羅實 魏大鵬 魏大程?

1) (復(fù)旦大學(xué)高分子科學(xué)系， 聚合物國家重點實驗室， 上海 200433)

2) (復(fù)旦大學(xué)材料科學(xué)系， 分子材料與器件實驗室， 上海 200433)

3) (中國科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院， 重慶重點多尺度制造技術(shù)實驗室， 重慶 400714)

1 引 言

近年來， 二維材料由于其獨特的結(jié)構(gòu)以及物理特性引起了學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的廣泛關(guān)注， 被廣泛應(yīng)用于催化、傳感、電化學(xué)能量轉(zhuǎn)化與存儲以及生物醫(yī)療等領(lǐng)域[1-6].2004 年， 第一種二維材料即單層碳原子的石墨烯被兩位材料科學(xué)家Geim 和Novoselov[7]發(fā)現(xiàn)， 引發(fā)了石墨烯的研究熱潮.此后， 石墨烯越來越多的優(yōu)異物理性質(zhì)(超高遷移率、導(dǎo)熱性、高機械強度、低散射系數(shù)等)被發(fā)現(xiàn).由于石墨烯只有單原子層厚度， 任何分子吸附到材料表面都容易影響其表面電子輸運， 導(dǎo)致其導(dǎo)電性對化學(xué)摻雜和電學(xué)摻雜都十分敏感[8-10].同時石墨烯具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)、高比表面積以及表面可修飾等特性.因此， 石墨烯是開發(fā)高性能生物傳感器的理想材料.除石墨烯之外， 還有大量的類石墨烯二維層狀材料， 比如氮化碳(C3N4)[11-14]、過渡金屬硫族化合物(transition metal dichalcogenides，TMDs)[15，16]、氮化硼(BN)和過渡金屬氧化物等.相比于只有碳原子的石墨烯， 這些二維材料有更豐富的元素和結(jié)構(gòu)組成， 使它們在催化、傳感、儲能等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用.此外， 半導(dǎo)體性的類石墨烯二維層狀材料制成的傳感器信噪比和靈敏度往往高于石墨烯， 為高精度生物傳感提供了更豐富的材料選擇.二維材料在生物傳感領(lǐng)域展現(xiàn)出眾多優(yōu)異的性質(zhì)， 也使得二維生物傳感器成為了最近十年的研究熱點.

二維生物傳感器通常是利用二維材料作為信號轉(zhuǎn)換元件來傳遞生物信號的器件.相較于傳統(tǒng)的生物傳感器， 二維材料制備的傳感器在電子轉(zhuǎn)移效率、比表面積和摻雜靈敏度方面都遠高于傳統(tǒng)金屬材料.這也使得二維材料制備的電化學(xué)[17，18]、晶體管[19-25]和熒光(FRET)傳感器[26-30]的靈敏度遠高于傳統(tǒng)金屬和半導(dǎo)體制備的電化學(xué)、晶體管和熒光傳感器.

目前， 二維生物傳感器的性能已經(jīng)超過傳統(tǒng)生物傳感器， 二維材料摻雜和傳感界面設(shè)計方法仍在不斷發(fā)展， 使得傳感性能進一步提升.將N， B， S等原子精準(zhǔn)地摻雜到二維材料表面， 有效增加材料的電子態(tài)密度和活性， 從而大幅提升二維電化學(xué)傳感器的靈敏度.除了對二維材料精準(zhǔn)原子摻雜以外， 在二維材料表面精準(zhǔn)地構(gòu)筑分子級生物探針可以有效拓寬傳感器的檢測物范圍.常見的生物探針有酶、抗體、核酸適配體等.這些分子級生物探針往往擁有強特異性和高靈敏度等特點.但各自也有一些不足， 比如酶雖然特異性強， 但其可檢測物質(zhì)的范圍較窄; 抗體傳感器雖然特異性強、檢測范圍較廣， 但其生產(chǎn)成本高、各批次均一性較差; 核酸適配體作為一種可人工合成的新型生物探針， 其特異性強、檢測范圍廣、各批次間均一性好， 但是核酸適配體篩選方法的專利授權(quán)費用高昂， 限制其大規(guī)模商業(yè)化開發(fā).除以上探針可用于構(gòu)筑生物傳感界面外， 一些生物和化學(xué)小分子也被用于精準(zhǔn)地修飾傳感界面， 用以精確調(diào)控被檢測物質(zhì)的相關(guān)化學(xué)反應(yīng)， 實現(xiàn)對一些壽命很短的化學(xué)分子進行相關(guān)檢測.

