余富勇 余翔 鄉(xiāng)曉嵐 沈耿楊 尚奇

陳文敏1 湯凱1，2 陳桂鋒1，2 王曉文1 江曉兵2* 任輝2*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510400 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510405 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身性骨病[1]。老齡化是OP的危險(xiǎn)因素，我國已經(jīng)步入老齡化社會(huì)，且老齡人口依舊呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，OP發(fā)病率隨之增長(zhǎng)[2]。OP的治療消耗了家庭和社會(huì)的較大精力和財(cái)富。目前，防治OP的藥物并不能滿足當(dāng)前的需求。干細(xì)胞療法是目前治療OP的一種新興療法，國內(nèi)外已有研究報(bào)道了干細(xì)胞移植可有效防治OP[3-4]。干細(xì)胞移植后，可歸巢到OP局部損傷區(qū)域，但目前干細(xì)胞移植后存在歸巢效率不佳的問題，從而限制了干細(xì)胞的治療效果，成為干細(xì)胞治療OP的瓶頸之一。

因此，為提升干細(xì)胞移植治療OP的療效，提升干細(xì)胞歸巢效率具有不可忽視的重要意義。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎法能夠有效促進(jìn)骨再生[5]，補(bǔ)腎中藥和方劑在促進(jìn)干細(xì)胞歸巢方面發(fā)揮著重要作用。因此，探究補(bǔ)腎法促干細(xì)胞歸巢在骨質(zhì)疏松中的應(yīng)用具有重要意義。本文擬探討補(bǔ)腎法促干細(xì)胞歸巢在骨質(zhì)疏松中的應(yīng)用前景。

1 補(bǔ)腎法治療OP的中醫(yī)內(nèi)涵

OP屬于中醫(yī)古籍所載的“骨痿”“骨枯”[6]。《素問》記載：“腎者……精之處也……其充在骨”，《醫(yī)經(jīng)精義》云：“腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨”，OP多由腎虛所致，腎精漸衰導(dǎo)致骨髓無力生化，骨量稀少，引發(fā)OP。因此OP的治療關(guān)鍵是補(bǔ)腎。中醫(yī)多從補(bǔ)腎陰、補(bǔ)腎陽治療OP。《素問》中提出“陰在內(nèi)，陽之守也；陽在外，陰之使也”。陽化氣不足，骨髓無力生化，進(jìn)一步使陰成形受損，致使骨質(zhì)形成功能降低，是“陰陽失衡”引發(fā)OP的重要過程。補(bǔ)腎法通過補(bǔ)充腎精激發(fā)“陽化氣”功能，進(jìn)而改善“陰成形”能力促進(jìn)骨再生，恢復(fù)丟失的骨量，治療OP。本文重點(diǎn)論述補(bǔ)腎法激發(fā)“陽化氣”功能階段的機(jī)制。

2 干細(xì)胞的歸巢機(jī)制

歸巢是一個(gè)協(xié)調(diào)的多步驟過程，包括滾動(dòng)、內(nèi)皮細(xì)胞粘附及最終由選擇素和整合素介導(dǎo)的跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移[7]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)最常用于OP的治療，其壁龕位于血管壁附近，骨小梁的內(nèi)表面，在纖維間隙內(nèi)，少量存在于臍血、牙組織、滑液和肌肉中，因此可能從血流、骨髓、肌肉或骨膜中遷移[8]。目前，干細(xì)胞歸巢的機(jī)制并不明確。在歸巢的啟動(dòng)研究方面，主要圍繞基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromal cell derived factors，SDF-1)與CXCR4軸展開，遷移的過程與整合素及鈣粘蛋白密切相關(guān)，遷移后的細(xì)胞行為也會(huì)對(duì)歸巢產(chǎn)生影響。

2.1 干細(xì)胞歸巢與SDF-1/CXCR4軸

干細(xì)胞的遷移通常由組織釋放的信號(hào)分子啟動(dòng)，其中SDF-1/CXCR4備受關(guān)注。SDF-1與CXCR4的表達(dá)在一定程度上提示了干細(xì)胞的歸巢能力，且與年齡及OP密切相關(guān)，年輕大鼠中的MSCs向SDF-1遷移的能力及CXCR-4的表達(dá)水平高于成年大鼠，顯著高于OVX大鼠[9-10]。Chen等[11]用熒光標(biāo)記法在小鼠體內(nèi)輸注Aln-Lipo-SDF-1，生物光子成像顯示其在骨組織中積聚，且移植的GFP+MSCs被骨髓吸引，SDF-1表達(dá)上調(diào)觸發(fā)了MSCs遷移，促進(jìn)骨再生。這表明通過對(duì)SDF-1的修飾，可促進(jìn)歸巢，提高骨量，進(jìn)一步證實(shí)了SDF-1與MSCs遷移的緊密聯(lián)系。

