王素梅，張健東，劉樹業(yè) (1.天津市第三中心醫(yī)院檢驗科，天津 300170；2.天津市人工細胞重點實驗室，天津 300170；3.衛(wèi)生部人工細胞工程技術(shù)研究中心，天津 300170)

目前全球感染性疾病現(xiàn)狀嚴峻，但感染病原體大多仍不明確，病原體的快速測定對臨床醫(yī)師指導臨床用藥非常重要。然而，目前的診斷方法在許多方面都是有限的，如檢測范圍、耗時、特異性和靈敏度。傳統(tǒng)病原檢測方法包括微生物培養(yǎng)、鏡檢、抗原/抗體的免疫學方法、鑒定、藥敏在感染控制中發(fā)揮著重要作用。檢測病原體特異核酸序列的 PCR方法和基因分型方法等，已經(jīng)無法滿足對病原譜全面檢測的需要。

隨著基因測序技術(shù)的不斷發(fā)展，二代測序亦被稱為下一代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)技術(shù)也逐步成長為主流的測序技術(shù)，該技術(shù)發(fā)展迅猛，通量高、速度快、成本低。NGS 不需要靶特異性引物，在單次序列測定中可確定菌株基因組完整的DNA序列,可用于所有病原體的鑒定和分型。因此，該技術(shù)可在醫(yī)學微生物實驗室和感染控制中發(fā)揮巨大作用[1-2]。

1 NGS簡介

NGS即高通量測序技術(shù)，在基于序列的基因組研究和新型生物學應(yīng)用方面逐步推進，有望以前所未有的速度對DNA進行測序。與傳統(tǒng)的測序方法相比，這些新的非基于Sanger的技術(shù)具有通量高，測序速度快，運行成本低和準確性高等優(yōu)勢。核心思想是邊合成邊測序(Sequencing by Synthesis)，即通過捕捉新合成末端的標記來確定DNA的序列。其特點是能一次并行幾十萬到幾百萬條DNA分子的序列測定，且一般讀長較短。在極大降低了測序成本的同時還極大提高了測序效率，是目前病原微生物研究領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的測序手段。NGS無需克隆這一繁瑣的過程，而是將連接通用接頭的基因組DNA 片段進行高通量的并行PCR、測序反應(yīng)，所獲得的大量測序數(shù)據(jù)經(jīng)高效能的計算機生物信息分析技術(shù)分析即可獲得完整的 DNA 序列信息[3]?，F(xiàn)有比較成熟的NGS平臺主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system[4]。

1.1Roche/454 FLX：Roche/454 FLX是采用焦磷酸測序原理的測序技術(shù)，T、A、C、G，4 種堿基按順序依次循環(huán)進入 PTP(Pico Titer Plate)反應(yīng)板，當堿基配對同時釋放一個焦磷酸。在雙磷酸酶，熒光素酶，DNA聚合酶和ATP硫酸化酶的協(xié)同作用下，經(jīng)過相關(guān)反應(yīng)，熒光素被氧化成氧化熒光素，并釋放出光信號，每延伸1個或若干個堿基，就會發(fā)出一次光信號，GS FLX系統(tǒng)將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號釋放偶聯(lián)起來。通過檢測熒光信號釋放的有無和強度，就可以達到實時測定DNA序列的目的。454技術(shù)最大的優(yōu)勢在于讀取長度大，重復序列少，當前454技術(shù)的平均讀長可達400bp，它最主要的一個缺點通量較低，成本相對較高，無法準確測量同聚物的長度。適用于從頭測序和宏基因組測序，序列拼裝和獲得新基因。

1.2Illumina/Solexa：Illumina/Solexa測序的核心思想是“邊合成邊測序”(seqencing-by synthesis，SBS)的方法。在堿基延伸過程中形成正確的堿基互補，體系中同時添加改造過的DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標記的4種dNTP。基因組 DNA 片段綁定到芯片上(即 Flow cell)，這些 DNA片段經(jīng)過延伸和橋式PCR反應(yīng)后，將每一個DNA片段擴大百萬倍，形成一個序列單一的Cluster。每個 Cluster 是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。利用帶熒光基團的四種特殊脫氧核糖核苷酸在堿基延伸過程中對核酸片段進行高通量、快速的檢測。Solexa 測序技術(shù)最大的優(yōu)勢在于高通量、低錯誤率、低成本、應(yīng)用范圍廣，它最主要的缺點是讀長較短給從頭測序拼接帶來困難，適用于RNA 測序和表觀遺傳學研究。

