唐 珊 周圣荃 劉巧鳳

成都醫(yī)學(xué)院病理與病理生理學(xué)教研室，四川成都 710083

突觸素（synaptophysin，SYN）是包裹突觸小泡的膜蛋白，是突觸活性和突觸生長(zhǎng)過程中的分子標(biāo)志物[1]。濫用藥物會(huì)對(duì)神經(jīng)元的突觸連接和功能產(chǎn)生影響，遍及大腦的獎(jiǎng)賞回路，包括海馬、伏核、腹側(cè)被蓋區(qū)和中腦導(dǎo)水管灰質(zhì)區(qū)等[2-10]。嗎啡依賴大鼠注射納絡(luò)酮誘發(fā)戒斷反應(yīng)后，中腦導(dǎo)水管灰質(zhì)區(qū)、藍(lán)斑、黑質(zhì)、豆?fàn)詈?、杏仁核神?jīng)細(xì)胞的突觸在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為數(shù)量增多，并隨嗎啡依賴時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增加[11]。嗎啡成癮大鼠注射納絡(luò)酮引發(fā)戒斷反應(yīng)，海馬突觸密度增加，突觸素表達(dá)增加[12-13]。自然戒斷大鼠，伏核突觸密度和數(shù)量增加，突觸連接面積增加[14]。前期研究發(fā)現(xiàn)多巴胺D1 受體拮抗劑SCH23390 降低嗎啡戒斷反應(yīng)，但突觸可塑性是否在此過程中起作用，還有待研究。因此，本研究將探討SCH23390 對(duì)戒斷反應(yīng)和突觸素表達(dá)的影響，為臨床應(yīng)用嗎啡減輕副作用提供理論基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 主要試劑

多巴胺D1 受體拮抗劑SCH23390（美國(guó)Abcam 公司，批號(hào)：ab120597）；多巴胺D1 受體激動(dòng)劑SKF38393（美國(guó)Abcam 公司，批號(hào)：120740）；兔抗SYN 單克隆抗體（美國(guó)Abcam 公司，批號(hào)：ab32127）；鼠抗β-actin單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz 公司，批號(hào)：sc-47778）；山羊抗鼠或山羊抗兔IgG 二抗（美國(guó)Millipore 公司，批號(hào)：21538、21537）；鹽酸嗎啡注射液（沈陽(yáng)第一制藥廠，批號(hào)：161015-1）；DAB 染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ZLI-9018）；免疫組化試劑盒（北京中杉金橋公司，批號(hào)：SAP-9101、SAP-9102）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

8 周齡Wistar 雄性大鼠，體重200～230 g，飼養(yǎng)溫度（24±1）℃，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，合格證號(hào)SCXK（川）2020-030。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將40 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、嗎啡組、SCH23390 組和SKF38393 組，每組10 只。嗎啡組、SCH23390 組和SKF38393 組大鼠按劑量遞增原則，每日8:00 及20:00 腹腔注射嗎啡1 次、連續(xù)5 d，劑量從10 mg/kg（第1 天起）逐漸增至50 mg/kg（第5 天）。SCH23390 組第1～4 天上午注射嗎啡前15 min 中腦導(dǎo)水管灰度區(qū)（PAG）核團(tuán)微量注射0.5 μL 10 mmol/L SCH23390；SKF38393 組PAG 核團(tuán)微量注射0.5 μL 5 mmol/L SKF38393。對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。所有大鼠第5 天注射鹽水或嗎啡后1 h 腹腔注射納洛酮（4 mg/kg），觀察戒斷反應(yīng)[15-16]。

1.3 戒斷反應(yīng)

記錄30 min 內(nèi)可數(shù)癥狀（如僵直、跳躍、濕狗抖動(dòng)、摩擦身體、跑或反常姿勢(shì)）次數(shù)，每個(gè)癥狀每出現(xiàn)1 次記1 分。不可數(shù)癥狀（如齒顫、瞇眼、腹瀉、呵欠、陰莖勃起、眼淚或鼻涕），每5 分鐘記錄1 次，每個(gè)癥狀每出現(xiàn)1 次記1 分，最高為6 分。體重減少率=（納絡(luò)酮注射前體重-注射后1 h 體重）/注射前體重×100%，每減少1%記1 分。全部體征評(píng)分總和為該只動(dòng)物戒斷反應(yīng)總分[17-18]。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，無(wú)動(dòng)物死亡。