SDF-1的趨化作用也受趨化細(xì)胞CXCR4表達(dá)水平的影響，表達(dá)水平越高，歸巢能力越高，且SDF-1對(duì)不表達(dá)CXCR4的細(xì)胞不具有趨化歸巢的作用[12]。Sanghani等[13]用CXCR4轉(zhuǎn)染MSCs并注射到OVX大鼠中發(fā)現(xiàn)，CXCR4轉(zhuǎn)染能夠顯著提高OVX-MSCs的CXCR4的表達(dá)(從19%到40%)，僅能較少提高年輕大鼠MSCs的CXCR4表達(dá)(5%)，未轉(zhuǎn)染的年輕MSCs能夠高表達(dá)內(nèi)源性CXCR4(92%)。年輕MSCs能夠具有高表達(dá)CXCR4的能力，因而，Sui等[14]認(rèn)為，移植年輕或健康MSCs治療OP時(shí)，無需用CXCR4進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2.2 干細(xì)胞歸巢與細(xì)胞間接觸

通過SDF-1/CXCR4軸啟動(dòng)MSCs歸巢后，為了使細(xì)胞遷移，必須破壞細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的接觸，為此，需通過局部釋放酶來破壞鈣粘蛋白和整合素的接觸。整合素α4β1結(jié)合纖維粘連蛋白和血管細(xì)胞粘附分子1(vascular cell adhesion molecule，VCAM-1)可促進(jìn)干細(xì)胞的遷移，且用其擬肽制配體與對(duì)骨有高度親和力的藥物結(jié)合可改善骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢，增加骨膜部位的骨形成[1]。破壞細(xì)胞原有接觸的過程也與AKT的活化有關(guān)，AKT可能通過增加肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的分泌促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC)的遷移，也可能與降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜有關(guān)。Liu等[9]用ADM3100(SDF-1阻斷劑)預(yù)處理細(xì)胞對(duì)SDF-1表達(dá)進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞磷酸化AKT(p-AKT)的水平降低。這些結(jié)果表明干細(xì)胞在相應(yīng)的條件下可以破壞細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間原有的接觸，促使遷移的發(fā)生。

2.3 干細(xì)胞歸巢與成骨分化

干細(xì)胞遷移后發(fā)生成骨分化時(shí)，成骨相關(guān)因素也對(duì)MSCs的遷移產(chǎn)生影響。汪偉等[15]的研究表明，Runx2基因過表達(dá)可能激活了CXCL12(即SDF-1)/CXCR4信號(hào)軸，從而促進(jìn)了MSCs的體外遷移。但是當(dāng)MSCs分化為成骨細(xì)胞后，SDF-1/CXCR4信號(hào)軸對(duì)已分化為成骨細(xì)胞的MSCs將不再具有趨向性。Sanghani-Kerai等[10]的研究也表明，轉(zhuǎn)染CXCR4的MSCs分化為成骨細(xì)胞后，盡管其能夠表達(dá)CXCR4，但并不向SDF-1遷移，這可能與分化后細(xì)胞外基質(zhì)的沉積及基質(zhì)金屬蛋白酶使SDF-1失活有關(guān)?？梢姡琒DF-1/CXCR4是啟動(dòng)干細(xì)胞歸巢的關(guān)鍵軸之一。歸巢啟動(dòng)后，整合素與鈣粘蛋白的結(jié)合降低破壞了細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)的接觸，促進(jìn)了干細(xì)胞的歸巢。然而，遷移后的干細(xì)胞成骨分化后，其遷移能力將會(huì)降低。這種現(xiàn)象可能與細(xì)胞外基質(zhì)的沉積及基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌使SDF-1失活有關(guān)。相關(guān)激素的運(yùn)用也能夠促進(jìn)干細(xì)胞的遷移，但該方面的研究較少，其機(jī)制尚不明確。