1.3ABI SOLID 技術(shù)：ABI SOLID測序沒有采用常用的DNA聚合酶，而是 ABI 公司使用的基于磁珠的大規(guī)模并行連接測序平臺，連接反應(yīng)的底物是熒光標記的8堿基單鏈DNA探針。其3′端 的1-5 位是隨機堿基，且 1、2 位構(gòu)成的堿基對可以表征探針的熒光類型，6～8位是能夠隨意配對的人工合成的特殊堿基，5′端為熒光基團。連接反應(yīng)中，這些探針與單鏈 DNA 模板鏈配對，發(fā)出不同的熒光信號，從而讀取到堿基排列順序。這樣經(jīng)過 5 輪測序反應(yīng)后便可以得到所有的堿基序列。SOLID測序具有高通量，高準確度，易區(qū)分 SNP和測序錯誤等優(yōu)勢，原始測序準確性高達99.94%，可以說是目前第二代測序技術(shù)中準確性最高的了。它最主要的缺點也是讀長較短給從頭測序拼接帶來困難，使用于高 GC 含量的樣品，基因組重測序和SNP 檢測。

2 NGS在感染性疾病中的應(yīng)用

近年來，全球感染性疾病層出不窮，一方面疑難病原菌不斷增多，另一方面?zhèn)魅静〉膫鞑ニ俣让黠@加快。直接從臨床標本中檢測核酸序列為病原菌的監(jiān)測和發(fā)現(xiàn)提供了新的機會。分子技術(shù)已成功應(yīng)用于博爾納病病毒、丙型肝炎病毒、辛諾柏病毒、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒(人類皰疹病毒8型)、巴爾通體、滋養(yǎng)層皰疹病毒、西尼羅河病毒以及與嚴重急性冠狀病毒相關(guān)的傳染源的鑒定[5-7]。感染性疾病威脅著人類的健康，因此對感染性疾病的快速診斷提出了更高的要求。NGS技術(shù)在感染性疾病的快速檢測、追蹤溯源中發(fā)揮了越來越重要的作用。

2.1NGS在神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中的應(yīng)用：中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染是神經(jīng)科常見疾病之一，常為疑難重癥，神經(jīng)感染性疾病確診的依據(jù)在于從腦實質(zhì)或腦脊液內(nèi)檢測到病原生物的存在，但受目前臨床實驗室檢測手段的限制，超過一半的腦炎和腦膜炎病例無法明確診斷。目前臨床常用的病原體檢測方法包括腦脊液細胞學、病原體特殊染色與形態(tài)學鑒定、細菌與真菌培養(yǎng)、病原體核酸檢測等，主要針對特定種類的病原體進行有選擇性的檢測，而二代測序技術(shù)則旨在通過宏基因組分析，達到無偏倚的“全病原體”篩查[8-10]。Wilson MR等報道[11]了一名14歲的嚴重聯(lián)合免疫缺陷男孩在為期4個月的時間內(nèi)，三次出現(xiàn)發(fā)燒和頭痛，進而發(fā)展為腦積水、癲癇狀態(tài)和昏迷。包括腦活檢在內(nèi)的檢查均未明確其致病病原體。二代腦脊液測序發(fā)現(xiàn)3063784序列中有475個與鉤端螺旋體感染相對應(yīng)(0.016%)。給予針對性的青霉素治療，患者在32天后出院回家。Piantadosi 等報道[12]了一例61歲男子因雙側(cè)頭痛、步態(tài)不穩(wěn)、嗜睡和精神錯亂入院。入院第11天CSF中快速宏基因組測序檢測到Powassan病毒。比標準血清學測試早4周。結(jié)果顯示了宏基因組測序的極高靈敏度，這對于監(jiān)測新出現(xiàn)和未充分研究的病原體至關(guān)重要。2018年，由北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)科關(guān)鴻志教授牽頭的多中心腦炎協(xié)作組，對疑似感染性腦炎而病因未明者行腦脊液NGS，結(jié)果2例檢測出偽狂犬病毒( pseudorabies virus ，PRV )[13]，NGS可以發(fā)現(xiàn)以往未知的病毒性腦炎類型。多個高質(zhì)量的個案報道和臨床研究已經(jīng)表明，NGS 有潛力成為神經(jīng)感染性疾病的診斷工具，有學者[14]建議將NGS 作為腦炎病原學診斷的常規(guī)方法開展。

