鞏靖蕾 黃艷梅 王軍

口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院正畸科 成都 610041

牙周組織是由牙齦、牙周膜、牙骨質(zhì)及牙槽骨共同組成的復(fù)雜牙齒支撐結(jié)構(gòu)，在為牙齒提供營養(yǎng)的同時(shí)發(fā)揮固定、支持和傳遞咀嚼力的重要功能[1-2]。牙周炎與牙周致病菌大量入侵、牙周菌群失衡、自身免疫反應(yīng)以及吸煙等危險(xiǎn)因素相關(guān)[3]。該疾病一旦發(fā)生便難以逆轉(zhuǎn)，最終導(dǎo)致牙齒松動、脫落[4]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，慢性牙周炎在我國成人中患病率高達(dá)80%以上[5]，是造成我國成年人失牙的主要原因[6]，給患者帶來嚴(yán)重的健康與美觀問題。同時(shí)有研究[7-11]表明：牙周炎也與心血管疾病、糖尿病、阿爾茨海默病、胃腸道疾病、呼吸道感染及不良妊娠結(jié)局等系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

組織工程技術(shù)和生物材料一直是牙周再生（periodontal regeneration）的研究熱點(diǎn)，其中多相支架（multiphase scaffolds）是一種同時(shí)具備多種內(nèi)部結(jié)構(gòu)（例如不同孔隙度、孔隙尺寸、孔隙形狀等）和/或多種生化成分的復(fù)雜支架材料[12]，可以通過區(qū)域特異性的各相優(yōu)化不同組織的再生修復(fù)。近年來多相支架的迅猛發(fā)展增加了多組織同時(shí)再生的可行性，被廣泛應(yīng)用于骨-軟骨、牙周復(fù)合體等復(fù)雜修復(fù)領(lǐng)域[13]。本綜述從牙周復(fù)雜再生需求和多相支架優(yōu)勢入手，概述多相支架結(jié)合生長因子、干細(xì)胞技術(shù)、3D打印、微圖案處理等新興技術(shù)以及其對現(xiàn)有牙周治療的補(bǔ)充與完善，探究多相支架在牙周組織結(jié)構(gòu)和功能再生中的應(yīng)用潛力。

1 多相支架材料與牙周復(fù)雜再生

生物支架材料能夠支撐再生所需空間，引導(dǎo)細(xì)胞增殖遷移，已經(jīng)成為組織工程中穩(wěn)定成熟的一環(huán)。支架內(nèi)部可以同時(shí)具備各異的物理、化學(xué)及生物學(xué)性能，根據(jù)其特異性區(qū)域數(shù)量及分布情況，可將其分為單相、雙相和多相支架[13]。單相支架受到自身結(jié)構(gòu)及成分的限制，無法滿足多組織同步再生的需求[4,14]；而多相支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)和（或）功能成分的多樣則有益于重建各組織界面固有的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，最終實(shí)現(xiàn)功能性新附著的形成。另外，多相支架仍保留有支架材料的優(yōu)良特性，例如宏觀尺寸、力學(xué)性能與降解速率等都可精準(zhǔn)控制，足以適應(yīng)與支撐形態(tài)多變的缺損區(qū)域，為再生提供空間。因此，多相支架有望實(shí)現(xiàn)同時(shí)涉及軟硬組織的多組織再生修復(fù)。

隨著醫(yī)療衛(wèi)生的進(jìn)步，牙周組織再生的概念也在不斷發(fā)展和完善。牙周再生不僅僅涉及牙骨質(zhì)、牙周膜、牙槽骨3種組織的簡單形成，更強(qiáng)調(diào)三者高度協(xié)調(diào)的時(shí)空關(guān)系以及牙周組織功能的重建[1-2,15]。這就要求牙周膜-牙骨質(zhì)、牙周膜-牙槽骨及宿主環(huán)境之間實(shí)現(xiàn)良好整合，再生牙周膜纖維的兩端應(yīng)分別插入新生牙骨質(zhì)與牙槽骨之中，同時(shí)恢復(fù)其定向排列與一定的生理斜度，以重建其生理負(fù)荷和牙周穩(wěn)態(tài)[16-17]。目前越來越多的研究將多相支架的結(jié)構(gòu)、成分和功能進(jìn)行不斷改進(jìn)，以實(shí)現(xiàn)牙周復(fù)合體再生的靶向優(yōu)化。應(yīng)用于牙周組織再生的多相支架的各相通常根據(jù)目標(biāo)再生的組織名稱分別命名為牙周膜相、牙槽骨相、牙骨質(zhì)相，具有良好特異性的同時(shí)又高度協(xié)調(diào)一致，共同滿足牙周復(fù)雜再生的需求。