3 補(bǔ)腎法促干細(xì)胞歸巢

先天之精具有干細(xì)胞的屬性。干細(xì)胞是腎精在分子水平的表現(xiàn)形式[16]。先天之精不足導(dǎo)致干細(xì)胞的“陽化氣”功能受損，使干細(xì)胞歸巢能力減弱，進(jìn)而影響“陰成形”功能。補(bǔ)腎法可補(bǔ)充腎精并激發(fā)機(jī)體“陽化氣”功能促進(jìn)干細(xì)胞歸巢，進(jìn)而促進(jìn)干細(xì)胞“陰成形”的成骨功能，恢復(fù)丟失骨量，從而治療OP。當(dāng)人體處于疾病狀態(tài)，干細(xì)胞的“陽化氣”功能降低，自身的干細(xì)胞無法滿足促進(jìn)損傷組織修復(fù)的需求，需要進(jìn)行外源性干細(xì)胞注射，但其歸巢效率低[17]，需要通過補(bǔ)腎法激發(fā)干細(xì)胞“陽化氣”功能改善歸巢效率。補(bǔ)腎法可通過激發(fā)內(nèi)外源性干細(xì)胞的“陽化氣”功能促進(jìn)干細(xì)胞的歸巢。

3.1 補(bǔ)腎法促內(nèi)源性干細(xì)胞歸巢

3.1.1補(bǔ)腎中藥促內(nèi)源性干細(xì)胞歸巢：大量研究證實(shí)補(bǔ)腎中藥在促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞歸巢中發(fā)揮著重要作用，且主要與生長(zhǎng)因子及干細(xì)胞表面受體的表達(dá)相關(guān)。具有補(bǔ)腎功效的中藥牛膝提取物杯莧甾酮能夠上調(diào)干細(xì)胞CXCR4的表達(dá)，進(jìn)而激發(fā)大鼠BMSCs體外遷移[18]。補(bǔ)腎中藥淫羊藿提取物淫羊藿苷也具有促進(jìn)MSC遷移的能力，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)運(yùn)用CXCR4的拮抗劑AMD3100處理后，這種遷移能力被阻斷[19]。此外，補(bǔ)腎中藥熟地提取物[20]、骨碎補(bǔ)總黃酮[21]、骨碎補(bǔ)柚皮苷[22]均能夠上調(diào)SDF-1/CXCR4的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)干細(xì)胞的遷移。趙志虎等[22]的研究進(jìn)一步表明，骨碎補(bǔ)柚皮苷促進(jìn)MSC遷移的能力可能通過SDF-1α/CXCR4/PI3K/Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。以上結(jié)果證實(shí)了補(bǔ)腎中藥可促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞的遷移，而這種能力與SDF-1/CXCR4軸密切相關(guān)。

3.1.2補(bǔ)腎方劑促內(nèi)源性干細(xì)胞歸巢：內(nèi)源性干細(xì)胞歸巢能力減弱是引起OP的重要因素。補(bǔ)腎方劑在促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞歸巢、抗骨質(zhì)疏松中發(fā)揮著重要作用。王華偉等[23]的研究表明，補(bǔ)腎化瘀生新方可能通過促進(jìn)BMSCs歸巢參與了組織的修復(fù)。此外，補(bǔ)腎益精方[24]、補(bǔ)腎活血湯含藥血清[25-26]均被證實(shí)能夠啟動(dòng)SDF-1/CXCR-4信號(hào)軸促進(jìn)BMCs的遷移。

研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血湯促進(jìn)BMSCs的能力與單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和趨化因子受體-2(CC chemokine receptor 2，CCR2)相關(guān)[27]。吳志方等[28-29]的研究表明，補(bǔ)腎活血湯4種有效提取物(石油醚部位、乙酸乙酯部位、乙醇部位和水提物)均能促進(jìn)大鼠BMSCs體外遷移，這種促進(jìn)遷移的能力可能與MCP-1/CCR2上調(diào)Wnt5a的表達(dá)有關(guān)。黃永銓等[30]的研究也表明，補(bǔ)腎活血湯的促M(fèi)SCs體外遷移能力可能與MSCs表面的受體CCR2相關(guān)。此外，蔡炎等[30]的研究則表明，這4種提取物在具備各自最佳濃度時(shí)均可成為活性部位，且可能通過BMSCs表面相關(guān)受體人胰島素樣生長(zhǎng)因子2受體提升遷移能力。石油醚部位提取物還可能通過下調(diào)miR-539及靶向Wnt5a信號(hào)通路促進(jìn)MSCs遷移[31]。錢偉宏等[32]的研究表明，補(bǔ)腎活血湯還可能通過CXCL13/CXCR5信號(hào)軸及SDF-1/CXCR4信號(hào)軸參與了BMSCs遷移的促進(jìn)。

