張水勤，肖雁冰

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院婦產(chǎn)科，貴州 遵義 563000)

除轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)及外源性誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)干細(xì)胞分化外，與成熟體細(xì)胞共培養(yǎng)同樣可以誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為目的細(xì)胞[1]，但誘導(dǎo)分化的機(jī)制尚未完全明確。有研究顯示，干細(xì)胞顯著的再生能力是由于其外泌體是組織修復(fù)過程中活躍的參與者[2]。目前，臨床上器官功能損傷的患者可以通過藥物、手術(shù)及器官移植等手段治療，但都無法徹底根治，并且常伴隨一系列相關(guān)并發(fā)癥。鑒于傳統(tǒng)療法的局限性，生物再生替代療法已成為目前器官功能損傷治療的研究熱點(diǎn)。已有研究證明，外泌體可以在不需要任何生長因子或刺激物的情況下誘導(dǎo)細(xì)胞定向分化[3]。以干細(xì)胞分化為目的細(xì)胞的替代療法可為退變及損傷組織或器官的修復(fù)再生提供足量且穩(wěn)定的細(xì)胞來源，使維持原有的生物力學(xué)功能、逆轉(zhuǎn)組織損傷、功能退化成為了可能。

1 外泌體的來源、結(jié)構(gòu)、種類及作用

細(xì)胞在特定外環(huán)境下產(chǎn)生的一些以膜為基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡，又被稱為細(xì)胞外小泡。細(xì)胞外囊泡分為三類：第一類是凋亡小體，直徑5～50 nm；第二類為微泡、外小體、微粒或質(zhì)膜衍生小泡，直徑50 ～1 000 nm；第三類也是最重要的一種，分泌型細(xì)胞外小泡，直徑50～150 nm，又被稱作外泌體，是細(xì)胞間通訊傳遞物質(zhì)的新發(fā)現(xiàn)[4]。細(xì)胞內(nèi)特異性的核酸、蛋白質(zhì)及其他生物活性分子根據(jù)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境選擇性地加載到外泌體中，并在全身循環(huán)。研究表明，外泌體在多種生物過程中發(fā)揮著通訊作用，例如細(xì)胞通訊、干細(xì)胞分化、器官再生等，是細(xì)胞間相互作用的一種新方式[5-6]。外泌體通過特定配體錨定在不同類型的細(xì)胞表面改變細(xì)胞間通訊，包括生物的發(fā)生、負(fù)載物的選擇、細(xì)胞的特異性攝取、抗原呈遞、免疫調(diào)節(jié)和藥物有效載荷傳遞[6]，提示外泌體是細(xì)胞間信號傳導(dǎo)的重要參與者，其功能及特征與起源細(xì)胞的生理功能及胞內(nèi)含有的特異性物質(zhì)有關(guān)[7-8]。

2 外泌體在生物醫(yī)學(xué)及組織修復(fù)中的作用

2.1 外泌體誘導(dǎo)干細(xì)胞在神經(jīng)再生與修復(fù)中的作用

Takeda等[9]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)胞分泌的外泌體可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchyma stem cell，MSC)分化為神經(jīng)細(xì)胞，且分化后的MSC高表達(dá)神經(jīng)標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白，這個復(fù)雜的過程由外部和固有信號共同驅(qū)動，這些信號最終決定了神經(jīng)細(xì)胞的類型和數(shù)量，而外泌體中的miRNA可能是MSC向神經(jīng)元分化的機(jī)制。外泌體可能通過膜融合或內(nèi)吞的方式將能夠重新編碼多種細(xì)胞機(jī)制的miRNA導(dǎo)入受體細(xì)胞中，從而有助于向星形細(xì)胞譜系的誘導(dǎo)[10]。事實上，外泌體運(yùn)輸?shù)脑S多蛋白和miRNA都反映了其起源細(xì)胞的性質(zhì)。此外，Ma等[11]揭示了外泌體中部分miRNA的特征，證明miR-21a在神經(jīng)元生成和介導(dǎo)外泌體神經(jīng)源性潛力中有關(guān)鍵作用。

2.2 外泌體誘導(dǎo)干細(xì)胞在髓核再生與修復(fù)中的作用

2006年，Richardson等[12]將髓核細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞直接共培養(yǎng)后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可表現(xiàn)出髓核細(xì)胞表型。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，用熒光染料標(biāo)記的髓核細(xì)胞外泌體與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞直接共培養(yǎng)，可觀察到髓核細(xì)胞外泌體以內(nèi)吞的方式被骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞攝取，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核細(xì)胞分化，并且分化能力強(qiáng)于細(xì)胞間接共培養(yǎng)[13]。藍(lán)蔚仁[3]的研究發(fā)現(xiàn)，敲減部分Rab27a蛋白的髓核細(xì)胞，其外泌體的釋放明顯減少，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核細(xì)胞分化明顯受到抑制，證明外泌體是誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核細(xì)胞分化的重要物質(zhì)之一。此外，髓核細(xì)胞經(jīng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體處理后出現(xiàn)明顯增殖，通過定量檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體刺激后的髓核細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，髓核細(xì)胞內(nèi)與椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)丟失、退變密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-3表達(dá)均下降，而其抑制物蛋白表達(dá)呈升高趨勢，從而促進(jìn)髓核細(xì)胞的增殖，延緩椎間盤組織的退化[14]。此外，在動物實驗中也發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可通過抑制炎性介質(zhì)及NLRP3等炎性小體的活性從而在髓核細(xì)胞中發(fā)揮抗炎作用，還可阻止椎間盤的退行性變[15]。以上研究為體外獲取更多的髓核細(xì)胞提供了更為簡單的方法，同時也為椎間盤病變的治療提供了全新的方向。