2 多相支架作為生長因子傳遞系統(tǒng)用于牙周組織再生

多相支架的各相可以分別負(fù)載多種生物活性分子，將其傳遞給對應(yīng)組織，對牙本質(zhì)/牙骨質(zhì)、牙周膜和牙槽骨的再生分別進(jìn)行優(yōu)化，表現(xiàn)出強(qiáng)大的空間特異性。Sowmya等[18]設(shè)計(jì)合成多相納米復(fù)合水凝膠支架，其牙骨質(zhì)相、牙周膜相和牙槽骨相分別負(fù)載牙骨質(zhì)蛋白1（cementum protein 1，CEMP1）、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）和富血小板血漿生長因子（platelet-rich plasma，PRP）。該牙周修復(fù)材料表現(xiàn)出對人牙囊干細(xì)胞成牙骨質(zhì)、成纖維及成骨向分化的調(diào)控作用，實(shí)現(xiàn)了新生牙骨質(zhì)、高密度的牙槽骨及兩者之間斜行牙周膜纖維的共同復(fù)雜再生。Huang等[19]設(shè)計(jì)的雙相冷凍凝膠支架，包括含有明膠的軟組織相和進(jìn)一步結(jié)合β-磷酸鈣/羥磷灰石顆粒的硬組織相，分別緩釋牙釉質(zhì)基質(zhì)衍生物（enamel matrix derivatives，EMD）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2），同樣表現(xiàn)出強(qiáng)大的牙周復(fù)合體再生能力。

更重要的是，多相支架還表現(xiàn)出負(fù)載分子傳遞的時(shí)序特異性。首先多相支架中各相孔徑的差異可以影響遞送速率。有研究[20]表明：多相支架的各相分別攜帶重組人釉原蛋白（recombinant human amelogenin，rHAM）、結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor）及BMP-2，利用各異的微通道直徑來調(diào)控其釋放速度，促進(jìn)成牙骨質(zhì)、成骨、成膠原相關(guān)基因的區(qū)域特異性表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了牙周復(fù)合體的再生。其次，多相支架多樣的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和組成成分也導(dǎo)致了活性分子擴(kuò)散途徑的差異。Ding等[21]利用同軸靜電紡絲技術(shù)制備核-殼結(jié)構(gòu)纖維，將降解速度快的聚乳酸-羥基乙酸共聚物 ［poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA］ 作為外殼而降解時(shí)間較長的聚乳酸［poly(L-lactic acid)，PLLA］作為內(nèi)核，實(shí)現(xiàn)了外殼中FGF的初期突釋和內(nèi)核中BMP-2長達(dá)4周的緩慢穩(wěn)定釋放，分別促進(jìn)早期間充質(zhì)干細(xì)胞向缺損部位的大量募集與增殖和后期其成骨成纖維的多向分化，顯著提升了修復(fù)進(jìn)程。

生長因子相關(guān)的基因治療因其良好的傳遞效率和穩(wěn)定性，有望成為生長因子的有效替代方法。已有研究[22]將介孔生物玻璃材料與多孔紡絲纖維有序組合構(gòu)成多相支架。Zhang等[23]將血小板衍生生長因子 （platelet derived growth factor，PDGF）及BMP-2的腺病毒與該復(fù)合多相支架結(jié)合，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)前者能夠更多地募集牙周膜干細(xì)胞而后者可誘導(dǎo)其成骨向分化，兩者的協(xié)同作用大大提高體內(nèi)牙周組織再生能力。Xie等[24]在多相支架的內(nèi)核中使用聚乙烯亞胺作為陽離子非病毒載體，借助其毒性小、抗原性好、插入性致癌風(fēng)險(xiǎn)低等優(yōu)點(diǎn)，攜帶BMP-2質(zhì)粒，體外實(shí)驗(yàn)顯示：該材料對人牙周膜干細(xì)胞具有極高的轉(zhuǎn)染效率，可以調(diào)控其成骨分化。綜上，多相支架材料可以作為良好的生長因子傳遞系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)其靶向、可控、有序地釋放，也能夠與基因治療結(jié)合，極大提升了牙周復(fù)雜再生效果。