溫陽補(bǔ)腎方在促干細(xì)胞歸巢、抗OP中也發(fā)揮著重要作用。血小板衍生生長(zhǎng)因子(platele derived growth factor，PDGF)已被證實(shí)可促進(jìn)內(nèi)源性MSC遷移[33]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，將VCAM-1抗體與小鼠MSC表面結(jié)合能促進(jìn)MSC向骨髓的歸巢。吳多藝等[34]、羅賢紅等[35]分別對(duì)146例、60例骨質(zhì)疏松骨折恢復(fù)期患者隨機(jī)分組，運(yùn)用中醫(yī)溫陽補(bǔ)腎方治療3個(gè)月、1個(gè)月后均發(fā)現(xiàn)，患者的血清骨鈣素、PDGF與類胰島素一號(hào)生長(zhǎng)因子顯著升高，血清VCAM-1降低，骨密度增加，提示溫陽補(bǔ)腎方可促內(nèi)源性干細(xì)胞歸巢，從而促成骨，提高骨密度，且與PDGF、VCAM-1密切相關(guān)。

此外，“補(bǔ)腎活血舒筋方”也具有促進(jìn)BMSCs遷移的能力，且可能與NF-κB、CXCR4有關(guān)[36]。補(bǔ)髓生血顆粒也能夠促進(jìn)細(xì)胞的遷移，這可能與調(diào)控Src/PLC/IP3通路及調(diào)控異常Ca2+[37]或調(diào)控FAK/PI3K通路及Rho GTP酶有關(guān)[38]；也可能與調(diào)節(jié)VLA-4和VLA-5 mRNA相關(guān)[39]。

以上大量的研究證實(shí)了補(bǔ)腎中藥及補(bǔ)腎方劑能夠通過調(diào)節(jié)干細(xì)胞歸巢的各個(gè)階段促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞的歸巢。

3.2 補(bǔ)腎法促外源性干細(xì)胞歸巢

OP患者處于疾病狀態(tài)，內(nèi)源性干細(xì)胞功能不足或缺乏，因此，外源性移植是較好的治療策略[17]。補(bǔ)腎法在促外源性干細(xì)胞歸巢中發(fā)揮著重要作用，徐志明等[40]等運(yùn)用補(bǔ)腎活血湯聯(lián)合靜脈注射PKH26標(biāo)記的BMSCs發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血湯促進(jìn)移植后的外源性BMSCs向大鼠骨折斷端遷移。筆者的前期研究[41]運(yùn)用補(bǔ)腎中藥龜板灌胃聯(lián)合靜脈注射BrdU標(biāo)記的BMSCs發(fā)現(xiàn)，龜板顯著促進(jìn)了外源性BMSCs歸巢，減少了椎體骨量的丟失，對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松起到了有效預(yù)防作用。以上研究提示補(bǔ)腎法能夠有效促進(jìn)外源性干細(xì)胞的歸巢。

綜上，補(bǔ)腎法能夠促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞及外源性干細(xì)胞的歸巢，更好發(fā)揮出干細(xì)胞的治療作用。

3.3 補(bǔ)腎法促干細(xì)胞歸巢抗OP的機(jī)理

《類經(jīng)》云：“陽動(dòng)而散，故化氣，陰靜而凝，故成形?！备杉?xì)胞的歸巢與“陽化氣”有著密切的聯(lián)系，補(bǔ)腎法促干細(xì)胞歸巢治療OP的關(guān)鍵在于“補(bǔ)腎陽”，增強(qiáng)“陽化氣”的功能，使得“陽生陰長(zhǎng)”，增加骨量抗OP。

“補(bǔ)腎”在促干細(xì)胞遷移中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。李杰斌等[42]研究證實(shí)，補(bǔ)腎益精方左歸丸能夠調(diào)控衰老大鼠BMSCs歸巢，且檢測(cè)到干細(xì)胞生長(zhǎng)因子分泌的增加。補(bǔ)腎法能夠通過調(diào)控SDF-1/CXCR4軸改善骨的損傷，Lien等[43]將表達(dá)CXCR4的MSCs分別經(jīng)髓內(nèi)和尾靜脈注射入免疫活性C3H/HeN小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)，其歸巢率和骨量保留率較高，提示補(bǔ)腎法可促進(jìn)MSCs歸巢抗免疫保留骨量。此外，小劑量BMP-2和SDF-1α聯(lián)合應(yīng)用可增加損傷部位原代MSCs募集來促進(jìn)骨愈合[44]。而將CXCR4和一種成骨分化調(diào)節(jié)的主轉(zhuǎn)錄因子核心結(jié)合因子——核結(jié)合因子α1共轉(zhuǎn)染在BMSCs上，也增強(qiáng)了BMSCs對(duì)OP的治療作用[43]。SDF-1/CXCR4在啟動(dòng)成骨過程中起著重要作用[45]，而成骨分化途徑啟動(dòng)后，SDF-1/CXCR4軸將不再需要[10]。這些結(jié)果表明，補(bǔ)腎法通過SDF-1/CXCR4軸促進(jìn)了MSCs的歸巢，且參與了成骨。但歸巢的MSCs在分化過程中并不同步[46]，可能是因?yàn)樵谥委煹牟煌A段遷移到缺陷部位，從而處于不同的分化階段。汪偉等[15]的研究進(jìn)一步表明CXCL12基因轉(zhuǎn)染可在早期促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞分化，而在MSCs向成骨細(xì)胞分化的中后期無明顯影響。李汪洋等[47]的研究則表明補(bǔ)腎活血湯在骨折不同時(shí)期發(fā)揮的促遷移作用趨勢(shì)并不一致，早期和晚期分別以低濃度、高濃度作用明顯促進(jìn)，而中期則是抑制，這種趨勢(shì)不一致與CCL12/CXCR4的表達(dá)有著密切關(guān)系。這些結(jié)果表明促進(jìn)遷移后，干細(xì)胞將進(jìn)行成骨的相關(guān)表達(dá)，在短期降低遷移，而后增加補(bǔ)腎力度可再次促進(jìn)干細(xì)胞的歸巢。

