林德民 謝興文 李寧 徐世紅 李鼎鵬 柳博 姜朝陽 趙建偉

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

2.西北民族大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

3.甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 7300004

4.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

5.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)，是臨床常見的一種骨代謝疾病，其發(fā)病機(jī)制與破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)及成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)共同影響并介導(dǎo)的“骨平衡”失衡關(guān)系密切。大量研究表明，PI3K/AKT通路能調(diào)控相關(guān)細(xì)胞，引起“骨平衡”偏移。中醫(yī)藥治療OP由來已久，在治療不同類型OP中都有明確效果。部分研究提出，中醫(yī)藥干預(yù)能明顯影響PI3K/ AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)，這也許是中醫(yī)干預(yù)治療OP的重要機(jī)制之一。

1 PI3K/AKT信號通路

1.1 PI3K/AKT信號通路的組成

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)，是一種位于胞質(zhì)的脂質(zhì)激酶，由調(diào)節(jié)亞單位P85(一個相對分子質(zhì)量為 85 ×103)和催化亞單位P110(相對分子質(zhì)量為110 ×103)的異源二聚體所構(gòu)成，共有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型三種類型。PI3K兼具絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)和磷酯酰肌醇激酶雙重活性，并在細(xì)胞膜大范圍的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程中起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[1-2]。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)，PI3K所合成的活化后產(chǎn)物磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)在接受特定的刺激并作為“第二信使”調(diào)控細(xì)胞生命活動中具有關(guān)鍵作用[3]。

絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，AKT)，即AKT蛋白，亦名蛋白激酶(protein kinase，PKB)，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(有480個氨基酸殘基)。結(jié)構(gòu)分析可以發(fā)現(xiàn)，AKT結(jié)構(gòu)上分為PH結(jié)構(gòu)域、催化域及調(diào)節(jié)域共3部分；其中，PH結(jié)構(gòu)域與蛋白激酶A、蛋白激酶C相似并高度保守[1]。當(dāng)AKT蛋白未活化，PH結(jié)構(gòu)域遮蓋活性區(qū)域；活化時，該結(jié)構(gòu)域與PIP3結(jié)合，影響下游信號分子，參與并調(diào)控細(xì)胞的相關(guān)生命活動[4-5]。

1.2 PI3K/AKT通路激活

1.2.1激活過程：位于胞膜附近的PI3K可被膜上受體酪氨酸激酶(RTKs)、脾酪氨酸激酶(SYK)、d大鼠肉瘤蛋白(RAS)、G蛋白耦連受體(GPCRs)、JAK激酶(Janus kinase)等激活[6]。上游信號分子刺激后，處于胞質(zhì)區(qū)位置自身磷酸化的酪氨酸殘基與P110結(jié)合，PI3K被募集至質(zhì)膜，P85進(jìn)入質(zhì)膜內(nèi)表面，磷脂酰肌醇4,5-雙磷酸(PIP2)磷酸化后與P110結(jié)合，大量磷酸酰肌醇-3-磷酸(PI3P)及磷酸酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PI-3,4,5- P3)，磷酸酰肌醇-3,4-二磷酸(PI-3,4- P2)形成。下游信號分子AKT/ PKB結(jié)合后將從胞漿轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上，其構(gòu)象則會發(fā)生變化，即PH結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浯呋钚圆课坏囊种平獬?，從而激活A(yù)KT/ PKB的激酶活性[7-8]。

