肖志堅(jiān)

0 引言

造血的克隆證據(jù)是骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes,MDS）診斷的必備標(biāo)準(zhǔn)之一[1-3]，隨著二代測(cè)序（next-generation sequencing,NGS）檢測(cè)基因突變的方法學(xué)和相關(guān)指南[4-6]的推出，最新的國(guó)際、國(guó)內(nèi)MDS指南[7-10]均已將NGS檢測(cè)基因突變列入疑似MDS患者的診斷程序。此外，近年基因突變?cè)贛DS的預(yù)后判斷、治療策略制定、造血干細(xì)胞移植供體選擇等方面也相繼形成了一些共識(shí)。本文就NGS檢測(cè)基因突變?cè)贛DS的應(yīng)用現(xiàn)況和存在的問題談?wù)劰P者的個(gè)人認(rèn)識(shí)。

1 NGS在MDS診斷中的應(yīng)用現(xiàn)況

從正常的多克隆造血到單克隆造血，再從單純的單克隆造血到臨床可確診的MDS是一個(gè)逐步演變的過程。此前，那些疑似MDS但尚未達(dá)“MDS最低診斷標(biāo)準(zhǔn)”[11]的患者是臨床診斷的一個(gè)“灰區(qū)”，隨著NGS在臨床中的應(yīng)用，相繼提出了一系列MDS前驅(qū)性疾病[12]，使這一問題得到了基本解決。

對(duì)正常人群NGS篩查發(fā)現(xiàn)，正常人群，特別是40歲以上人群，隨著年齡的增長(zhǎng)血液腫瘤相關(guān)基因突變的檢出率也逐漸增高，這種疾病狀態(tài)被界定為“潛質(zhì)未定的克隆性造血（CHIP）[11-12]”：（1）無血液腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)證據(jù)；（2）不符合陣發(fā)性血紅蛋白尿癥（PNH）、意義未定的單克隆丙種球蛋白血癥（MUGS）和單克隆B淋巴細(xì)胞增多癥（MBL）的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（3）存在血液腫瘤相關(guān)基因突變陽性（VAF≥2.0%）；（4）每年約有0.5%～1%的概率進(jìn)展為腫瘤。CHIP中那些存在血液腫瘤相關(guān)基因突變陽性且VAF＜2.0%則稱之為衰老相關(guān)性克隆性造血（ARCH），而又有人將那些血液腫瘤相關(guān)基因突變?yōu)橐炎C實(shí)為疾病起始基因（如JAK2、CALR、MPL、KIT、NPM1和TP53等）的人群列為高度致癌潛能的克隆性造血（CHOP）。隨后研究發(fā)現(xiàn)CHIP人群由于易發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化，從而導(dǎo)致心血管疾病發(fā)病率增高，如果在CHIP基礎(chǔ)上患有腫瘤需要進(jìn)行放、化療，其治療相關(guān)性髓系腫瘤的發(fā)生率會(huì)顯著增高，此外，已有關(guān)于CHIP造血干細(xì)胞移植（HSCT）供體來源的白血病HSCT后“復(fù)發(fā)”的個(gè)案報(bào)道。基于醫(yī)學(xué)倫理學(xué)和衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)原則，除了以排查CHIP為目的外，不要盲目地去做相關(guān)基因突變檢測(cè)，由于其他原因診斷為CHIP后，每年應(yīng)監(jiān)測(cè)兩次血常規(guī)和骨髓。一旦出現(xiàn)不能解釋的血細(xì)胞減少則應(yīng)進(jìn)行骨髓和基因突變檢測(cè)。

那些符合“意義未定的特發(fā)性血細(xì)胞減少（ICUS）”診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者如果檢出血液腫瘤相關(guān)基因突變則稱之為“意義未定的克隆性血細(xì)胞減少癥（CCUS）”[11-12]，建議診斷標(biāo)準(zhǔn)為：（1）髓系細(xì)胞中一系或多系血細(xì)胞減少，且持續(xù)時(shí)間≥6月：紅細(xì)胞（HGB＜110 g/L）；中性粒細(xì)胞（ANC＜1.5×109/L）和（或）巨核細(xì)胞系（PLT＜100×109/L）；（2）骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)不夠MDS發(fā)育異常最低診斷標(biāo)準(zhǔn)（紅系、粒系和巨核細(xì)胞系發(fā)育異常細(xì)胞均＜10%），且無MDS特征性細(xì)胞遺傳學(xué)異常；（3）存在髓系腫瘤相關(guān)基因突變陽性（VAF≥2.0%）或非重現(xiàn)性血液腫瘤染色體異常；（4）排除可作為初始原因?qū)е卵?xì)胞減少/發(fā)育異常的其他所有造血組織或非造血組織的疾病。CCUS患者髓系腫瘤相關(guān)基因突變VAF通常≥10.0%，也有研究者提出VAF≥20.0%才能診斷CCUS。CCUS人群應(yīng)至少每3～6月監(jiān)測(cè)一次外周血和骨髓，每年檢測(cè)一次基因突變以了解突變負(fù)荷和突變克隆演變情況。無臨床癥狀者僅做隨訪觀察即可，有臨床癥狀者按低危MDS患者處理原則治療。