根據(jù)以上幾種生物界面的修飾方法來看， 對二維生物傳感界面進行精準(zhǔn)的分子和原子構(gòu)筑， 精確調(diào)控了傳感過程中的相互作用和化學(xué)反應(yīng)， 進一步有效提升器件靈敏度和檢測物范圍.開發(fā)新的原子級界面構(gòu)筑方法， 對于高性能生物傳感器的研究至關(guān)重要.本文將綜述在二維生物傳感界面精準(zhǔn)原子構(gòu)筑領(lǐng)域的最新進展， 并探討其存在的問題和未來發(fā)展方向.

2 電學(xué)生物傳感界面的精準(zhǔn)制造

常見的電學(xué)生物傳感器主要包括電化學(xué)生物傳感器[17，18]、場效應(yīng)晶體管生物傳感器[19-25].電化學(xué)傳感器是基于電化學(xué)反應(yīng)， 將化學(xué)信號(待測物質(zhì)的濃度、活度等)轉(zhuǎn)變?yōu)橹庇^可讀的電信號(電流、電阻、電位等)的裝置.如圖1(a)所示， 過氧化氫發(fā)生催化反應(yīng)變成水和氧負離子， 氧負離子通過媒介將電子轉(zhuǎn)移到工作電極上， 從而改變電極上的電流值大小[31].工作電極作為電化學(xué)傳感器的感應(yīng)器， 很大程度上影響著傳感器的分析性能.常見的工作電極有玻碳電極、金電極、超微電極、碳糊電極等.制備新型電極材料[32-37]進而提高傳感性能是電化學(xué)傳感器研究的核心問題.場效應(yīng)晶體管生物傳感器是基于場效應(yīng)原理將化學(xué)信號轉(zhuǎn)化成電信號的裝置.如圖1(b)所示， 石墨烯溝道表面的生物探針捕獲目標(biāo)分子， 目標(biāo)分子通過雙電層的場效應(yīng)實現(xiàn)對石墨烯溝道摻雜， 從而改變漏極電流.當(dāng)目標(biāo)分子帶負電時， 對石墨烯進行P 型摻雜， 石墨烯的空穴變多， 狄拉克點向右移動; 當(dāng)目標(biāo)分子帶正電時， 對石墨烯進行N 型摻雜， 石墨烯的電子變多， 狄拉克點向左移動[10].如果晶體管的溝道不是石墨烯這類半金屬材料， 而是半導(dǎo)體材料， 比如硫化鉬、硒化鎢等， 這類晶體管通過生物探針捕獲帶電目標(biāo)分子， 然后利用場效應(yīng)降低溝道材料與電極之間的肖特基勢壘， 從而使更多能量較低的電子穿過溝道， 增加漏端電流， 如圖1(c)和圖1(d)所示[38].場效應(yīng)晶體管生物傳感器主要包含識別待測物的生物探針和信號轉(zhuǎn)化的導(dǎo)電溝道[39-51].生物探針修飾在溝道表面， 捕獲探測物后通過場效應(yīng)原理對溝道產(chǎn)生電荷摻雜作用， 從而將化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為電信號.開發(fā)新型的生物探針(酶、抗體、適配體和有機小分子等)和修飾方法是高性能場效應(yīng)晶體管生物傳感器研究的關(guān)鍵.