1.2.2PI3K/AKT通路對成骨細(xì)胞的影響：OB起源自間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，在參與調(diào)節(jié)骨形成過程中起重要作用。大量文獻(xiàn)研究指出，雄激素、鋅、N-鈣黏著蛋白骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、4、7、9及其亞家族成員等，都能夠通過PI3K/ AKT通路促進(jìn)OB增殖、分化。Huang等[9]研究指出，PI3K/ AKT在加快OB增殖同時，也可以通過Wnt/β-catenin、生長激素/胰島素樣生長因子1等多種途徑，促進(jìn)OB增殖分化。有研究[10]發(fā)現(xiàn)，激活的PI3K能夠調(diào)節(jié)p53、cyclin D1及caspase-3/9蛋白的水平，降低PSMC6誘導(dǎo)的OB凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。Pan等[11]實驗數(shù)據(jù)揭示，PI3K/ AKT通路參與糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GCs)誘導(dǎo)OB成骨抑制的過程并在其中起到一定作用。同時，PI3K/Akt/mTOR通路在原硅酸介導(dǎo)的體外成骨過程中也起著積極的調(diào)節(jié)作用[12]。另有國內(nèi)學(xué)者[13]發(fā)現(xiàn)，脈沖電磁場(pulse electromagnetic fields，PEMF)可通過OB表面初級纖毛激活PI3K /AKT通路，促進(jìn)骨形成活性。

1.2.3PI3K/AKT通路對破骨細(xì)胞的影響：OC起源自骨髓造血干細(xì)胞，直接參與骨吸收過程。大量研究表明，PI3K/AKT通路與OC間存有重要聯(lián)系。PI3K/ AKT通路可通過影響巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體(M-CSF)及核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)，在OC存活、分化以及“骨平衡”中產(chǎn)生影響[14]。當(dāng)PI3K/AKT通路被抑制時OC的形成減少。動物實驗證明，PI3K抑制劑LY294002能明顯抑制磷酸三鈣(tricalcium phosphate，TCP)磨損顆粒介導(dǎo)的小鼠顱骨溶解和OC形成，BMD值增加[15]。miR-363-3p[16]、腫瘤壞死因子α及炎癥因子等信號能夠通過PI3K/AKT途徑，直接或間接促進(jìn)OC生成，影響OP的發(fā)病。

2 中醫(yī)藥干預(yù)PI3K/AKT通路

2.1 中藥單體

大量研究文獻(xiàn)指出，中藥在OP治療中有著確切的療效，目前，中藥單體的相關(guān)研究也引起越來越多國內(nèi)外專家的重視，相關(guān)研究也證實中藥在OP治療中具有不可替代的作用。

動物實驗發(fā)現(xiàn)，PI3K/ AKT通路介導(dǎo)下，不同濃度丹參素和白藜蘆醇均可以升高骨密度值，降低OP大鼠相關(guān)細(xì)胞凋亡率，抑制如 cyto- C、Bax、AIF等相關(guān)蛋白的表達(dá)[17]。在對丹參單體進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)，其有效成分中丹酚酸B，能明顯上調(diào)PI3K及p-AKT表達(dá)，激活PI3K/AKT通路進(jìn)而刺激MC3 T3-E1細(xì)胞骨形成[18]。也有研究指出，丹酚酸A也能降低TNF-α、IL-6水平，使AKT磷酸化水平上調(diào)，降低Bax蛋白的表達(dá)[19]。同時，中藥丹參有效成分中的紫草酸鎂B(MLB)可以通過誘導(dǎo)AKT磷酸化，顯著提高內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化水平從而恢復(fù)微循環(huán)障礙，恢復(fù)受損大鼠后肢血流[20]。

中藥黃芪的研究中發(fā)現(xiàn)，其提取物毛蕊異黃酮(Calycosin)在成骨作用部分涉及 IGF1 R/ PI3K/ AKT通路，在10-8～10-6mol/L范圍內(nèi)對細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶活性和茜素紅S染色均有劑量依賴性的增強(qiáng)作用，而在10-5mol/L范圍內(nèi)有抑制作用；在最佳濃度時，可以增加成骨基因的mRNA水平和IGF1R和AKT的磷酸化；此外，GSK或LY治療后可部分逆轉(zhuǎn)毛蕊異黃酮對ROBs的影響，表現(xiàn)為毛蕊異黃酮誘導(dǎo)的ALP活性降低、鈣化結(jié)節(jié)和成骨基因表達(dá)減少[21]。