盡管在MDS患者中發(fā)現(xiàn)受累基因達(dá)40～60個(gè)之多，但一個(gè)基因突變是否可以作為診斷和分型診斷的分子標(biāo)志必須同時(shí)滿足特異性和敏感度高這兩點(diǎn)，因此，基因突變極少用于MDS的分型診斷。WHO 2016版的MDS診斷標(biāo)準(zhǔn)首次將基因突變引入MDS的分型診斷，修訂了MDS伴環(huán)狀鐵粒幼紅細(xì)胞的診斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于骨髓環(huán)狀鐵粒幼紅細(xì)胞≥5%～＜15%的患者，如其存在SF3B1基因突變，也歸于此亞型。近期，又提出了首個(gè)基于基因突變的MDS亞型—MDS伴SF3B1突變（MDS with mutated SF3B1）[13]，建議診斷標(biāo)準(zhǔn)為：（1）按標(biāo)準(zhǔn)血液學(xué)值界定的血細(xì)胞計(jì)數(shù)減少；（2）SF3B1體細(xì)胞突變；（3）單純紅系或多系發(fā)育異常；（4）骨髓原始細(xì)胞＜5%，且外周血原始細(xì)胞＜1%；（5）不符合MDS伴單純del(5q)、MDS/MPN-RS-T或其他MDS/MPN、原發(fā)性骨髓纖維化或其他骨髓增殖性腫瘤的WHO（2016）診斷標(biāo)準(zhǔn)；（6）正常核型或除del（5q）、-7、inv（3）或3q26異常和復(fù)雜染色體（≥3）以外的任何其他染色體異常；（7）除RUNX1和EZH2以外的任何其他體細(xì)胞性基因突變。

2 NGS在MDS治療策略制定的應(yīng)用現(xiàn)況

原發(fā)性MDS中TP53基因的突變率為5%～10%，關(guān)于TP53突變與MDS患者治療方案選擇和調(diào)整已取得了以下共識(shí)：（1）來那度胺被推薦為5q-綜合征患者的首選藥物，已有研究證實(shí)TP53突變和（或）用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)骨髓細(xì)胞高表達(dá)p53蛋白是5q-綜合征患者來那度胺治療無效或治療后失效的分子基礎(chǔ)。因此，初診時(shí)有TP53突變和（或）用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)骨髓細(xì)胞p53蛋白高表達(dá)的5q-綜合征患者不應(yīng)再將來那度胺作為首選治療。此外，那些選擇來那度胺治療的患者，在治療過程中也應(yīng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)TP53突變和p53蛋白表達(dá)水平，一旦出現(xiàn)TP53突變和p53蛋白高表達(dá)則應(yīng)及時(shí)調(diào)整治療方案[7-10]；（2）伴TP53突變的MDS預(yù)后很差，因此常將造血干細(xì)胞移植（HSCT）推薦為首選治療，但現(xiàn)有研究證實(shí)只有不伴有復(fù)雜染色體核型異常的TP53基因突變或者只有單等位基因突變（或缺失）的患者接受HSCT才有獲益，新近指南推薦雙等位基因突變（缺失）和伴復(fù)雜染色體核型異常的TP53基因突變（缺失）患者不再考慮選擇HSCT，而應(yīng)選擇參加臨床試驗(yàn)[8,14]；（3）一項(xiàng)采用地西他濱十天方案（20 mg/（m2·d））治療急性髓系白血?。ˋML）和高危MDS的研究發(fā)現(xiàn)TP53突變患者的完全緩解率顯著高于無此突變患者，對(duì)突變的系列監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示地西他濱能選擇性清除TP53突變[15]，提示地西他濱可作為有TP53基因突變患者的移植前橋接治療的首選藥物。