3 多相支架結(jié)合干細(xì)胞技術(shù)用于牙周組織再生

具有自我更新和分化能力的干細(xì)胞以及各種功能細(xì)胞是組織工程技術(shù)的關(guān)鍵，然而體外細(xì)胞培養(yǎng)與支架的簡單組合并不能滿足復(fù)雜牙周多組織再生的需求[25]。多相支架作為一種具備區(qū)域特異性的細(xì)胞負(fù)載材料，有望突破現(xiàn)有細(xì)胞治療的局限。Wu等[26]將牙齦干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，制備組織工程牙周膜/礦化膜構(gòu)成的“三明治樣”多相復(fù)合體，結(jié)果證實(shí)：該復(fù)合體不僅可以修復(fù)犬前磨牙根分叉區(qū)的牙槽骨和牙骨質(zhì)，新生的牙周纖維還呈45°斜向有序穿行其中，提示牙周功能得到重建。Requicha等[27]將犬來源的脂肪干細(xì)胞接種于多相支架上，其中導(dǎo)電紡絲纖維網(wǎng)狀層作為外層膜相，其表面形貌可以促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的黏附與增殖，抑制上皮細(xì)胞遷移，發(fā)揮阻礙上皮組織長入缺損區(qū)的物理屏障作用；而內(nèi)層骨相則經(jīng)過硅醇基團(tuán)功能化處理，促進(jìn)了干細(xì)胞的成骨分化，加速了新骨形成。

除細(xì)胞自身性能以外，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）等微環(huán)境也在一定程度上影響干細(xì)胞功能。多相支架在模擬牙周多組織ECM微環(huán)境方面具有顯著優(yōu)勢，各相結(jié)構(gòu)可以激發(fā)并調(diào)控干細(xì)胞向不同方向分化，促進(jìn)多組織復(fù)雜再生。有研究[28]制備的多相支架高度模擬了牙周干細(xì)胞ECM的天然蛋白和超微結(jié)構(gòu)，證實(shí)該多相支架的牙本質(zhì)基質(zhì)相與牙髓細(xì)胞外基質(zhì)相分別調(diào)控干細(xì)胞成牙周向與成骨向分化，最終新生的牙周組織與天然結(jié)構(gòu)高度相似，且支架中的定向紡絲結(jié)構(gòu)引導(dǎo)了新生細(xì)胞的有序排列，即實(shí)現(xiàn)了牙周組織結(jié)構(gòu)及功能的復(fù)雜再生。

在干細(xì)胞組織工程中，細(xì)胞片技術(shù)雖然突破了傳統(tǒng)組織工程技術(shù)限制，但也存在植入后強(qiáng)度不足、血管形成困難、細(xì)胞活性下降等問題[29-30]。Iwata等[31]的研究提示植入細(xì)胞片的明顯移位可能是阻礙牙周復(fù)合體再生的原因之一。細(xì)胞片與多相支架的結(jié)合能夠順利解決這些問題。Vaquette等[32]構(gòu)建了一種多相支架，通過牙周膜相負(fù)載多層牙周膜細(xì)胞片，細(xì)胞活性和穩(wěn)定性都得到了大大提升，牙周纖維再生效能顯著。Costa等[33]對這種多相支架進(jìn)行磷酸鈣（calcium phosphate，CaP）涂層處理，使其成骨性也得到進(jìn)一步提升，同時(shí)連通各相的微通道引導(dǎo)了貫穿整個(gè)多相支架的血管網(wǎng)的形成，進(jìn)而保證了細(xì)胞片的長期活性，實(shí)現(xiàn)了更好的再生效果。綜上，多相支架能夠負(fù)載牙周再生所需干細(xì)胞并模擬其ECM，以更大程度地發(fā)揮牙周干細(xì)胞的再生潛能。多相支架與細(xì)胞片的結(jié)合，能保證細(xì)胞片植入后的生物力學(xué)穩(wěn)定性和強(qiáng)度；其多孔結(jié)構(gòu)也為細(xì)胞相互作用和血管的形成提供有利條件。與單一支架相比，多相支架明顯加快了新附著形成和重建的進(jìn)程。