2.2NGS在呼吸道感染性疾病中的應(yīng)用：NGS具有獨特的潛力，可以克服診斷和檢測方面的挑戰(zhàn)，并且可以顯著提高我們檢測和診斷病原體感染的能力。隨著NGS方法成本的下降，基因組測序和生物信息學的最新進展使得該技術(shù)在常規(guī)診斷環(huán)境中得以應(yīng)用，當金標準技術(shù)未能檢測到推定的病原體時，NGS技術(shù)為我們提供了前所未有的機會。近年來，新發(fā)突發(fā)病原體造成的傳染病疫情給公共衛(wèi)生防控帶來了嚴峻挑戰(zhàn)?？焖贉蚀_識別致病病原對制定疫情防控策略至關(guān)重要。在呼吸道感染中，NGS已用于多種呼吸道標本檢測，包括痰、咽拭子、肺泡灌洗液等，并表現(xiàn)出良好的診斷性能。Fischer 等收集了24個呼吸道樣本(支氣管肺泡灌洗液、痰樣本和拭子)和來自肺炎患者的5個支氣管肺泡灌洗液[15]。與實時定量PCR檢測流感病毒序列相比，在24個樣本中，有18個樣本中檢測到了流感病毒序列。從8個樣本中可以獲得完整的流感病毒基因組。此外，在24個流感陽性樣本中的3個樣本中，可以檢測到額外的病毒病原體，24個樣本中的2個樣本顯示，已知在流感病毒感染期間引起重疊感染的個體細菌物種數(shù)量顯著增加。因此，NGS對已知或疑似流感患者的呼吸道樣本的分析提供了與臨床研究相關(guān)的有價值信息。Fisher等報道[16]了德國一名警察由于ARDS被送到急診室，患者接受了機械通氣，通常引起肺炎的病原體的所有診斷檢測結(jié)果均為陰性，雖然立即啟動抗菌藥物治療，患者在多器官功能衰竭后6天死亡。當?shù)诙煲駻RDS被送往同一急診室，醫(yī)生提取支氣管肺泡灌洗(BAL)標本中的RNA，50 h 內(nèi)測序檢測出鸚鵡熱衣原體，經(jīng)過11天的抗菌藥物治療后，患者2的情況有所改善，患者被轉(zhuǎn)移到綜合醫(yī)院病房。因此，快速、特異且高通量的病原體檢測方法，對有效診斷和及時防治感染性疾病具有重要的意義。

2.3NGS在器官移植相關(guān)感染中的應(yīng)用：器官移植是器官衰竭終末患者的重要治療方法，然而用來預防排斥反應(yīng)的藥物抑制免疫系統(tǒng)，導致移植受者常常有較高的感染風險。NGS能夠確定感染患者的致病病原。Ye 等報道[17]了一名2 歲男孩，為粒細胞白血病患者在進行造血干細胞移植后，出現(xiàn)黑色皮疹、高熱等癥狀。使用分離培養(yǎng)和 PCR 檢測可疑病原均為陰性，一些常規(guī)的抗菌藥物治療無效，包括萬古霉素、美羅培南、妥布霉素、頭孢吡肟和利福平。在這種情況下，兒科醫(yī)生借助下一代測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)潛在的病原體痤瘡丙酸桿菌，從而指導他們對病原菌使用特定的藥物，患者迅速好轉(zhuǎn)。Palacios 等報道[18]了三名患者在同一天接受了來自同一個捐贈者的內(nèi)臟器官移植，在移植后4至6周死于發(fā)熱性疾病。對各種傳染源的培養(yǎng)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和血清學分析以及寡核苷酸微陣列分析都缺乏信息。高通量測序產(chǎn)生103,632個序列，其中14個符合一種新型沙粒病毒(Arenavirus Burden)。另外的序列分析表明，這種新的沙粒病毒與淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒有關(guān)。 基于獨特序列的特異性PCR測定證實了病毒在接受者的腎臟，肝臟，血液和腦脊髓液中的存在。 免疫組織化學分析顯示接受者的肝臟和腎臟移植物中的沙粒病毒抗原。 在供體血清中檢測到IgM和IgG抗病毒抗體。移植后感染病原的早期診斷會降低移植后感染死亡率。