TP53基因以外的其他基因突變?cè)贛DS治療選擇和療效預(yù)測(cè)方面僅有一些初步結(jié)果：（1）甲基化調(diào)控基因突變是MDS最常見的基因突變類型，一項(xiàng)92例接受阿扎胞苷和地西他濱治療的回顧性研究[16]發(fā)現(xiàn)治療前血小板計(jì)數(shù)（≥100×109/L為0分；＜100×109/L為1分）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（＜3.0×109/L為0分；≥3.0×109/L為1分）和TET2/DNMT3a基因突變（TET2和（或）DNMT3a突變?yōu)?分；二者均為野生型為1分）為影響療效的獨(dú)立因素，最后積分0～1分、2分和3分組患者的療效分別為43%、23%和0。TET2和DNMT3a突變檢測(cè)可望為臨床選擇去甲基化藥物治療提供幫助；（2）Luspatercept是針對(duì)TGFβ信號(hào)途徑的一個(gè)新藥，Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明SF3B1突變陽性患者紅系改善（HI-E）為60%，而SF3B1突變陰性患者僅為11%，Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果也表明SF3B1突變陽性患者療效顯著好于陰性患者，SF3B1突變可以作為L(zhǎng)uspatercept的療效預(yù)測(cè)標(biāo)志之一[17]；（3）近年來，一些分子靶向藥物，如bcl2抑制劑Venetoclax、TP53靶向藥APR-246、RAS信號(hào)通路靶向藥Rigosertib和IDH1/2靶向治療藥物Olutasidenib(FT-2101)，NEDD8抑制劑Pevonidistat、抗TIM3單克隆抗體MBG453、抗CD47單克隆抗體Magrolimab等臨床試驗(yàn)相繼開展，特別是近期開展的前述藥物與去甲基化藥物（HMA）聯(lián)合（即所謂的“HMA+X”方案）的Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗(yàn)已有初步結(jié)果表明聯(lián)合方案與去甲化藥物單藥方案相比，總體有效率和完全緩解率顯著提高。新近一項(xiàng)前瞻性研究證實(shí)19%的MDS患者依據(jù)基因突變檢測(cè)結(jié)果調(diào)整了治療方案；（4）我們最近研究提示U2AF1基因突變是影響接受免疫抑制劑治療療效的一個(gè)不良因素[18]，來那度胺可作為伴DDX41突變患者的一個(gè)治療選擇[19-20]；（5）是否所有HSCT供體都需要進(jìn)行NGS基因突變篩查尚有爭(zhēng)議。

3 問題與展望

NGS從實(shí)驗(yàn)室走向臨床，開啟了MDS的精準(zhǔn)診斷和個(gè)體化治療的新時(shí)代。盡管在該領(lǐng)域已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但現(xiàn)階段依然存在以下主要問題：（1）MDS的基因突變譜系得以解析，但對(duì)大部分基因突變?cè)贛DS發(fā)生、發(fā)展、演變中的具體分子作用機(jī)制尚知之甚少，從而阻礙了其在臨床實(shí)踐中的具體應(yīng)用；（2）基因突變?cè)贛DS療效預(yù)測(cè)和預(yù)后判斷的結(jié)果大都基于單中心、回顧性、小系列研究得出，有待多中心、前瞻性、大系列研究來加以確證；（3）針對(duì)基因異常的分子靶向藥物大都處于Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段，其最終臨床療效改善程度有待Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果來加以確證；（4）疑似MDS患者NGS需要檢測(cè)的基因究竟需要包括哪些基因、是否所有患者都需要同時(shí)采取口腔黏膜、指甲、毛囊等正常組織作對(duì)照以除外胚系突變也未取得共識(shí)；（5）在我國(guó)進(jìn)行NGS的實(shí)驗(yàn)室的室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)控亟待加強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果報(bào)告格式及結(jié)果解釋也有待規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化，以保證檢測(cè)結(jié)果的可互認(rèn)性[21]。

近年，依據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)和基因突變相繼提出了一些血液系統(tǒng)惡性疾病的組學(xué)分型（genomic classification），與現(xiàn)有以細(xì)胞學(xué)為骨架的診斷分型系統(tǒng)相比，更能反映出腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征，但由于不同人種的遺傳背景、生活環(huán)境、生活習(xí)慣等不同，同一種疾病的遺傳學(xué)和基因突變譜系也不盡相同，依據(jù)某一人種提出的組學(xué)分型系統(tǒng)不完全適合另一人種人群[22]。隨著單細(xì)胞技術(shù)的日臻改進(jìn)和完善，基于單細(xì)胞的基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀遺傳組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析定將會(huì)走向臨床，已有研究結(jié)果表明單細(xì)胞組學(xué)能更精細(xì)地解析惡性克隆的結(jié)構(gòu)及其演變，識(shí)辨和解析治療后殘留惡性克隆的特征，可更精準(zhǔn)指導(dǎo)臨床針對(duì)性施治[23]。未來，空間組學(xué)和整合單細(xì)胞分析有望開拓真正精準(zhǔn)醫(yī)療新時(shí)代。