田 麗 張少言 吳顯偉 邱 磊 劉希芳 吳定中 張惠勇 鹿振輝

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院呼吸疾病研究所，上海 200030

支氣管擴張癥是由慢性氣道損傷引起支氣管管壁肌肉和彈力支撐組織破壞導(dǎo)致的支氣管不可逆擴張[1]，臨床表現(xiàn)為慢性咳嗽、咳痰和反復(fù)的支氣管感染。有研究顯示，我國7 個省市城區(qū)40 歲以上人群支氣管擴張癥患病率為1.2%[2]，英美等國家也呈現(xiàn)出較高的發(fā)病率和死亡率[3-4]。支氣管擴張癥原因多為支氣管感染和阻塞兩大類，研究表明支氣管擴張癥患者存在上皮異常重塑伴黏膜纖毛結(jié)構(gòu)受損，導(dǎo)致炎癥和感染[5]，炎癥和感染又可導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞腫脹、脫落、壞死，黏液分泌增多，黏液腺增生，支氣管管壁結(jié)構(gòu)破壞，發(fā)生支氣管擴張癥，產(chǎn)生惡性循環(huán)。但是由于缺乏適宜開展研究的動物模型，其病理機制尚未完全清楚，故使用適合的動物模型進行基礎(chǔ)研究對闡明其發(fā)病機制、研發(fā)新的治療藥物至關(guān)重要。既往我國基礎(chǔ)研究多采用大鼠氣管內(nèi)直接注射銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）感染的方法建立支氣管擴張癥模型[6-7]，本文新增細(xì)菌感染/纖毛基因缺失小鼠和呼吸道類器官模型，以供本病研究參考。

1 細(xì)菌感染支氣管擴張癥模型

支氣管擴張?zhí)卣魇茄装Y、支氣管壁破壞和慢性細(xì)菌感染[8]。PA 是支氣管擴張癥患者氣道中檢測到的最常見的細(xì)菌[9]。1989 年Lapa 等[10]通過結(jié)扎大鼠肺葉頂葉并向支氣管內(nèi)注射PA 建立了世界上首例大鼠支氣管擴張癥模型，之后，有研究者采用皮下氣囊內(nèi)注射PA 彈性蛋白酶建立大鼠炎癥氣囊模型[11]。2000 年萬毅剛等[12]將Lapa 模型改進為支氣管內(nèi)直接注射PA，近20 年來我國的支氣管擴張癥研究大多采用該法構(gòu)建動物模型。但大鼠體積大，飼養(yǎng)管理及實驗操作不方便，不利于研究的大規(guī)模長期開展，同期國外研究多采用小鼠模型直接接種[13]，或用瓊脂珠、瓊脂糖珠等包被菌株，使菌株入肺率和感染成功率增加，為支氣管擴張癥的研究提供了更多可選擇的模型。

1.1 PA 肺部感染小鼠模型

C57BL/6 小鼠麻醉后進行氣管插管，將菌量為5×107CFU 的含藻酸鹽PA 滴入氣管內(nèi)感染，建立小鼠肺部感染模型[14]，該研究發(fā)現(xiàn)感染后肺的黏彈性可作為評估小鼠模型中PA 感染嚴(yán)重程度的新生物標(biāo)志物。該造模方法引起的肺部感染可持續(xù)72 h 以上，為研究PA 與支氣管擴張癥的相互作用機制提供了一個合適的模型。

也有研究將PA[（1×106～2×106）/50 μl]用瓊脂珠包埋后進行氣管內(nèi)注射建立慢性感染小鼠模型[15-16]。細(xì)菌培養(yǎng)后將其重懸于磷酸鹽緩沖液中，加入融化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（50℃）中，再于重礦物油中在室溫下高速攪拌，最后緩慢冷卻瓊脂固化形成珠，使混合物中的細(xì)菌嵌入瓊脂珠中，磷酸鹽緩沖液洗滌后得到瓊脂珠懸浮液。該模型可維持3 個月以上的細(xì)菌定植。該模型小鼠肺損傷（細(xì)菌斑塊百分比）增加；支氣管和肺實質(zhì)有炎癥病變[17]，炎癥小體在支氣管擴張中過度激活。