2.1 二維材料摻雜及其生物傳感應(yīng)用

原子摻雜可以有效調(diào)節(jié)二維材料的電學(xué)性質(zhì)和表面化學(xué)勢， 比如氮(N)摻石墨烯可以有效增加材料的自由載流子密度， 以及導(dǎo)熱導(dǎo)電能力[52，53].N摻雜石墨烯具有高的電子態(tài)密度， 可以輔助電化學(xué)中的還原反應(yīng)， 提高電化學(xué)生物傳感器的靈敏度.

如圖2 所示， 一個氮摻雜的石墨烯電極可用于葡萄糖氧化酶檢測.葡萄糖氧化酶能夠催化葡萄糖與氧氣發(fā)生氧化反應(yīng)， 產(chǎn)生葡萄糖酸和過氧化氫.氮摻雜石墨烯的高電子態(tài)密度使其表面的過氧化氫更容易發(fā)生還原反應(yīng)， 從而可以得到更大的還原電流信號， 有效提升了傳感器的靈敏度.硼原子摻雜的石墨烯也展示了優(yōu)異的電催化活性， 基于硼摻雜的石墨烯被廣泛用于電化學(xué)檢測， 比如可以檢測對苯二酚[54]、過氧化氫[55]、鳥嘌呤[56]等.此外， 硫原子摻雜的石墨烯可以有效增加石墨烯的表面積，從而提升傳感器性能[57].在二維材料表面進行元素摻雜， 實現(xiàn)了電化學(xué)傳感界面的精準(zhǔn)原子構(gòu)筑，是一種有效改善電化學(xué)傳感器性能的方法.

圖1 (a)電化學(xué)傳感過程示意圖[31]; (b)石墨烯場效應(yīng)晶體管利用場效應(yīng)檢測帶電分子傳感過程示意圖[10]; (c) 硫化鉬晶體管檢測pH 值時吸附離子過程示意圖; (d)吸附離子前后， 硫化鉬能帶示意圖; 吸附離子前， 半導(dǎo)體與電極之間形成肖特基勢壘， 能量較低的電子無法穿越勢壘; 吸附離子后， 相當(dāng)于給晶體管增加了柵極電壓， 使得勢壘降低， 能量較低的電子也可以穿越勢壘; 除此之外， 還有少部分電子可以以隧穿形式穿過勢壘[38]Fig.1.(a) Schematic of sensing mechanism of electrochemical sensors[31].(b) Schematic of sensing mechanism of graphene transistor[10].(c) Illustration of the principle of pH sensing.At lower pH (higher concentration of H+ ions)， the OH group on the dielectric surface gets protonated to form leading to a positive surface charge on the dielectric， while at higher pH， the OH group gets deprotonated to form O， leading to a negative surface charge on the dielectric.(d) Schematic band diagram illustrating the current flow mechanism in (n-type) field effect transistors (FETs) with the semiconducting layer having a considerable band gap.Only electrons having an energy greater than the barrier height can cross the barrier and contribute to current as shown by the green arrow.At low gate voltage (VGS1)， few electrons (within the green circle) can cross the barrier.After the application of a higher gate voltage (VGS2)， more electrons (within the green circle) can cross the barrier; In the case where the semiconducting channel has a very small band gap， not only can electrons flow above the top of the barrier， but electrons with lower energies can also tunnel through the barrier， which can increase the leakage current[38].

