IAC）的突變譜與原位癌（adenocarcinoma in situ，AIS）的突變譜密切相關(guān)，但與不典型腺瘤樣增生（atypical adenomatous hyperplasia，AAH）的突變譜不相關(guān)［56］。多項(xiàng)研究［57-58］表明，浸潤(rùn)性腺癌與非浸潤(rùn)性腺癌突變頻率差異最大的是TP53突變，說(shuō)明TP53突變狀態(tài)與癌細(xì)胞潛在侵襲功能相關(guān)。從原位癌到微浸潤(rùn)和浸潤(rùn)性腺癌的演化過(guò)程中伴隨著更多基因拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）事件，原位腺癌中CNV多與細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)相關(guān)，微浸潤(rùn)腺癌和浸潤(rùn)性腺癌中CNV多與轉(zhuǎn)移及侵襲相關(guān)［59］。

3.2 NSCLC的基因組學(xué)改變對(duì)免疫微環(huán)境的影響

NSCLC的驅(qū)動(dòng)基因突變會(huì)影響腫瘤免疫細(xì)胞表達(dá)。多項(xiàng)研究［60-61］發(fā)現(xiàn)，EGFR突變型腫瘤表現(xiàn)出強(qiáng)大的髓系細(xì)胞募集，但未能產(chǎn)生CD8+免疫應(yīng)答，Gainor等［60］和Busch等［61］報(bào)道，EGFR突變患者CD8+高表達(dá)率僅為4.2%。KRAS突變表現(xiàn)出包括CD8+T細(xì)胞和Treg在內(nèi)的T細(xì)胞和B細(xì)胞多個(gè)免疫亞群的擴(kuò)增［61］。TP53突變患者的免疫相關(guān)基因表達(dá)水平顯著增加，活化CD8+T淋巴細(xì)胞、活化CD4+記憶T細(xì)胞、趨化因子和促炎癥因子（IL、TNF及IFN-γ）表達(dá)水平增加［62］。STK11/LKB1突變通過(guò)AMPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡和腫瘤轉(zhuǎn)移，STK11突變腫瘤的CD4+和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)減少［63］，并造成免疫微環(huán)境中具有T細(xì)胞抑制作用的中性粒細(xì)胞的累積和促腫瘤細(xì)胞因子（如CXCL7、CXCL3、CXCL5和IL-1a）的過(guò)度產(chǎn)生［64］，在促進(jìn)免疫抑制環(huán)境中發(fā)揮作用。

基因組學(xué)改變與PD-1/PD-L1通路的激活也存在密切聯(lián)系。有研究［65-66］發(fā)現(xiàn)，EGFR突變可誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)，但也有研究［67］指出，EGFR突變的NSCLC患者表達(dá)PD-L1陽(yáng)性的比例比野生型EGFR顯著降低。在間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）重排的肺腺癌中，ALK陽(yáng)性腫瘤表達(dá)PD-L1的腫瘤細(xì)胞平均數(shù)量和百分比均顯著高于EGFR突變或野生型肺腺癌。PD-L1在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)與CD8+T細(xì)胞在腫瘤內(nèi)的浸潤(rùn)有很強(qiáng)的相關(guān)性［68］。Schoenfeld等［69］研究發(fā)現(xiàn)，KRAS、TP53、MET突變與PD-L1表達(dá)顯著正相關(guān)，EGFR、STK11突變與PD-L1表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)。

Zhang等［54］通過(guò)檢測(cè)患者的免疫浸潤(rùn)相對(duì)水平建立了腫瘤微環(huán)境的免疫分子標(biāo)簽。在肺腺癌中，免疫T細(xì)胞浸潤(rùn)與KRAS基因突變及擴(kuò)增顯著相關(guān)，而免疫細(xì)胞低水平浸潤(rùn)則與EGFR基因突變有關(guān)。在肺鱗癌中，免疫評(píng)分低的患者，TP63、PIK3CA和SOX2擴(kuò)增及TP53、NFE2L2突變較多，同時(shí)顯示出較多的PTEN缺失。在PIK3CA擴(kuò)增或PTEN缺失較多的肺鱗癌患者樣本中，T細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物及CD8的表達(dá)明顯減少。