有研究采用瓊脂糖珠包被PA 制備肺部感染模型[18]。將1 ml 菌株懸浮液與8.5 ml 50℃預(yù)熱的2%瓊脂糖和0.5 ml 印度墨水（以便在組織中觀察瓊脂糖珠）混合后將其加入重礦物油，平衡、攪拌、冷卻、離心，磷酸鹽緩沖液稀釋得適宜濃度的瓊脂糖珠，經(jīng)氣管插管滴入50 μl PA[19]。PA 感染模型（5×105CFU/只）可引發(fā)小鼠支氣管周圍淋巴新生，為研究支氣管擴張癥中淋巴聚集的發(fā)展及其持久性所涉及的細(xì)胞和分子機制提供了一個獨特的模型。此外，該模型可在組織中觀察到瓊脂糖珠，使得感染部位和數(shù)量直觀化，便于進一步的研究。

此外，還有經(jīng)鼻單次接種及霧化吸入PA[20]的方法來制備PA 肺部感染小鼠模型。PA 與其他細(xì)菌比較，其感染對支氣管擴張癥的不良影響更大[21]，以上造模方法為研究PA 慢性感染在支氣管擴張癥中的病理機制及其產(chǎn)生的炎癥表現(xiàn)提供了多個可選擇的模型，可成功模擬肺部慢性感染，但操作要求較高，通過手術(shù)氣管插管滴注珠懸液，需要注意切口引起的感染。

1.2 膿腫分枝桿菌肺部慢性感染小鼠模型

非結(jié)核分枝桿菌（Nontuberculous mycobacteria，NTM）與支氣管擴張癥密切相關(guān)。美國支氣管擴張研究登記處發(fā)現(xiàn)，63%的支氣管擴張癥患者有NTM 病史或NTM 隔離史[22]，NTM 患者更有可能出現(xiàn)彌漫性氣道擴張和樹芽征。一項隊列研究納入221 例支氣管擴張癥張患者，研究期間有15.8%檢測到了NTM[23]。人NTM 肺病主要由鳥分枝桿菌復(fù)合群、NTM 等引起。近年來，由NTM 引起的肺部感染有所增加，尤其是患有基礎(chǔ)肺部疾病，如支氣管擴張、慢性阻塞性肺疾病等患者，因此建立NTM 肺部感染小鼠模型對研究支氣管擴張癥與NTM 的關(guān)系至關(guān)重要。

氣管插管注射包埋有NTM 菌株的瓊脂珠懸液懸液（1×105CFU/50 μl）來制備NTM 肺部感染模型，蘇木精-伊紅染色顯示存在淋巴細(xì)胞和少量中性粒細(xì)胞[24]，并產(chǎn)生肺損傷的表現(xiàn)。該造模方法可造成持續(xù)長達(dá)兩個月的肺部感染，與在支氣管擴張癥合并NTM患者中觀察到的損傷相類似，可克服NTM 清除和模擬人類囊性纖維化、支氣管擴張等，可用于進一步研究支氣管擴張癥合并NTM 感染的發(fā)生發(fā)展機制及兩者關(guān)系，有助于臨床診斷。

1.3 粘滑口腔球菌肺部感染小鼠模型

納入182 例支氣管擴張癥患者的隊列的支氣管肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)，9%的患者下呼吸道中定植了粘滑口腔球菌。為探討粘滑口腔球菌對支氣管擴張癥的潛在致病性，研究者建立了一種粘滑口腔球菌肺部感染的小鼠模型[25]，將其使用瓊脂包被后氣管插管滴入，96 h 后肺組織和肺泡灌洗液中出現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤，并產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子、趨化因子和脂質(zhì)介質(zhì)，環(huán)氧化酶-2 增加。該模型的建立為研究支氣管擴張患者的細(xì)菌學(xué)和個體化微生物組提供了新的見解，并首次提示了粘滑口腔球菌在支氣管擴張患者中的致病作用。