2.4NGS在血流感染性疾病中的應(yīng)用：早期發(fā)現(xiàn)和鑒定血流感染(BSI)中的病原體對于盡快啟動或調(diào)整抗生素治療非常重要。目前用于診斷BSI感染的金標準是血培養(yǎng)，但一般需要一至幾天，NGS直接檢測血液樣本中的病原體，保證了更快的診斷速度。在膿毒血癥診斷中，NGS顯示了獨特優(yōu)勢，補充了傳統(tǒng)病原學診斷方法的不足，具有很大的臨床應(yīng)用價值。Long等在北京協(xié)和醫(yī)院ICU 開展的單中心研究納入 78 份膿毒血癥患者血樣[19]。統(tǒng)計細菌及真菌的檢測結(jié)果，最終有 8 份標本培養(yǎng)和測序結(jié)果一致均為陽性，3 份標本培養(yǎng)結(jié)果為陽性而測序為陰性，9 份標本培養(yǎng)結(jié)果陰性而測序為陽性。以培養(yǎng)結(jié)果為“金標準”，NGS的靈敏度及特異度分別為72.7% 和 89.6% ；采用血培養(yǎng)聯(lián)合NGS診斷細菌或真菌感染，陽性率較單用血培養(yǎng)顯著升高(23.08% 和 12.82%，P=0.013) 。此外，通過二代測序還在 14 份血樣中檢測到 15 種病毒，且均通過桑格法測序驗證。這表明二代測序聯(lián)合血培養(yǎng)可進一步提高病原學診斷的陽性率。Abril 等報道[20]了一位60歲男性感染性休克和多器官衰竭的病例，該病例是由一種新的全基因組下一代測序分析在24 h內(nèi)診斷出來的，由血漿全基因組NGS診斷和16S rRNA測序證實為犬Capnocytophaga感染。這項技術(shù)在識別疑難病原體方面顯示出巨大的前景，它對傳染病診斷具有深遠的意義。體現(xiàn)出宏基因組技術(shù)相對于傳統(tǒng)檢測方法具有更高的效率。

3 總結(jié)與展望

NGS技術(shù)作為一種迅猛發(fā)展的新技術(shù)，突破了傳統(tǒng)檢測方法的局限性。針對難以培養(yǎng)或者原因不明的病原體感染患者，利用NGS可直接對樣本中的病原體 DNA 進行檢測，利用已建立的專業(yè)病原體數(shù)據(jù)庫，通過自動化數(shù)據(jù)分析得出準確可靠的病原體遺傳信息，推動了臨床微生物學和感染病學的發(fā)展[21-22]。但是其仍有一些局限性亟待解決：①NGS 工作流程的改善，例如縮短文庫構(gòu)建和驗證時間以及數(shù)據(jù)分析自動化等問題還需要進一步研究。②用于NGS的參考數(shù)據(jù)庫還不夠完善，大量測序數(shù)據(jù)無法進行有效匹配。③尚未開展與常規(guī)檢測方法比對的規(guī)律性研究[23-24]。

綜上所述，二次測序技術(shù)既是病原學診斷的一次革命，也是病原學診斷的一個界碑，具有里程碑式的意義。隨著基因測序技術(shù)的不斷發(fā)展，測序技術(shù)在生物學和生物醫(yī)學領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛，在測序數(shù)據(jù)數(shù)量和質(zhì)量愈來愈高的要求下，相信基因測序技術(shù)也會持續(xù)的高速發(fā)展[25]。