李宇翔 豐錦春 吳 濤 阿孜古麗·阿布都熱合曼 郁璐月 朱麗萍

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科一病區(qū)，新疆烏魯木齊 830000

乳腺癌現(xiàn)居全球女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位[1]。隨著對乳腺癌在基因水平上探索的深入，為提高其治愈率與生存期提供了基礎(chǔ)[2-3]，尤其是對侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差且異質(zhì)性高的三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）的遺傳變異的研究帶來了新的突破[4]。影響TNBC 發(fā)生的相關(guān)危險(xiǎn)因素中，基因拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）與其聯(lián)系相當(dāng)緊密，CNV攜帶者有很高的乳腺癌發(fā)病率[5-7]，CNV 亞顯微水平的變化與腫瘤的發(fā)生呈因果關(guān)系[8]。本研究旨在探討CNV 與TNBC 患者臨床病理特征和預(yù)后之間的關(guān)系，為TNBC 患者預(yù)后研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（以下簡稱“我院”）2014 年1 月—2016 年1 月資料完整的86 例TNBC 患者為研究對象，中位年齡56 歲（32～81 歲）；根據(jù)中國臨床腫瘤學(xué)會2019 年分期標(biāo)準(zhǔn)[9]，Ⅰ期5 例，Ⅱ期57 例，Ⅲ期24 例?；颊呷朐汉缶c院方簽署知情同意書，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，且標(biāo)本均經(jīng)病理診斷、免疫組化及FISH 檢測驗(yàn)查。納入標(biāo)準(zhǔn)：①初次行手術(shù)治療的TNBC；②有完整臨床和隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前接受放化療；②合并其他惡性腫瘤，有惡性腫瘤病史。

1.2 方法

全外顯子高通量平行測序技術(shù)檢測CNV 情況。從癌組織及癌旁組織中提取DNA 樣品，進(jìn)行基因組DNA 片段化，利用Agilent 2100 Bioanalyzer 生物芯片分析儀進(jìn)行質(zhì)控。PCR 擴(kuò)增后通過Qubit 2.0 核酸蛋白定量儀對文庫進(jìn)行定量。測序所得原始數(shù)據(jù)雙端序列比對到參考序列上，基于比較結(jié)果進(jìn)行染色體結(jié)構(gòu)變異的CNV 情況分析。

1.3 測序結(jié)果的判定

采用Control-FREEC[10]系統(tǒng)檢測基因組片段的CNV 情況，檢測結(jié)果中包括：拷貝數(shù)缺失、拷貝數(shù)擴(kuò)增以及拷貝數(shù)正常的雜合性缺失。進(jìn)行CNV 比較時(shí)需要將同一患者癌組織及癌旁組織樣本配對并進(jìn)行CNV 合并后再行檢測，合并方法是使用CNVRuler[11]工具，最后錄入每對組織樣本中各條染色體中缺失、擴(kuò)增、雜合性缺失的拷貝數(shù)及拷貝數(shù)總數(shù)。

1.4 隨訪

采用定期電話隨訪、門診復(fù)查、入院復(fù)查記錄的方式對患者進(jìn)行隨訪，隨訪起始時(shí)間為患者手術(shù)當(dāng)日，終止時(shí)間為死亡，截至2020 年1 月15 日，中位隨訪時(shí)間為38 個(gè)月，所有患者均獲得有效隨訪資料。

1.5 臨床資料的收集

收集患者臨床病理資料，包括：①年齡；②TNM分期；③淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況；④原發(fā)腫瘤大小、組織學(xué)分級、Ki67 表達(dá)、月經(jīng)情況；⑤惡性腫瘤家族病史；⑥總生存期、5 年生存率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。雙變量關(guān)聯(lián)性分析采用Pearson 積矩相關(guān)分析、Spearman 秩相關(guān)分析法，采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析，組間曲線比較采用Log-rank 檢驗(yàn)，多因素分析采用Cox 回歸分析法。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者CNV 分布情況