綜上所述，PA、NTM 等微生物感染氣道會刺激和維持以中性粒細(xì)胞性炎癥為主的肺部炎癥。但目前對于中性粒細(xì)胞以外的炎癥細(xì)胞的作用機制研究很少，因此亟需適合的動物感染模型來進行相應(yīng)的基礎(chǔ)研究，進一步闡明微生物在支氣管擴張癥中的發(fā)病機制，進而指導(dǎo)臨床研究與治療。以上多種小鼠感染模型適用于研究PA 等相應(yīng)的微生物感染所導(dǎo)致的支氣管擴張癥發(fā)病機制，為研究相應(yīng)的菌株與支氣管擴張癥之間的關(guān)系及后期的治療提供了適合的模型，有利于進一步明確支氣管擴張癥產(chǎn)生的相關(guān)機制。造模方法操作較簡便，動物與菌種均容易獲得，可產(chǎn)生與人體感染導(dǎo)致的支氣管擴張癥相同的細(xì)菌定植和相似的肺部感染，但是存在無法短期內(nèi)造成支氣管擴張的形態(tài)表現(xiàn)及氣管切開插管易感染的缺點。

2 纖毛基因缺失支氣管擴張癥小鼠模型

支氣管擴張癥是一種與黏液纖毛清除功能受損相關(guān)的病理性氣道擴張綜合征。除感染外，黏液-纖毛功能障礙、α1-抗胰蛋白酶缺乏等遺傳性缺陷均可使支氣管管腔阻塞[26]，導(dǎo)致支氣管擴張。原發(fā)性纖毛運動不良癥為常染色體隱性遺傳疾病，該病患者的支氣管纖毛存在動力臂缺失或變異等結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致纖毛不動或運動障礙，引起氣道纖毛清除功能的喪失或缺陷，產(chǎn)生慢性炎癥，進一步發(fā)展為破壞性氣道疾?。ㄖ夤軘U張）。故正常的纖毛對清除氣管異物、分泌黏液及保持支氣管通暢發(fā)揮著重要的作用。許多學(xué)者根據(jù)纖毛的這一特性，探討并應(yīng)用纖毛功能障礙或纖毛基因缺失建立支氣管擴張癥小鼠模型進行研究。

常染色體顯性遺傳多囊腎?。╝utosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）與支氣管擴張癥患病率增加有關(guān)。ADPKD 是一種纖毛疾病，涉及腎上皮細(xì)胞中非運動纖毛結(jié)構(gòu)和功能所必需的基因發(fā)生突變。在ADPKD 小鼠模型中發(fā)現(xiàn)有鞭毛內(nèi)運輸分子IFT88 基因的缺失，而IFT88 基因是鞭毛內(nèi)運輸機制的一個重要組成部分。為此建立IFT88 基因敲除小鼠，探討該基因的缺失是否可導(dǎo)致支氣管擴張癥的發(fā)生[27]。結(jié)果顯示IFT88-/-小鼠纖毛運動減慢和氣道高反應(yīng)性增加，3 周時IFT88-/-小鼠中有部分氣道有明顯擴張，3 個月時其出現(xiàn)明顯的支氣管擴張。由于IFT88 的敲除，氣道纖毛的缺失使氣道的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常，導(dǎo)致非炎癥支氣管擴張和氣道高反應(yīng)性。