4 多相支架可以改良和提升現(xiàn)有牙周治療策略

局部感染是重要的牙周致病因素，也是牙周治療困難、易復(fù)發(fā)的主要原因之一，給國民經(jīng)濟(jì)和衛(wèi)生保健都帶來了沉重負(fù)擔(dān)[34]。局部載藥的生物材料可將藥物分子直接送到所需部位，并能夠在較長時(shí)間內(nèi)持續(xù)釋放以實(shí)現(xiàn)更好的療效[35-36]，其中多相支架作為局部載藥系統(tǒng)之一，具有藥物選擇面廣、負(fù)載簡單、釋放速度可控等優(yōu)點(diǎn)。Ranjbar-Mohammadi等[37]通過改變支架的成分與內(nèi)部結(jié)構(gòu)，可以調(diào)控牙周常見抗菌藥物——鹽酸四環(huán)素的釋放速率，最久緩釋長達(dá)75 d，體外實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出優(yōu)異且持久的抗菌性能。Chen等[38]的研究使用芯鞘雙相的納米纖維，在負(fù)載牙周抗感染藥物的同時(shí)加載功能化修飾的蛋白因子，實(shí)現(xiàn)了抗感染和促進(jìn)修復(fù)的雙重效應(yīng)。

多相支架還可以滿足同一載藥系統(tǒng)中多種藥物的非同步釋放。Guo等[39]運(yùn)用熱誘導(dǎo)相分離技術(shù)，制備負(fù)載有2種藥物的三維多功能支架，其中抗炎藥物在初始階段快速釋放，短期內(nèi)有效控制炎癥，促成骨藥物則后期持續(xù)釋放以保證后期成骨重塑。大鼠牙周缺損再生結(jié)果顯示該多相支架的抗炎活性和成骨效能協(xié)同促進(jìn)了牙周再生[39]。

除此之外，引導(dǎo)組織再生術(shù)（guided tissue regeneration，GTR）作為當(dāng)前主要的牙周治療手段[40]，其空間維持及組織屏障性能均可以通過多相支架實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步提升。Carlo Reis等[41]以骨傳導(dǎo)性PLGA/CaP材料為內(nèi)相，其多孔性結(jié)構(gòu)有利于血凝塊滯留和血管的形成，為后期骨再生提供充足血供；CaP薄膜為外相，發(fā)揮組織屏障作用，阻礙上皮細(xì)胞長入。該GTR多相支架在犬Ⅱ類根分叉缺損修復(fù)中表現(xiàn)出良好的牙周再生作用。由此可見，多相支架可以輔助改良現(xiàn)有的牙周治療手段，提升療效與預(yù)后，具有強(qiáng)大的臨床應(yīng)用前景。

5 多相支架結(jié)合多種新興材料技術(shù)

牙周炎引發(fā)的骨缺陷程度隨著疾病發(fā)展進(jìn)程而變化，差異較大，從患牙局部的角形吸收到全口廣泛的水平吸收，這就對牙周再生支架的尺寸精確性提出更高要求。3D打印技術(shù)是近年來推動再生領(lǐng)域的重大創(chuàng)新之一，可以更快、更精確地實(shí)現(xiàn)個(gè)性化仿生結(jié)構(gòu)的開發(fā)[42]。Park等[43]利用3D打印技術(shù)調(diào)控牙周膜相和骨相蠟?zāi)５暮暧^尺寸以適應(yīng)牙周骨缺損空間，具備良好的臨床應(yīng)用前景。3D打印還可以精確控制多相支架內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)。Lee等[20]為模擬牙骨質(zhì)、牙槽骨和牙周膜的天然致密度結(jié)構(gòu)的差異，打印出微通道直徑分別為100、300、600 μm的各相。Park等[43]使用3D打印在牙周膜相界面上設(shè)計(jì)了多個(gè)垂直牙根面的微通道，以此引導(dǎo)細(xì)胞增殖和纖維組織浸潤方向，最終實(shí)現(xiàn)牙周纖維定向排列及功能的再生。