有效測序數(shù)據(jù)通過bwa-0.7.15[12]系統(tǒng)的SAM 格式比較，樣本經(jīng)配對合并后共存在5928 個(gè)差異CNV，其中擴(kuò)增41.92%（2485/5928），缺失15.99%（948/5928），正常19.47%（1154/5928），雜合性缺失22.62%（1341/5928）。癌組織（4080 個(gè)，68.83%）與癌旁組織（1848 個(gè)，31.17%）CNV 分布情況比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見表1。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組在8 號染色體上有最頻繁的CNV 擴(kuò)增，無病生存組在17 號染色體有最頻繁的CNV 丟失及雜合區(qū)域（圖1）。snpEFF[13]軟件對CNV 檢測結(jié)果進(jìn)行注釋，樣本中可能存在發(fā)生CNV 的基因型主要有BRCA1/2 基因（在8 號染色體缺失）、FGFR2 基因（在17 號染色體缺失）（圖2）。

圖1 CNV 在染色體上的分布示意圖

圖2 基因缺失在染色體上的分布

表1 患者CNV 分布情況比較（個(gè)）

2.2 CNV 與臨床病理特征相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)性分析顯示，CNV 與年齡、原發(fā)腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈線性相關(guān)（r=-0.87、0.92、0.94，P ＜0.05）。Spearman 秩相關(guān)分析顯示，CNV 與TNM 分期呈正相關(guān)（r=0.83，P ＜0.01）。見圖3。

2.3 生存分析

至隨訪結(jié)束，86 例中死亡15 例（17.44%），5 年總生存率為82.56%。8 號染色體發(fā)生CNV 者47 例，5 年生存率為74.4%；無CNV 者5 年生存率為92.3%，兩組5 年生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.495，P=0.034）。見圖4。17 號染色體發(fā)生CNV 者51 例，5 年生存率為74.5%；無CNV 者5 年生存率為94.3%，兩組5 年生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.145，P=0.046 ）。見圖5。Cox 多因素回歸分析顯示，CNV 情況、TNM 分期是TNBC 患者預(yù)后的影響因素（HR=0.456、1.927，P ＜0.0 5）。見表2。

圖3 CNV 與病理特征相關(guān)性分析

圖4 8 號染色體CNV 患者5 年生存率比較

3 討論

評估腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，并給予醫(yī)學(xué)干預(yù)改善患者的預(yù)后，是乳腺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。常用的TNM 分期預(yù)后評價(jià)體系，存在明顯的局限性。分子遺傳學(xué)領(lǐng)域多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，16 號染色體長臂（16 q）拷貝數(shù)頻繁丟失發(fā)生于乳腺癌、肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤，16 q拷貝數(shù)全部或部分缺失的乳腺癌惡性程度高于非缺失者，并與預(yù)后存在明顯的相關(guān)性[14]。Svetlana 等[15]研究認(rèn)為CNV 的差異會影響患者的無病生存期，且存在大量CNV 患者在術(shù)后可能會較早復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

圖5 17 號染色體CNV 患者5 年生存率比較

表2 三陰性乳腺癌患者Cox 多因素回歸分析

本研究對樣本進(jìn)行了CNV 檢測，其中有4691 個(gè)基因在不同組織中存在突變，其原因可能是在腫瘤細(xì)胞減數(shù)分裂過程中，基因組上同一位點(diǎn)的DNA 序列能與其同源序列發(fā)生重組，即等位同源重組。但對于基因組上的重復(fù)序列，除同一位點(diǎn)上的同源序列外，不同位點(diǎn)上的重復(fù)序列也可能具有高度同源性，發(fā)生非等位的同源重組[16-17]。本研究樣本經(jīng)檢測在負(fù)荷最高的8 號、17 號染色體上存在有BRCA1/2 基因、FGFR2 基因、KRAS 基因等基因的突變類型。癌細(xì)胞分裂后，據(jù)觀察同源重組發(fā)生的位點(diǎn)不是隨機(jī)分布在基因組上的，存在一定的序列傾向性，即重組熱點(diǎn)，這可能導(dǎo)致了存在多重組熱點(diǎn)的TNBC 患者會出現(xiàn)更多的CNV，進(jìn)而影響其臨床病理特征及預(yù)后。