核蛋白Chibby（Cby）是Wnt/β-catenin 的拮抗劑，Wnt/β-catenin 信號通路在肺形態(tài)的發(fā)生、再生、修復(fù)等各個方面起著至關(guān)重要的作用。典型的Wnt 信號通路利用核β-catenin 作為轉(zhuǎn)錄激活因子，通過與轉(zhuǎn)錄因子的T 細(xì)胞因子/淋巴增強因子家族結(jié)合來激活基因表達(dá)從而發(fā)揮作用。而β-catenin 信號的持續(xù)激活可破壞上皮細(xì)胞的分化，導(dǎo)致周圍氣道擴張。Cby 可抑制β-catenin 靶基因激活。為此建立Cby 基因敲除小鼠探討其與肺功能、肺發(fā)育及支氣管擴張癥等的關(guān)系[28]。研究表明，靶向破壞Cby 基因可使β-catenin靶基因cyclin D1 和axin2 在Cby-/-小鼠肺中上調(diào)。β-catenin 這一特異性的激活使得氣道擴張，氣道上皮分化異常，導(dǎo)致肺的結(jié)構(gòu)和功能的異常，表現(xiàn)為肺泡數(shù)量減少、肺上皮細(xì)胞增殖減少、分化受損及氣道擴張。該基因缺陷小鼠模型的建立可為支氣管擴張癥的研究提供有價值的動物模型。

瞬時受體電位多囊蛋白-2（transient receptor po tential polycystin-2，TRPP2）由平滑肌Pkd2 基因編碼，該基因的突變可導(dǎo)致ADPKD，可出現(xiàn)影像學(xué)和臨床表現(xiàn)的支氣管擴張。因此，使用Pkd2 基因條件敲除（Pkd2 conditional gene knockout，Pkd2SM-CKO）小鼠來研究TRPP2 缺乏是否可以導(dǎo)致與ADPKD 相關(guān)的支氣管擴張癥[29]。蘇木精-伊紅染色表明Pkd2SM-CKO小鼠產(chǎn)生氣道擴張表現(xiàn)。通過收縮和舒張氣管平滑肌藥物干預(yù)，還發(fā)現(xiàn)Pkd2SM-CKO小鼠支氣管平滑肌張力下降。該基因敲除小鼠模型的制備為調(diào)節(jié)支氣管平滑肌張力提供了一個潛在的治療靶點，為ADPKD 并發(fā)癥及呼吸疾病，特別是支氣管擴張癥的治療提供新的思路。

綜上，纖毛基因缺陷小鼠支氣管擴張癥造模穩(wěn)定，與纖毛功能相關(guān)的基因種類多樣[30]，且CKO 小鼠為目前研究常用的方法，可直接觀察目的基因?qū)χ夤軘U張癥的影響，適用于研究特定基因與支氣管擴張癥產(chǎn)生關(guān)系的機制研究，但是具有實驗周期較長、敲除技術(shù)要求高、價格昂貴等缺點。此外還有纖毛基因缺乏導(dǎo)致原發(fā)性纖毛運動障礙的基因缺陷小鼠模型，但由于實驗時間限制，這些基因缺陷是否最終會導(dǎo)致支氣管擴張癥仍需要進一步的研究與觀察，但不可否認(rèn)這些為未來更多基因缺陷支氣管擴張癥小鼠模型的建立提供了選擇。

3 呼吸道類器官模型

近年來許多系統(tǒng)的三維類器官模型的建立使基礎(chǔ)研究有了較動物模型與人體組織更加相近的體外模型，這些類器官來源于人干細(xì)胞或器官特異性祖細(xì)胞，其顯示出與人體器官一致的結(jié)構(gòu)和功能，可廣泛應(yīng)用于疾病造模、藥物藥理等[31]。

3.1 人肺類器官

激活蛋白A 的有效誘導(dǎo)可將人多能干細(xì)胞分化為前腸球狀體，再通過調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長因子和hedgehog 信號將前腸內(nèi)胚層誘導(dǎo)為肺譜系，最后建立人肺類器官。人肺類器官由肺的上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞組成，具有近端氣道樣結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)特征與天然肺相似[32]。RNA 測序后表明該類器官與人胎兒的肺部非常相似。人肺類器官模型的建立為研究人肺發(fā)育、成熟和肺部疾病提供了一個很好的模型，也為研究支氣管擴張癥在人肺類器官模型的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)和借鑒。