4 在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中免疫微環(huán)境的差異性

腫瘤免疫微環(huán)境存在異質(zhì)性，腫瘤間和腫瘤內(nèi)的免疫浸潤(rùn)均不同。20%以上的患者存在不同腫瘤部位的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)差異［53］，即使是浸潤(rùn)前腫瘤（如原位癌）也存在顯著的異質(zhì)性［59］。Jia等［70］對(duì)15例NSCLC患者多位點(diǎn)取樣，并開發(fā)一種機(jī)器學(xué)習(xí)算法來(lái)描述局部抗腫瘤反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫微環(huán)境存在較大的空間異質(zhì)性，12例患者的44個(gè)腫瘤樣本分別被劃分為“冷腫瘤”和“熱腫瘤”，其中6例患者的不同腫瘤部位同時(shí)存在“冷腫瘤”和“熱腫瘤”。但總體來(lái)說(shuō)，NSCLC誘導(dǎo)強(qiáng)大的免疫浸潤(rùn)，腫瘤中CD45+白細(xì)胞的比例高于正常肺組織［24］。Guo等［71］進(jìn)一步闡明T細(xì)胞亞群分布也存在組織特異性，如幼稚T細(xì)胞大多表達(dá)于來(lái)自外周血的細(xì)胞，而CD8+耗竭T細(xì)胞和CD4+Treg大多存在于腫瘤細(xì)胞中，癌旁正常肺組織中則主要為效應(yīng)T細(xì)胞。

4.1 不同病理學(xué)階段的免疫微環(huán)境

多項(xiàng)研究［24,54,72］顯示，與正常肺組織相比，NSCLC腫瘤中T細(xì)胞和B細(xì)胞的頻率增高，NK細(xì)胞的頻率降低。Lizotte等［23］研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤中CD8+T細(xì)胞的頻率升高，尤其是CD45RO+CD8+記憶T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞和FOXP3+Treg細(xì)胞的頻率皆升高。Lavin等［73］聚焦于早期肺腺癌微環(huán)境中免疫細(xì)胞的組成，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中效應(yīng)T細(xì)胞/Treg比值降低，NK細(xì)胞尤其是CD16+NK細(xì)胞亞型顯著減少。腫瘤組織中巨噬細(xì)胞具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄特征，與正常肺組織相比，其高表達(dá)免疫抑制轉(zhuǎn)錄因子過(guò)氧化物酶增殖體激活受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptor γ，PPARγ）、CD64、CD14和CD11c，低表達(dá)CD86和CD206。PD-L1在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)量最高，PD-L1+巨噬細(xì)胞在腫瘤浸潤(rùn)邊緣聚集，并與T細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤(rùn)程度呈負(fù)相關(guān)，表明適應(yīng)性免疫在肺癌發(fā)生的早期階段已經(jīng)受到抑制，形成免疫抑制微環(huán)境。Krysan等［56］評(píng)估AAH、AIS、IAC 3種病變及毗鄰的組織學(xué)正常區(qū)域的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度，AAH較正常肺組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加，AIS和IAC較AAH顯著增加。隨著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，腫瘤組織中免疫細(xì)胞呈現(xiàn)規(guī)律性變化。

Mascaux等［74］從浸潤(rùn)前肺鱗癌患者的免疫狀態(tài)出發(fā)，分析各階段（正常肺組織、不典型增生、原位癌和浸潤(rùn)性鱗癌）支氣管活檢樣本中的免疫細(xì)胞。從重度不典型增生起，髓源性抑制細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞亞型豐度顯著增加，先天和適應(yīng)性免疫細(xì)胞存在共調(diào)控。差異基因分析發(fā)現(xiàn)，在低級(jí)別病變（正常組織，輕度、中度不典型增生）中，負(fù)調(diào)節(jié)相關(guān)基因顯著下調(diào)，介導(dǎo)免疫釋放；在高級(jí)別病變（重度不典型增生、原位癌）和肺鱗癌中，負(fù)調(diào)節(jié)相關(guān)基因顯著上調(diào)，誘導(dǎo)免疫逃逸。原位癌中一部分進(jìn)展為肺鱗癌，但另一部分自然退化，目前普遍認(rèn)為宿主免疫監(jiān)測(cè)與病變的退行密切相關(guān)。Beane等［75］對(duì)肺鱗癌的癌前病變組織進(jìn)行分子分型，發(fā)現(xiàn)不同癌前病變組織的免疫狀態(tài)是不同的。持續(xù)進(jìn)展至肺鱗癌的癌前病變中IFN通路與抗原呈遞通路基因表達(dá)降低，先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞減少，癌前病變的進(jìn)展可能是腫瘤微環(huán)境中缺少浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的結(jié)果。Pennycuick等［76］研究發(fā)現(xiàn)，退行性病變中CD3+CD8+CTL顯著多于進(jìn)展性病變，CD3+CD4+輔助性T細(xì)胞和Treg差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腫瘤的免疫逃避能力主要體現(xiàn)在阻止T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤區(qū)域，而非影響T細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能，其還明確了原位癌進(jìn)展為鱗癌的潛在免疫逃逸機(jī)制：CCL27/CCR10信號(hào)上調(diào)，免疫調(diào)節(jié)因子TNFSF9下調(diào)。有研究［77］進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，NEK2基因高表達(dá)極可能預(yù)示著所在病變組織將發(fā)展為肺鱗癌。