2.3 外泌體誘導(dǎo)干細(xì)胞在骨再生與修復(fù)中的作用

Chen等[16]將脂肪干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，脂肪干細(xì)胞具有新生軟骨形成的能力，可降低X型膠原蛋白和腫瘤壞死因子-α的表達(dá)，并且還能改善新生軟骨的凋亡和纖維化等問題。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，附載于聚乙烯亞胺支架上的外泌體改善了骨整合過程中的礦化作用，且誘導(dǎo)人牙周膜干細(xì)胞向骨分化[3]。一項動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，與用PBS處理的軟骨病灶相比，胚胎干細(xì)胞衍生的外泌體治療骨缺損具有獨(dú)特的作用，其可使軟骨病灶完全恢復(fù)為類似于天然組織的軟骨和軟骨下骨[17]，證明外泌體在軟骨修復(fù)中有重要的作用。此外，在探索含MSC外泌體的絲素蛋白3D支架促進(jìn)大鼠顱骨缺損區(qū)的骨再生實驗中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在附有外泌體的3D支架上培養(yǎng)14 d后，其相關(guān)促成骨基因ALP、RUNX2及OCN的表達(dá)均上調(diào)，說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化受到支架上的外泌體的調(diào)控，并且主要發(fā)生在成骨分化后期[18-19]。外泌體顯示出其通過轉(zhuǎn)移生物成分改變細(xì)胞間通訊的能力，也進(jìn)一步證明外泌體功能與外泌體來源細(xì)胞密切相關(guān)。

2.4 外泌體誘導(dǎo)干細(xì)胞在牙再生與修復(fù)中的作用

目前，牙周疾病的治療主要是修復(fù)和重建牙及牙周組織的結(jié)構(gòu)和功能完整性。有研究發(fā)現(xiàn)，在病變牙周圍移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-1β明顯下調(diào)，破骨細(xì)胞數(shù)量減少，牙槽骨病變明顯逆轉(zhuǎn)，說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞除可抑制牙周炎癥反應(yīng)外，還可以促進(jìn)牙周組織的再生[20]。Wang等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，人乳牙脫落細(xì)胞的外泌體可促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的成骨分化，原因可能是外泌體攜帶的Wnt3a和BMP2抑制了BMP/Smad和Wnt/β-catenin信號通路，顯著增強(qiáng)成骨分化。Mohammed等[22]發(fā)現(xiàn)，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體在大鼠實驗性牙周炎的輔助治療中，可促進(jìn)新牙周組織的生成，說明BMC分泌的外泌體確實具有促進(jìn)牙周組織再生的潛力。將人牙周干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在體外共培養(yǎng)可發(fā)現(xiàn)，牙周組織再生和成骨分化可能是由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體通過OPG-RANKL-RANK信號通路調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的功能，并影響巨噬細(xì)胞極化和白細(xì)胞介素-1β表達(dá)，從而調(diào)節(jié)炎癥性免疫反應(yīng)，抑制牙周炎的發(fā)展和牙周組織的免疫損傷[23]。還有實驗發(fā)現(xiàn)，脂多糖預(yù)處理牙囊細(xì)胞的外泌體后能促進(jìn)牙囊細(xì)胞的增殖、遷移，形成完整的牙周組織，伴隨外泌體濃度的增加，牙囊細(xì)胞增殖、遷移速度加快，最終達(dá)到飽和狀態(tài)[24]。這為未來以新型材料為支架、以外泌體為載體誘導(dǎo)細(xì)胞定向分化提供了思路。

3 外泌體誘導(dǎo)干細(xì)胞在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用

與健康個體相比，癌癥患者中可以檢測到更多、更頻繁的外泌體指導(dǎo)細(xì)胞的分子通訊[9,25]。這種由外泌體指導(dǎo)的相互作用在腫瘤形成、進(jìn)展、免疫逃逸、轉(zhuǎn)移及血管生成和耐藥性中具有促進(jìn)作用[26]。CD99有助于抑制腫瘤的發(fā)生和分化，沉默CD99的尤文氏肉瘤細(xì)胞的外泌體通過miR-34a抑制Notch-NF-κB誘導(dǎo)促進(jìn)尤文氏肉瘤細(xì)胞的神經(jīng)分化，減少細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)而誘導(dǎo)分化程度更高的惡性表型[27-28]。人肝癌HepG2細(xì)胞源性外泌體與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，其可誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向癌相關(guān)肌成纖維細(xì)胞分化，同時也能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖[26]，進(jìn)一步提高腫瘤的侵襲力。也有研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞共孵育時，兩種細(xì)胞相互促進(jìn)生長，甚至部分星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)致瘤表型[29]，原因可能在于外泌體起源于C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，外泌體的功能與細(xì)胞來源密切相關(guān)。