淫羊藿的主要活性成分之一淫羊藿苷(Icariin)能夠?qū)Cs誘導(dǎo)的SaoS-2細(xì)胞和小鼠OP變化有保護(hù)作用；實驗中發(fā)現(xiàn)，DEC1(一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的螺旋環(huán)螺旋蛋白)的過度表達(dá)和敲除分別反向調(diào)節(jié)Wnt/β- catenin和 PI3K/ AKT信號通路中的關(guān)鍵分子β- catenin和 PIK3 CA的表達(dá)，Wnt/β- catenin信號抑制物 DKK1和 PI3K/ AKT信號抑制物 LY294002抑制了淫羊藿苷對 DEC1的誘導(dǎo)作用，研究指出，DEC1在 PI3K/AKT/GSK3β/β- catenin綜合信號通路支持淫羊藿苷抗GCs型OP的作用[22]。

有實驗研究發(fā)現(xiàn)，從川續(xù)斷根分離的一種由半乳糖和甘露糖組成，分子量為2.61×104Da的均一多糖(DAP)，能夠通過上調(diào)VEGF和骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)，下調(diào)RANK和RANKL蛋白和mRNA的表達(dá)，激活PI3K/Akt/eNOS通路以達(dá)到預(yù)防和治療絕經(jīng)后OP[23]。

實驗發(fā)現(xiàn)，馬齒莧能有效抑制PI3K、Akt、雷帕霉素哺乳動物靶點(diǎn)(mTOR)、NF-κB的磷酸化及NF-κBα(IκBα)表達(dá)，并通過PI3K/Akt/mTOR和Nrf2/HO-1/NF-κB途徑達(dá)到抗炎和抗氧化作用[24]。同時，馬齒莧中分離得到(E)-5-羥基-7-甲氧基-3-(2′-羥基芐基)-4-色曼酮分析發(fā)現(xiàn)，(E)-5-羥基-7-甲氧基-3-(2′-羥基芐基) -4-色曼酮可以激活并促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞的PI3K/Akt及AMPK途徑刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT4向質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)，提高葡萄糖攝取，預(yù)防脂多糖誘導(dǎo)的骨量丟失[25]。

人參及其組方在OP治療由來已久，研究發(fā)現(xiàn)，人參酚酸提取物(PG2)能影響PI3K/Akt/eNOS通路的磷酸化，增加細(xì)胞活力，抑制棕櫚酸酯誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚及內(nèi)皮素1(ET-1)過度表達(dá)，從而發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮功能的作用[26]。

另有研究指出，燈盞花素、銀杏內(nèi)酯B、北五味子乙素等均能在PI3K/AKT通路介導(dǎo)下，影響相關(guān)細(xì)胞凋亡。

2.2 中藥復(fù)方

中醫(yī)藥治療OP由來已久，盡管中藥成方針對不同患者組方選藥并不完全相同，但就總體效果而言，中醫(yī)藥治療OP有著顯著的效果。

實驗證明，中藥成方補(bǔ)腎活血方含藥血清能夠在PI3K/AKT通路介導(dǎo)下影響OB增殖，同時激活p38 MAPK和 PI3K/AKT通路介導(dǎo)OB分化，研究認(rèn)為，p38 MAPK及 PI3K/ AKT是補(bǔ)腎活血方在OP治療中的主要作用機(jī)制[27]。有學(xué)者在對經(jīng)典方劑鹿角膠丸研究中指出，鹿角膠丸有效成分可以通過 PI3K/AKT通路，增加 OC凋亡，并在此過程中促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，抑制Bax的表達(dá)，抑制Caspase 3的裂解[28]。動物研究發(fā)現(xiàn)，四物湯能夠直接或間接影響GPER通路，調(diào)節(jié)在GPER相關(guān)下游信號分子PI3K、p- AKT表達(dá)，促進(jìn)OB增殖[29]。對成方恒古骨傷愈合劑的研究中也有發(fā)現(xiàn)，其有效成分可通過調(diào)控PI3K/ AKT通路促進(jìn)OB增殖治療絕經(jīng)后OP[30]。其他中藥成方如當(dāng)歸補(bǔ)血湯、和血生絡(luò)方及益氣化瘀湯等，均能夠通過PI3K /AKT通路介導(dǎo)，影響相關(guān)細(xì)胞增殖和凋亡。