2.2 金屬納米顆粒修飾生物傳感界面

金屬納米顆粒修飾二維材料可以有效提升材料的導(dǎo)電性和電子轉(zhuǎn)移能力， 從而提升電極的活性.如圖3(a)—(d)所示， Su 等[58]用金納米顆粒修飾硫化鉬， 增加了硫化鉬的導(dǎo)電性和納米結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性， 實現(xiàn)了對多巴胺的高靈敏度探測(探測極限為80 nmol/L).銅納米顆粒也被用于硫化鉬納米片的修飾， 成功在堿性環(huán)境中實現(xiàn)了對葡萄糖的檢測[59].此外， 半金屬的石墨烯也常被用于修飾硫化鉬納米片， 石墨烯不僅可以增加硫化鉬的導(dǎo)電性， 還可以提供一個多孔結(jié)構(gòu)來提高其催化能力， 如圖3(e)和圖3(f)所示[60].石墨烯修飾的硫化鎢也展示了較強的活性， 被用于檢測鄰苯二酚、間苯二酚和對苯二酚等[54].在二維生物傳感界面精準(zhǔn)構(gòu)筑金屬納米顆?？梢蕴嵘牧系膶?dǎo)電性、催化效率， 是一種改善電化學(xué)類器件的有效方法.

2.3 酶修飾生物傳感界面

酶是一種高催化效能且特異性強的傳感物， 可用于識別一些特定的被酶催化的生物分子.生物分子與酶的反應(yīng)產(chǎn)物能有效對石墨烯進行摻雜， 從而可以改變晶體管溝道的跨導(dǎo)， 將被測物濃度轉(zhuǎn)化成電信號.在多數(shù)傳感原理中， 都需要生物分子以共價鍵結(jié)合到石墨烯表面， 這會破壞石墨烯的sp2結(jié)構(gòu)和生物分子的折疊結(jié)構(gòu).而酶傳感器是以靜電吸附力附著在石墨烯表面， 很好地避免了共價鍵對生物分子和石墨烯sp2結(jié)構(gòu)的破壞.

圖2 氮摻雜石墨烯用于葡萄糖氧化酶檢測 (a) N 摻雜石墨烯示意圖， 灰色為碳原子， 藍色為氮原子， 白色為氫原子; (b) 分別在氮摻雜石墨烯和石墨烯上的葡萄糖氧化酶的循環(huán)伏安曲線， 溶液環(huán)境為氮氣飽和的0.1 mol/L 磷酸鹽(PBS)溶液; (c) 分別固定在光滑碳電極、石墨烯電極和氮摻雜電極上的葡萄糖氧化酶電流-時間曲線， 電壓為—0.15 V， 溶液環(huán)境為0.1 mol PBS 的溶液(pH 值為7.0)， 其中葡萄糖每次添加量為0.1 mmol/L[1]Fig.2.(a) Schematic representation of N-doped graphene.Gray for the carbon atom， blue for the nitrogen atom， and white for the hydrogen atom.(b) Cyclic voltammograms of GOx immobilized on N-doped graphene electrode (solid line) and graphene electrode(dashed line) in N2-saturated 0.1 mol/L phosphate buffered saline (PBS) solution (pH 7.0).Dotted line is for the background.Scan rate is 0.05 V/s.(c) Current-time curves for GOx immobilized on GCE， graphene electrode， and N-doped graphene electrode at—0.15 V in 0.1 mol/L PBS (pH 7.0) with successive addition of 0.1 mmol/L glucose[1].