1.4 PAG 埋管

大鼠異氟烷吸入麻醉后固定在立體腦定位儀上，將外徑0.6 mm 的不銹鋼雙套管埋入PAG（AP：-7.6 mm，ML：±0.70 mm，DV：-5.0 mm）[19]，注射針外徑0.4 mm超出套管下端1 mm，用牙科水泥固定。

1.5 Western blot 檢測(cè)

將PAG 核團(tuán)加入含PMSF、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 蛋白裂解液，研磨離心收集上清液。按照Bradford 方法測(cè)量蛋白濃度[20]。然后進(jìn)行SDSPAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉。孵育SYN 抗體（1∶300）或β-actin 抗體（1:1000）4℃過夜。次日加二抗孵育。使用Quantity One 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.6 免疫組化和陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)

常規(guī)脫蠟復(fù)水，微波抗原修復(fù)，山羊血清封閉，滴加1∶100 SYN 抗體4℃過夜。次日孵育二抗37℃20 min，滴加辣根酶復(fù)合物37℃15 min，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水透明封片。在光學(xué)顯微鏡下，SYN 陽(yáng)性細(xì)胞為圓形或梭形，細(xì)胞漿呈棕褐色。每張切片40 倍鏡下取PAG 背側(cè)、左上、右上、左下和右下5 個(gè)鏡野，計(jì)數(shù)每個(gè)鏡野陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)，取均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析結(jié)合Bonferroni 檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠戒斷反應(yīng)行為學(xué)比較

嗎啡組戒斷反應(yīng)總分及齒顫、腹瀉、反常姿勢(shì)、瞇眼、濕狗樣抖動(dòng)評(píng)分高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。SCH23390 組戒斷反應(yīng)總分、齒顫、腹瀉評(píng)分低于嗎啡組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。SKF38393 組和嗎啡組戒斷反應(yīng)總分及齒顫、腹瀉、瞇眼、濕狗樣抖動(dòng)評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P ＞0.05）；而SKF38393 組反常姿勢(shì)評(píng)分高于嗎啡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 四組大鼠戒斷反應(yīng)行為學(xué)比較（分，，n=10）

表1 四組大鼠戒斷反應(yīng)行為學(xué)比較（分，，n=10）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與嗎啡組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

2.2 四組大鼠SYN 蛋白和陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量比較

嗎啡組SYN 蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。SCH23390 組SYN 蛋白表達(dá)水平低于嗎啡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。SKF38393 組SYN 蛋白表達(dá)水平高于嗎啡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖1、表2。

嗎啡組SYN 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。SCH23390 組SYN 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量低于嗎啡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。SKF38393 組SYN 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量高于嗎啡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2、圖2。

圖1 Western blot 檢測(cè)SYN 蛋白表達(dá)情況

表2 四組大鼠SYN 蛋白和陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量比較（，n=5）

表2 四組大鼠SYN 蛋白和陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量比較（，n=5）

注：與對(duì)照組比較，**P ＜0.01；與嗎啡組比較，#P ＜0.05。SYN：突觸素

3 討論

嗎啡暴露大鼠預(yù)先給予SCH23390 治療后，會(huì)降低戒斷反應(yīng)和SYN 表達(dá)，相反，多巴胺D1 受體激動(dòng)劑增加了反常姿勢(shì)和SYN 表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺失多巴胺D1 受體的細(xì)胞培養(yǎng)液，將減少樹突棘和SYN表達(dá)；反之，增加多巴胺D1 受體的細(xì)胞培養(yǎng)液將增加樹突棘和SYN 表達(dá)[21]。多巴胺D1 受體拮抗劑SCH23390 逆轉(zhuǎn)長(zhǎng)期使用成癮物質(zhì)引起的突觸數(shù)量和突觸后密度長(zhǎng)度增加，并減少突觸蛋白的表達(dá)[22-23]。多巴胺D1 受體激動(dòng)劑SKF38393 干預(yù)后，在一定程度上減輕神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的損壞程度，使突觸囊泡較多，突觸后致密帶增厚[24]。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中多巴胺D1 受體拮抗劑SCH23390 增加神經(jīng)元樹突棘消亡率[25]。

圖2 免疫組化檢測(cè)SYN 陽(yáng)性神經(jīng)元定位和表達(dá)（DAB 染色，400×）

綜上所述，SCH23390 可能通過降低SYN 抑制嗎啡戒斷反應(yīng)，以上發(fā)現(xiàn)將為臨床應(yīng)用嗎啡減輕副作用提供理論依據(jù)。