NSCLC中腫瘤部位的T細(xì)胞衰竭與T細(xì)胞的多種抑制性受體表達(dá)有關(guān)。Lizotte等［23］研究發(fā)現(xiàn)，抑制性受體（如PD-1、TIM-3、LAG-3和CTLA-4）在腫瘤T細(xì)胞中的表達(dá)高于正常肺組織，在肺鱗癌中的表達(dá)高于肺腺癌。Zhang等［59］觀察到，無(wú)論是非浸潤(rùn)性還是浸潤(rùn)性肺腺癌，PD-L1的表達(dá)水平差異不大，表明早期腫瘤已經(jīng)處于免疫抑制的微環(huán)境中。

4.2 不同臨床階段的免疫微環(huán)境

Lavin等［73］研究認(rèn)為，巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC、B細(xì)胞和T細(xì)胞的亞群分布在不同肺腺癌分期中沒(méi)有顯著差別。Stankovic等［8］比較了肺腺癌和肺鱗癌不同分期（Ⅰ～Ⅲ期）腫瘤組織中CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、CD1c+DC、pDC和巨噬細(xì)胞的百分比，發(fā)現(xiàn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），但CD141+DC在Ⅰ期NSCLC中的百分比高于Ⅱ、Ⅲ期（P=0.04）。而Chen等［78］通過(guò)對(duì)NSCLC腫瘤組織行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期NSCLC中2種B細(xì)胞亞型（初始B細(xì)胞和漿細(xì)胞）的分布存在差異，Ⅲ期的初始B細(xì)胞顯著低于Ⅰ期，且初始B細(xì)胞的浸潤(rùn)水平越高，存活率和無(wú)復(fù)發(fā)率越高，其通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，Ⅲ期NSCLC的漿細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，而Ⅰ期的漿細(xì)胞抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

關(guān)于抑制性受體在T細(xì)胞中的表達(dá)與腫瘤分期是否有關(guān)尚存在爭(zhēng)議。Thommen等［43］研究發(fā)現(xiàn)，PD-1和TIM-3在腫瘤部位CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)隨著腫瘤分期的增加而增加。Kargl等［24］則認(rèn)為，CD4+細(xì)胞PD-1的表達(dá)與腫瘤分期相關(guān)，CD8+細(xì)胞PD-1的表達(dá)與腫瘤分期無(wú)關(guān)。Lavin等［73］研究指出，巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的PD-1和PD-L1的表達(dá)水平在TNM各個(gè)時(shí)期比較穩(wěn)定。

晚期轉(zhuǎn)移性NSCLC可能具有與早期不同的分子特征。Kim等［79］對(duì)44例轉(zhuǎn)移性肺腺癌患者原發(fā)灶、胸膜液、淋巴結(jié)或腦轉(zhuǎn)移的腫瘤樣本進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，發(fā)現(xiàn)髓樣細(xì)胞啟動(dòng)免疫抑制微環(huán)境，腫瘤組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中正常的髓樣細(xì)胞群逐漸向單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞和DC轉(zhuǎn)變，且后者顯示為免疫抑制表型，這可能導(dǎo)致肺腺癌和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的腫瘤抗原呈現(xiàn)不佳。腦轉(zhuǎn)移作為晚期肺癌的常見轉(zhuǎn)移部位，Li等［80］研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC腦轉(zhuǎn)移患者表現(xiàn)出較強(qiáng)的全身性免疫抑制，與早期未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者相比，外周血單核細(xì)胞中PD-L1表達(dá)、MDSC豐度和Treg百分比均顯著增加，而腫瘤來(lái)源的IL-6是誘導(dǎo)單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)的主要介質(zhì)。Kudo等［81］研究了39例NSCLC患者的原發(fā)灶與腦轉(zhuǎn)移瘤樣本并進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，腦轉(zhuǎn)移瘤中存在更加嚴(yán)重的免疫抑制現(xiàn)象，分析兩組樣本的差異基因發(fā)現(xiàn)，與原發(fā)腫瘤相比，腦轉(zhuǎn)移瘤中DC成熟、Th1和白細(xì)胞外溢信號(hào)通路受到抑制。血管細(xì)胞黏附分子1表達(dá)水平更低，抑制白細(xì)胞黏附于炎癥部位，CD8+T細(xì)胞減少，M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加。