圖3 (a) 硫化鉬的隧道電子顯微鏡(TEM)圖; (b) 金納米顆粒在硫化鉬上的TEM 圖; (c) 基于金納米顆粒@硫化鉬納米片修飾的光滑碳電極測試不同濃度多巴胺的循環(huán)伏安曲線(1 μM = 1 μmol/L); (d) 氧化峰電流和多巴胺濃度的關(guān)系曲線[60]; (e) 石墨烯-硫化鉬混合物的掃描電子顯微鏡(SEM)圖; (f) 硫化鉬-石墨烯高分辨TEM 圖; (g) 三種不同電極(光滑碳電極、石墨烯在光滑碳電極上、硫化鉬-石墨烯在光滑碳電極上)在5 mmol/L 溶液中的伏安循環(huán)曲線; (h) 不同濃度的對乙酰氨基酚用硫化鉬-石墨烯電極測試的微分脈沖伏安曲線[57]Fig.3.Tunneling electron microscope (TEM) images of the (a) MoS2 and (b) AuNPs@MoS2 nanostructures; (c) differential pulse voltammetric curves of different dopamine (DA) concentrations at AuNPs@MoS2/GCE; (d) plot of oxidation peak currents vs.DA concentrations derived from voltammograms of differential pulse voltammetry (DPV)[60]; (e) scanning electron microscope (SEM)images of MoS2-Gr; (f) high-resolution TEM of MoS2-Gr; (g) CVs of GCE， Gr/GCE and MoS2-Gr/GCE in 5 mmol/L containing 0.1 mol/L KCl; (h) DPVs of 0.1， 0.5， 1.0， 3.0， 5.0， 10， 20， 40， 60， 80 and 100 μmol/L acetaminophen (from bottom to top) at MoS2-Gr/GCE in 0.1 mol/L PBS (pH 7.0) [57].

如圖4(a)和圖4(b)所示， 尿素酶以靜電力吸附在石墨烯上， 避免了對石墨烯的破壞， 也能高效催化尿素的水解反應(yīng).水解反應(yīng)的產(chǎn)物會改變?nèi)芤旱膒H 值， 從而影響石墨烯晶體管的電流值[61].此外， Huang 等[62]用葡萄糖氧化酶和谷氨酸脫氫酶修飾石墨烯場效應(yīng)晶體管， 實現(xiàn)了對葡萄糖和谷氨酸的靈敏檢測.在此工作以后， Kavitha 等[63]開發(fā)了一款更加靈敏的利用氧化鋅納米顆粒修飾石墨烯薄膜的葡萄糖傳感器.酶除了能用于場效應(yīng)晶體管修飾之外， 還能修飾在電化學(xué)傳感器的電極上， 實現(xiàn)高效動態(tài)的生物檢測， 如圖4(c)和圖4(d)所示[64].

圖4 (a) 液體柵極石墨烯場效應(yīng)晶體管示意圖; (b) 由尿素酶連接的多層石墨烯對尿素催化水解反應(yīng)的示意圖[61]; (c) 自組裝辣根過氧化物酶-石墨烯納米片復(fù)合材料示意圖; (d)玻碳電極和辣根過氧化物酶-石墨烯納米片復(fù)合電極對過氧化氫溶液的動態(tài)電學(xué)響應(yīng)[64]Fig.4.(a) Illustration of the solution gated reduced-graphene-oxide FET and the interdigitated channel; (b) schematic of the urease-polyethylenimine multilayer film and the urease-catalyzed hydrolysis of urea[61]; (c) schematic representation of the self-assembled horseradish peroxidase (HRP)-graphene sheets (GSs) hierarchical bionanocomposites on glass carbon electrode and electron transfer process of the composites on the electrode surface; (d) dynamic amperometric response of the modified electrodes to successive additions of H2O2: SGSs electrode (curve a) and HRP-GSs electrode (curve b) in a stirred 0.1 mol/L PBS (pH 7.0) solution containing 1.0 mmol/L hydroquinone[64].