癌組織樣本中CNV 數(shù)目顯著高于癌旁組織，這可能由于在疾病進(jìn)程中，易復(fù)發(fā)的TNBC 原始癌細(xì)胞突變時(shí)細(xì)胞核異型性更明顯，染色體上多對等位基因變異，在DNA 復(fù)制過程中存在更多的拷貝數(shù)大片丟失或擴(kuò)增現(xiàn)象，從而帶來更大的負(fù)荷，導(dǎo)致其組織學(xué)分級更高，發(fā)生淋巴結(jié)及全身轉(zhuǎn)移的更早，對術(shù)后化療敏感度降低，腫瘤惡性程度高且易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。存在大量CNV 的患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)高于較低數(shù)量CNV 的患者，這也提示TNBC 患者發(fā)生大量CNV與其預(yù)后有很高的相關(guān)性。大量研究結(jié)果顯示，TNBC與其他類型乳腺癌的臨床病理特征比較具有更明顯的特征[18-20]。相關(guān)[21-22]研究認(rèn)為TNBC 復(fù)發(fā)及死亡高峰期為術(shù)后5 年內(nèi)，并與腫瘤分級、CNV 情況具有一定的相關(guān)性。基于DNA 重組機(jī)制與DNA 錯(cuò)誤復(fù)制機(jī)制的基因組重排可以產(chǎn)生多種類型的CNV[23]，這也就導(dǎo)致了患者臨床病理特征的差異，但是否CNV 種類越多，患者差異越明顯，預(yù)后越差，還需提高CNV分辨率及基因組覆蓋率后進(jìn)一步探討研究。

Miron 等[24]進(jìn)行的前瞻性臨床試驗(yàn)對1550 例原發(fā)乳腺癌患者的生存進(jìn)行了分析，其中TNBC 患者5 年總生存率為81.0%，5 年無瘤生存率為84.0%，與本研究患者生存率相似。Zhang 等[25]在拷貝數(shù)改變負(fù)荷導(dǎo)致乳腺癌生存率的差異分析中認(rèn)為，CNV 的攜帶者負(fù)荷最高的是1、8 和16 號染色體，且與乳腺癌生存率之間存在顯著的關(guān)聯(lián)。發(fā)現(xiàn)8 號染色體有最頻繁的CNV 擴(kuò)增，17 號染色體有最頻繁的CNV 丟失及雜合區(qū)域，同時(shí)8、17 號染色體也是負(fù)荷最高的兩條染色體，這與國內(nèi)研究結(jié)果存在一定的差異。其原因可能是新疆處于我國西部邊陲，是一個(gè)多民族聚居的地區(qū)。本研究中納入了包括漢族、維吾爾族、哈薩克族、回族等7 種民族患者樣本，由于民族的差異，在染色體發(fā)生CNV 的過程中，高負(fù)荷染色體結(jié)果可能因樣本多民族種類產(chǎn)生差異，而在負(fù)荷較高的8、17 號染色體上發(fā)生CNV 的患者5 生存率顯著低于未發(fā)生CNV的患者。因此，目前數(shù)據(jù)支持患者在8、17 號染色體差異CNV 可能作為TNBC 的預(yù)后指標(biāo)，但CNV 導(dǎo)致的染色體變異是否與TNBC 的不良預(yù)后直接相關(guān)仍需要大量的研究，本研究由于樣本量偏小尚不能確切論述CNV 與TNBC 患者預(yù)后的因果關(guān)系，還需要擴(kuò)大樣本量后進(jìn)一步研究。