5 NSCLC免疫微環(huán)境的臨床意義

5.1 預(yù)后轉(zhuǎn)歸不同

CD8+、CD3+、CD45RO+T細(xì)胞普遍被認(rèn)為與NSCLC預(yù)后呈正相關(guān)［26,82］。一項(xiàng)針對(duì)797例Ⅰ～ⅢA期NSCLC患者的研究［83］證實(shí)，腫瘤間質(zhì)中的CD8+T細(xì)胞密度被證明是無(wú)病生存期（disease-free survival，DFS）和總生存期（overall survival，OS）的獨(dú)立預(yù)后因素，并在每個(gè)病理學(xué)分期階段增加對(duì)預(yù)后的影響。Fridman等［84］回顧了124項(xiàng)T細(xì)胞對(duì)腫瘤（包括NSCLC）預(yù)后作用的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的強(qiáng)浸潤(rùn)通常與較好的預(yù)后相關(guān)，最穩(wěn)定的積極預(yù)后指標(biāo)為CD8+T細(xì)胞、CD45RO+T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞。而Foxp3+Treg的高浸潤(rùn)普遍被認(rèn)為與NSCLC的不良OS顯著相關(guān)［85］。

免疫細(xì)胞的預(yù)后價(jià)值需要綜合考慮細(xì)胞類型、細(xì)胞亞群、空間分布和功能狀態(tài)。近些年提出免疫熱區(qū)和免疫冷區(qū)的概念，TRACERx研究［86］利用人工智能手段繪制肺腺癌中免疫細(xì)胞的空間位置圖譜，根據(jù)淋巴細(xì)胞百分比劃分免疫熱區(qū)和免疫冷區(qū)，前者的腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)明顯高于后者。臨床蛋白質(zhì)組腫瘤分析聯(lián)盟則通過(guò)多組學(xué)的方式對(duì)肺腺癌不同免疫特征建立了不同分型，共鑒定出64種不同的細(xì)胞類型，包括免疫和基質(zhì)細(xì)胞，聚類分析出免疫熱區(qū)和免疫冷區(qū)，發(fā)現(xiàn)免疫熱區(qū)具有更強(qiáng)的B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、DC和巨噬細(xì)胞特征，PD-1、PD-L1、TGF-β和IL-10表達(dá)上調(diào)［87］。

5.2 對(duì)免疫治療的應(yīng)答不同

免疫微環(huán)境中免疫細(xì)胞數(shù)量、種類、功能與抗腫瘤免疫應(yīng)答密切相關(guān)。2017年，Chen等［88］將腫瘤組織分為免疫炎癥型（inflamed phenotype）、免疫豁免型（immue-excluded phenotype）和免疫沙漠型（immune-desert phenotype）。免疫炎癥型腫瘤有豐富的T細(xì)胞（包括CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞）浸潤(rùn)，對(duì)于抗PD-1/PD-L1免疫治療的反應(yīng)良好；免疫豁免型腫瘤免疫細(xì)胞存在于腫瘤基質(zhì)中，不能滲透入腫瘤實(shí)質(zhì)；免疫沙漠型腫瘤無(wú)論是腫瘤基質(zhì)還是實(shí)質(zhì)均缺少T細(xì)胞，后兩者通常對(duì)免疫治療均缺少應(yīng)答。2021年MD安德森癌癥中心通過(guò)對(duì)29個(gè)功能基因表達(dá)特征的轉(zhuǎn)錄組分析將腫瘤微環(huán)境進(jìn)行分類，創(chuàng)建了4種不同黑色素瘤的腫瘤微環(huán)境模型，并在多個(gè)癌種（包括肺癌）中驗(yàn)證其作為一種生物標(biāo)志物用于預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療效果的預(yù)測(cè)價(jià)值［89］。

6 結(jié)語(yǔ)

在NSCLC微環(huán)境中，免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞及其他基質(zhì)細(xì)胞和組織成分之間存在復(fù)雜的相互作用。免疫微環(huán)境持續(xù)地給腫瘤施加免疫壓力，使腫瘤通過(guò)免疫編輯來(lái)完成免疫逃逸，而這種免疫編輯機(jī)制可能與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的程度有關(guān)。本綜述描述了免疫細(xì)胞在不同病理學(xué)階段及臨床分期NSCLC中的浸潤(rùn)情況，這些細(xì)胞的分布和功能在不同程度上與腫瘤的進(jìn)展和患者預(yù)后相關(guān)。免疫細(xì)胞能夠識(shí)別癌前病變，免疫系統(tǒng)在腫瘤形成非常早期時(shí)已發(fā)生功能失調(diào)。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、驅(qū)動(dòng)基因、CNV的水平和程度、非同義突變負(fù)荷和克隆異質(zhì)性都參與NSCLC免疫結(jié)構(gòu)的形成，并決定其異質(zhì)性。越來(lái)越多的證據(jù)表明，腫瘤周邊免疫微環(huán)境對(duì)NSCLC的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義，不同的免疫微環(huán)境也會(huì)影響腫瘤對(duì)免疫治療的應(yīng)答及最終預(yù)后轉(zhuǎn)歸。