2.4 抗體修飾生物傳感界面

抗體是利用其與抗原的氫鍵來捕獲和識別目標(biāo)分子的， 然后利用場效應(yīng)將檢測物濃度轉(zhuǎn)化為電信號.相比于酶的傳感機制， 抗體的識別范圍更廣，可以識別蛋白質(zhì)、核酸、病毒、小分子化合物等.因此， 基于抗體修飾的生物傳感器也比酶修飾的生物傳感器應(yīng)用更廣.如圖5 所示， 抗體修飾在硫化鉬晶體管的介電層上， 實現(xiàn)了對腫瘤壞死因子α 的有效檢測[65].除硫化鉬以外， 抗體也修飾在其他二維材料的晶體管上來檢測相關(guān)病原體.Mao 等[66]利用金納米顆粒將免疫球蛋白G 抗體連接在還原氧化石墨烯晶體管上， 將探測極限提升到2 ng/mL.Chen 等[67]用金納米顆粒將免疫球蛋白G 抗體修飾在黑磷晶體管上， 取得了優(yōu)異的探測極限(10 ng/mL)和響應(yīng)時間(＜ 10 s).抗體和酶傳感器都利用哺乳動物細胞生產(chǎn)， 這也造成了其成本高， 各批次差異性較大等特點， 對器件性能標(biāo)定造成了較大困難.因此， 實現(xiàn)生物探針的人工合成對于生物傳感器大規(guī)模商業(yè)應(yīng)用至關(guān)重要.

2.5 DNA 及DNA 適配體修飾生物傳感界面

核酸適配體是利用固相合成技術(shù)， 各個批次間差異小， 產(chǎn)品均一性高， 且其生產(chǎn)時間(數(shù)小時)也遠遠小于抗體的生產(chǎn)時間(數(shù)天至數(shù)月).此外， 核酸適配體的識別靶點也遠大于抗體， 可識別離子、多肽、小分子化合物、蛋白質(zhì)、核酸、病毒、細菌、細胞和組織等.所以， 人工篩選的核酸適配體有極好的商業(yè)應(yīng)用前景.DNA 適配體有兩種機制實現(xiàn)生物信號到電信號傳感.第一種情況: 當(dāng)目標(biāo)分子帶電時， DNA 適配體包裹其靠近石墨烯表面， 會在石墨烯內(nèi)部感應(yīng)出與目標(biāo)分子帶電特性相反的電荷， 對石墨烯進行摻雜， 導(dǎo)致其狄拉克點偏移.第二種情況: 由于DNA 適配體獨特的二級和三級結(jié)構(gòu)， 當(dāng)包裹目標(biāo)分子時， DNA 適配體自身的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變， 成為一個穩(wěn)定的緊湊結(jié)構(gòu)， 并產(chǎn)生電子豐富的芳香結(jié)構(gòu)， 這種芳香結(jié)構(gòu)與石墨烯直接相互作用形成π—π 結(jié)構(gòu)， 電子通過π—π 鍵從DNA適配體直接轉(zhuǎn)移到石墨烯中， 從而改變石墨烯內(nèi)部載流子濃度密度， 引入n 型摻雜， 轉(zhuǎn)移特性曲線左移.

圖5 (a) 硫化鉬場效應(yīng)晶體管生物傳感器示意圖， 其中功能層用氧化鉿和抗體修飾， 用于檢測腫瘤壞死因子α (TNF-α); (b) 硫化鉬晶體管的光學(xué)照片， 溝道長5 μm， 寬6 μm; (c) 集成微流道系統(tǒng)的生物傳感器光學(xué)照片; (d) 硫化鉬晶體管在不同濃度TNFα 下的轉(zhuǎn)移曲線[65]Fig.5.(a) Functionalization of the HfO2 effective layer with antibody receptors and subsequent TNF-α detection; (b) an exemplary MoS2 transistor with channel length (L) and width (W) of 5 μm and 6 μm， respectively; (c) a transistor biosensor integrated with a microfluidic channel system connected with an inlet/outlet tubing kit， which is driven by a motorized syringe pump; (d) transfer characteristics of an exemplary MoS2 transistor sensor measured at various biodetection stages， following the sequence of bare transistor， antibody functionalization， and inputs of TNF-α solutions with concentrations of 60 fmol/L (fM)， 300 fmol/L， 600 fmol/L，3 pmol/L (pM)， and 6 pmol/L[65].