Sui等[14]將綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCGFP)注射到小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)BMSCGFP輸注以部分凋亡為代價(jià)阻止了內(nèi)源骨髓細(xì)胞凋亡，且BMSCGFP的凋亡率小于30%，其余大部分BMSCGFP仍能繼續(xù)發(fā)揮作用，且在4周后歸巢定居后的大約40%的BMSCGFP接受成骨分化為Osx+成骨細(xì)胞祖細(xì)胞，提示補(bǔ)腎法可能促M(fèi)SCs歸巢抗凋亡促進(jìn)成骨的作用。

以上的補(bǔ)腎中藥及方劑均能在一定程度具有溫補(bǔ)腎陽的作用。綜上，SDF-1/CXCR4信號(hào)軸促進(jìn)干細(xì)胞遷移能力與補(bǔ)腎法中的“陽化氣”功能具有較多相似的內(nèi)涵，是補(bǔ)腎法“陽化氣”功能在分子水平的表現(xiàn)形式。因此，本研究認(rèn)為補(bǔ)腎法能夠通過激發(fā)干細(xì)胞“陽化氣”的功能激活SDF-1/CXCR4信號(hào)軸促進(jìn)MSCs的歸巢，并可能通過參與抗免疫、抗凋亡或直接成骨分化防治OP。

4 小結(jié)及展望

干細(xì)胞治療是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)，干細(xì)胞具有“腎精”屬性。補(bǔ)腎法能夠激發(fā)干細(xì)胞“陽化氣”的功能激活SDF-1/CXCR4軸，促進(jìn)干細(xì)胞歸巢防治OP。歸巢后的干細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)骨免疫、抗凋亡等途徑為具有“陰成形”特征的骨形成創(chuàng)造有利環(huán)境或成骨分化直接參與成骨抗OP。以往的研究表明了補(bǔ)腎法在促干細(xì)胞歸巢中的重要作用，但依舊有許多問題有待解決。如：(1)MSCs的骨歸巢仍未有公認(rèn)遷移分子且歸巢機(jī)制不明；(2)MSCs移植后的“肺首過效應(yīng)”“血液清除”效應(yīng)難以避免，降低了歸巢效率；(3)補(bǔ)腎中藥成分眾多，有效成分提取及鑒定存在困難；(4)MSC歸巢過程及歸巢后行為機(jī)制尚不完全明確；(5)MSCs遷移能力與成骨分化的相互作用機(jī)制研究較少；(6)內(nèi)分泌、旁分泌效應(yīng)如何影響干細(xì)胞歸巢研究較少。

針對(duì)這些問題，通過補(bǔ)腎法促進(jìn)MSCs歸巢促進(jìn)骨再生研究的前景包括：(1)構(gòu)建熒光標(biāo)記MSC，利用成像系統(tǒng)實(shí)時(shí)觀察MSC在體內(nèi)的遷移，為MSC在體內(nèi)的遷移提供直接證據(jù)并尋找遷移因子；(2)探索“肺首過效應(yīng)”及“血液清除”的機(jī)制，為提高干細(xì)胞歸巢效率提供參考；(3)進(jìn)一步開展中藥有效物質(zhì)提取及鑒定的研究；(4)結(jié)合當(dāng)下MSCs內(nèi)分泌、旁分泌研究熱點(diǎn)進(jìn)一步探討MSCs的歸巢及歸巢后成骨分化機(jī)制；(5)進(jìn)一步發(fā)掘和完善干細(xì)胞歸巢的中醫(yī)理論基礎(chǔ)。