人肺類器官的建立還可通過Wnt 信號通路的周期性調(diào)節(jié)[33]，從多能干細(xì)胞高效衍生出功能性人氣道上皮細(xì)胞，最后建立人肺類器官模型來研究肺部氣道疾病。Wnt 信號可通過NKX2-1+祖細(xì)胞中間體快速定向分化為功能性近端氣道類器官[34]。該類器官模型結(jié)構(gòu)包含多種氣道上皮細(xì)胞，且其氣道標(biāo)志物水平顯示與成人肺相當(dāng)。該模型適用于多種氣道遺傳性疾病的體外建模和藥物開發(fā)，故也可以應(yīng)用于支氣管擴張的相關(guān)研究。

3.2 氣液界面（airliquid interface，ALI）組織培養(yǎng)

ALI 組織培養(yǎng)通過從肺移植物中獲得人支氣管上皮細(xì)胞進行培養(yǎng)，使用PneumaCul 培養(yǎng)體系在氣-液界面促進細(xì)胞的增殖和分化[35]。氣管切片使用含二硫蘇糖醇和DNAse1 的MEM 沖洗，然后在含鏈霉親和素、DNAse1、抗生素和抗真菌劑的MEM中過夜孵育。上皮細(xì)胞片用細(xì)胞消化液進一步解離，并置于PneumaCult Ex-Plus 擴增培養(yǎng)基，傳代后使用含特殊條件培養(yǎng)基的平板建立ALI，分化4～6 周為成熟的ALI。氣液界面組織培養(yǎng)是體外產(chǎn)生呼吸上皮細(xì)胞成熟的模型，該模型可保留人體呼吸道上皮細(xì)胞的特征，高度模擬人呼吸道結(jié)構(gòu)。

綜上，類器官模型應(yīng)用人源性的組織進行實驗研究，可高度模擬人體內(nèi)環(huán)境和疾病演變過程。除了與人體器官組織形態(tài)、基因更加相似，還在實驗過程中排除了動物模型可能發(fā)生的變量，且與單一的細(xì)胞培養(yǎng)比較，更能代表復(fù)雜的人體組織，是目前研究的熱點和方向。但是類器官培養(yǎng)需要較高的技術(shù)和實驗條件，目前國內(nèi)尚未大規(guī)模應(yīng)用，此外類器官雖然能模擬人體器官結(jié)構(gòu)，但只是單個或部分結(jié)構(gòu)，不能反映人體整體情況。但相較動物及細(xì)胞模型來說，更符合人體內(nèi)環(huán)境，是支氣管擴張癥等呼吸系統(tǒng)疾病未來研究的方向。

4 總結(jié)

支氣管擴張癥是一種常見的慢性呼吸道疾病，易與其他呼吸系統(tǒng)疾病相互影響，相互重疊，為其診斷及治療帶來困難。氣道的微生物感染和纖毛功能障礙等所導(dǎo)致的支氣管阻塞是支氣管擴張癥產(chǎn)生的主要原因。但是受限于動物模型的制備，其發(fā)病機制尚未完全清晰，對其藥物研發(fā)也造成極大的困擾。既往支氣管擴張癥的各種動物模型種類較少，且尚未有國際標(biāo)準(zhǔn)的支氣管擴張癥動物模型造模方法，需要進一步的深入研究與細(xì)化。近年來逐漸出現(xiàn)纖毛基因缺失及人肺類器官等模型，為支氣管擴張癥等呼吸系統(tǒng)疾病的研究提供了新的方法，有助于進一步闡明本病機制及藥物作用，是未來支氣管擴張癥基礎(chǔ)研究的方向。