2.3 針灸

針灸作為傳承已久的中醫(yī)治療手段之一，近年來越來越多地被應(yīng)用于OP治療及輔助治療之中。大量動物研究證實，針刺對OP模型小鼠存有一定療效。在對相關(guān)機(jī)制探究中，PI3K/AKT被證明是針刺治療OP的一個重要途徑。

動物實驗表明，對卵巢早衰大鼠針刺后，大鼠體內(nèi)PI3K/ AKT/ mTOR通路mRNA及蛋白表達(dá)量升高，血清雌二醇(estradiol，E2)分泌恢復(fù)至正常，卵巢功能基本恢復(fù)，在治療效果上，與雌激素治療效果相當(dāng)[31]。這也為絕經(jīng)后OP患者的治療研究提供了新的方向。在MCAO模型小鼠針刺研究中，免疫組化及Western blotting顯示：針刺“曲池”“足三里”穴位后，PI3K、AKT磷酸化水平均有所提升，同時，Bax表達(dá)抑制明顯[32]。還有研究指出，深刺“環(huán)跳”穴可以影響PI3K/AKT通路，抑制大鼠坐骨神經(jīng)損傷后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)[33]。動物研究指出，電針刺激大鼠內(nèi)、外膝眼可激活PI3K/AKT，影響 Bcl-2、Bax等相關(guān)蛋白表達(dá)，并減少相關(guān)炎癥因子IL-1β、TNF-α生成，抑制相關(guān)細(xì)胞的凋亡[34]。也有國內(nèi)學(xué)者[35]研究指出，電針刺激可 PI3K/AKT介導(dǎo)骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，促進(jìn)相關(guān)區(qū)域血管再生。

穴位埋線治療作為近些年發(fā)展起來，針灸治療的一個延伸。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，穴位埋線能夠直接或間接影響PI3K/AKT通路，上調(diào)相關(guān)蛋白，如GLUT4蛋白表達(dá)，調(diào)整相關(guān)激素水平。

3 小結(jié)及展望

PI3K/AKT通路是OP發(fā)病機(jī)制中一種重要細(xì)胞信息傳導(dǎo)途徑，該通路能夠通過對OB、OC及 VEGF、NO及缺氧誘導(dǎo)因子等多種與血管再生方面的相關(guān)因子等信號加以調(diào)控，在OP的治療中發(fā)揮重要作用。但有部分研究提出，該通路激酶3β的水平下對可調(diào)控因子發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用，由于目前缺乏對激酶3β定量分析和研究來確定準(zhǔn)確的界限的相關(guān)研究，單純通過PI3K/AKT通路治療OP仍存在著較大限制。

動物實驗及其他實驗發(fā)現(xiàn)，中藥單體及中藥成方的有效成分，針刺等中醫(yī)藥治療手段均能夠通過直接或間接激活 PI3K/AKT通路，調(diào)控下游相關(guān)信號分子，影響OB、OC等相關(guān)細(xì)胞分化及增殖。但由于中藥中有效成分較多，分離作用成分及確定中藥成方中發(fā)揮作用的主要有效成分仍是亟待解決的主要問題。

目前研究證實，多種中醫(yī)治療手段如針灸、方劑等在治療OP中均有著確切、顯著的效果，而PI3K/AKT是這些干預(yù)手段中主要作用機(jī)制之一，這也為OP治療相關(guān)機(jī)制研究提供了思路。以PI3K/AKT通路這一支點(diǎn)，更多OP治療手段將會被發(fā)掘，PI3K/AKT通路也能夠為更多新藥研發(fā)提供更多思路及重要靶點(diǎn)。更多的中醫(yī)藥治療方法的作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，也會更加的有利于中醫(yī)的推廣和普及。