4 外泌體在機(jī)體代謝中的作用

人體心血管疾病、糖尿病、脂肪肝、骨質(zhì)疏松癥、氣道疾病、退行性疾病(包括癡呆癥)和某些癌癥，被認(rèn)為在很大程度上是由肥胖引起的胰島素抵抗導(dǎo)致。脂肪組織外泌體在能量平衡和代謝中有重要作用。脂聯(lián)素是一種多效性器官保護(hù)蛋白，其通過與T-鈣黏蛋白結(jié)合被內(nèi)吞入細(xì)胞，從而刺激外泌體的生物合成和釋放[30-31]，導(dǎo)致細(xì)胞神經(jīng)酰胺(一種與胰島素抵抗、細(xì)胞死亡、炎癥和動脈粥樣硬化有關(guān)的鞘脂)的減少，過量的神經(jīng)酰胺可引起胰島素抵抗和心血管疾病相關(guān)臨床表現(xiàn)[32]。一項動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織巨噬細(xì)胞衍生的外泌體可影響小鼠的胰島素敏感性，當(dāng)給予瘦小鼠肥胖小鼠脂肪組織巨噬細(xì)胞的外泌體時，可引起其葡萄糖不耐受和胰島素抵抗；而瘦小鼠脂肪組織巨噬細(xì)胞的外泌體則改善了肥胖小鼠的葡萄糖不耐受和胰島素抵抗，其可能是外泌體內(nèi)microRNAs(如miR-155)的變化對調(diào)節(jié)胰島素敏感性和葡萄糖穩(wěn)態(tài)有重要作用[33]。脂聯(lián)素如何通過外泌體提高胰島素敏感性和心臟功能，以及進(jìn)一步應(yīng)用于臨床治療還有待進(jìn)一步研究。

5 展望

目前，臨床上目的細(xì)胞及特定器官在體內(nèi)外的構(gòu)建是現(xiàn)代再生醫(yī)學(xué)及替代醫(yī)療的嶄新方案。其中干細(xì)胞是一種具有強(qiáng)大自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，但由于免疫排斥、誘導(dǎo)效率低、穩(wěn)定性較差及相關(guān)并發(fā)癥問題限制了干細(xì)胞在臨床上的廣泛運(yùn)用[34]。為了避免這些風(fēng)險，體外目的細(xì)胞培養(yǎng)或無細(xì)胞誘導(dǎo)替代療法有望成為一種有前途的策略。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞療法用于細(xì)胞及組織的再生修復(fù)，不僅是因為干細(xì)胞在損傷部位的增殖和分化，也可能是由旁分泌釋放的外泌體發(fā)揮作用[2]。越來越多的研究表明，外泌體在各種生理系統(tǒng)中對傷口愈合和組織修復(fù)具有積極作用[35]，且外泌體的生物學(xué)效應(yīng)在很大程度上取決于供體細(xì)胞的來源和生理狀態(tài)，與共培養(yǎng)相比，無細(xì)胞方法具有免疫原性低、靶向性強(qiáng)、效率高及易于使用等優(yōu)勢[5]。這引起了人們對在組織工程及再生醫(yī)學(xué)中利用外泌體的興趣，其中定型細(xì)胞分泌的外泌體可以誘導(dǎo)或觸發(fā)增殖細(xì)胞的分化，為構(gòu)建替代療法打開了一條嶄新的通路?？紤]到磷脂雙分子層外泌體的良好生物相容性和免疫親和力等相關(guān)特性，可經(jīng)過特定修飾并將有效載荷傳遞至靶細(xì)胞，因此外泌體經(jīng)過改造后可以提供各種具有巨大治療潛力的有效載荷，如小干擾RNA、微小RNA(miRNA/miR)和小分子干擾RNA[36]。此外，外泌體作為“無細(xì)胞”療法的介質(zhì)，能夠避免干細(xì)胞直接移植療法的不良問題。但是，干細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)的方式也是需要解決的問題，經(jīng)血循環(huán)注射干細(xì)胞后，其在體內(nèi)的遷移路徑和在各個器官中的分布難以追蹤，雖然干細(xì)胞經(jīng)血循環(huán)注入后表現(xiàn)出對創(chuàng)傷組織的“歸巢現(xiàn)象”，但其歸巢率往往較低，而未“歸巢”的干細(xì)胞在人體內(nèi)代謝的形式和歸宿尚不清楚[37]。外泌體作為細(xì)胞分泌介質(zhì)，其功能在很大程度上取決于親代細(xì)胞的功能，且目前任何干細(xì)胞和成體細(xì)胞都能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體的大規(guī)模生產(chǎn)，因此對干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)可能會改變目前傳統(tǒng)的細(xì)胞治療的模式，推進(jìn)組織或器官替代治療的新進(jìn)程，其代表了“無細(xì)胞”醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一種有前途的新方向，并可能為當(dāng)下所面臨的許多醫(yī)學(xué)難題提供解決思路。