多相支架還可以結(jié)合表面微圖案化處理技術(shù)，以調(diào)控細(xì)胞黏附、遷移、排列、分化及胞內(nèi)信號的表達(dá)。Pilipchuk等[44]研究證實(shí)：使用微圖案化聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）支架修復(fù)再生的牙周膜厚度更接近天然水平，且表達(dá)更多的成骨效應(yīng)，這可能與微圖案槽溝為骨傳導(dǎo)性骨再生提供更多的錨定位點(diǎn)有關(guān)。Pilipchuk等[45]進(jìn)一步在3D打印骨相支架上運(yùn)用微圖案技術(shù)獲得牙周膜相，使其具備多孔多相的宏觀特征和規(guī)律的微圖案化特性，體外實(shí)驗(yàn)顯示該多相支架具有明顯的模板特性，引導(dǎo)細(xì)胞沿表面微圖案延展，促進(jìn)牙周細(xì)胞有序排列及膠原纖維的定向再生。此外，電磁信號在引導(dǎo)干細(xì)胞分化行為、成骨細(xì)胞激活和后續(xù)骨生長調(diào)控中均發(fā)揮重要作用[46]，但將其與多相支架聯(lián)合運(yùn)用于牙周再生的相關(guān)研究較少。有研究[47]運(yùn)用聚合3,4-乙烯二氧噻吩這一導(dǎo)電生物聚合物來賦予雙相支架材料良好的導(dǎo)電性，電刺激下可促進(jìn)牙周干細(xì)胞生長、增殖及纖維韌帶向分化。Sprio等[48]則在多相支架的骨相層構(gòu)建鐵離子化羥磷灰石的特殊構(gòu)型，賦予其一定的超順磁性。該支架與干細(xì)胞共培養(yǎng)證實(shí)其促進(jìn)細(xì)胞增殖與成骨分化，但其體內(nèi)再生效果尚待進(jìn)一步研究。

6 總結(jié)與展望

多相支架的開發(fā)雖然已經(jīng)取得了可喜的成績，但在牙周組織再生中的靶向應(yīng)用仍有許多關(guān)鍵問題及技術(shù)瓶頸需要進(jìn)一步研究與改良。首先，牙周復(fù)合體中的不同組織承受的負(fù)荷有一定差異，例如牙骨質(zhì)、牙槽骨需要承擔(dān)較大的壓力而牙周膜則承擔(dān)了一定的拉伸力[49]，因此多相支架的各相應(yīng)具備各異的力學(xué)性能以實(shí)現(xiàn)優(yōu)良的生物模擬性，表達(dá)更具有區(qū)域特異性的組織工程支架作用。其次，多相支架的各相應(yīng)該有相互連通的微通道結(jié)構(gòu)，用于流動運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物，以實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞交流傳遞和新生血管的形成，提升最終的再生效果。再次，有研究[50]證實(shí)牙周各組織的生長和重建存在時(shí)間上的差異，而支架材料需要在再生組織成熟后才能開始降解以保證修復(fù)效果，因此多相支架中各相的成分選擇及其降解速率應(yīng)與牙周再生后期的相應(yīng)組織的重建和成熟速率相協(xié)調(diào)。最后，多相支架雖然具有機(jī)構(gòu)成分各異的相層，但是不能忽視其作為一個(gè)整體的多種效應(yīng)。某些處理技術(shù)例如層壓、燒結(jié)[32,51]等可能會產(chǎn)生黏著較弱甚至不滲透的各相界面，導(dǎo)致多相支架喪失了其作為整體時(shí)的功能集成效應(yīng)，因此相與相之間的結(jié)合技術(shù)還有待進(jìn)一步研究，以期實(shí)現(xiàn)有機(jī)結(jié)合并且增強(qiáng)其凝聚力，確保其在植入及后續(xù)再生過程中結(jié)構(gòu)及功能的長期穩(wěn)定。

牙周組織再生這一問題從提出至今，雖然取得了令人欣喜的進(jìn)步，但仍面臨著更高的要求與挑戰(zhàn)，目前常見的臨床治療策略并不能實(shí)現(xiàn)牙周組織結(jié)構(gòu)與功能的復(fù)雜再生。多相支架在牙周再生領(lǐng)域的應(yīng)用，是組織工程科學(xué)與口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的交叉融合，對生物材料進(jìn)一步優(yōu)化并與生長因子、干細(xì)胞及藥物有機(jī)結(jié)合使其靶向應(yīng)用，具有極大的研究意義和應(yīng)用前景。目前多相支架在牙周組織再生中的應(yīng)用仍停留在實(shí)驗(yàn)研究階段，還有很多方面有待進(jìn)一步研究與完善。以臨床問題為導(dǎo)向、疾病為靶點(diǎn)，有望優(yōu)化多相支架設(shè)計(jì)及其作用機(jī)制探索，對牙周組織再生、牙周治療以及組織工程領(lǐng)域的發(fā)展均具有重要意義。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。