適配體結(jié)合石墨烯超高的遷移率， 適配體石墨烯FET 將會是一個檢測范圍廣、特異性強、靈敏度高、檢測極限低的生物傳感器件.最初， Ohno等[8]將免疫球蛋白適配體修飾到石墨烯FET 溝道上， 實現(xiàn)了對免疫球蛋白的靈敏檢測， 檢測極限為0.29 nmol/L.此后， 一系列放大信號的方法被開發(fā)， Kim 等[68]將金納米顆粒修飾在被檢測物質(zhì)(抗原63 5-12)上， 當(dāng)目標(biāo)物被適配體捕獲后， 金納米顆粒進一步提升石墨烯溝道導(dǎo)電性， 檢測極限被降低到1.2 amol/L， 如圖6(a)所示.Gao 等[69]提出了利用核酸循環(huán)擴增反應(yīng)提升傳感器信噪比的方案， 將檢測極限降低到50 amol/L.

除了DNA 適配體用于生物檢測外， DNA 單鏈也可以修飾FET 傳感器來精準(zhǔn)檢測某一特定序列DNA 鏈.如圖7 所示， 一個石墨烯陣列生物傳感器被集成在電路板上， 頂上裝配了一個用PDMS制成的微流道通道.此外他們開發(fā)了一項選擇性修飾DNA 探針的技術(shù)， 利用這種技術(shù)可以選擇修飾的位點.利用DNA 選擇性修飾技術(shù)， 這個裝置可實現(xiàn)對流過微流道的同一液體分別檢測不同DNA的濃度[70].近年來， 利用DNA 折紙技術(shù)可以在傳感界面處構(gòu)筑形態(tài)各異的分子級結(jié)構(gòu)， 有效改善器件靈敏度和檢測極限.

2.6 磷脂膜修飾生物傳感界面

在生物傳感過程中， 通常需要受體分子來識別和捕獲目標(biāo)分子.如果這些受體分子處于生物友好的環(huán)境(磷脂細胞膜)中， 其探測性能可以得到優(yōu)化.如圖8 所示， 活性磷脂分子能以微米級精度在石墨烯襯底表面特定的位置組裝出特定尺寸的薄膜.在磷脂膜上的鍵對碳具有親和力， 使其在石墨烯襯底上的流平性非常好， 可以形成單分子層磷脂膜.并且磷脂薄膜可以連接一些官能團， 這也使得磷脂膜擁有修飾納米生物探針的能力， 證明了它在生物傳感上擁有的巨大潛力.如圖8(d)所示， 鏈霉親和素可以特異性地連接在磷脂膜上而不連接在牛血清蛋白上.通過鏈霉親和素的特異性修飾， 可將所需要的抗體連接到鏈霉親和素上， 從而制備一個具有特異性識別能力的石墨烯生物傳感器[71].在傳感界面處精準(zhǔn)構(gòu)筑這類生物分子， 可以有效調(diào)控傳感過程中的背景環(huán)境， 為傳感過程提供一個更加友好的生物環(huán)境.

圖6 (a) 適配體修飾在石墨烯場效應(yīng)晶體管用于抗原檢測的示意圖; (b) 狄拉克點偏移電壓與抗原濃度的關(guān)系圖; (c) 漏端電流變化值與抗原濃度的關(guān)系圖， 檢測器件為適配體修飾的石墨烯FET 和抗體修飾的石墨烯FET[68]Fig.6.(a) Schematic illustration of the aptamer-immobilized graphene FET for detection of protective antigen (PA); (b) Vg，min shift(ΔVg，min) vs.PA concentration in PBS solutions with different probe molecules.The ΔVg，min value was obtained by calculating the difference in charge neutrality point， Vg，min， as a reference for the device with no binding of PA; (c) change in the minimum sourcedrain current (Ids，min)， ΔIds， min/ × 100 (%) vs.PA concentration.Here， is the Ids，min for the device with no binding of PA[68].

2.7 有機小分子修飾生物傳感界面

生物傳感器通常大多數(shù)靠抗體、DNA、核酸適配體等受體分子來捕獲目標(biāo)物， 從而對FET 的溝道表面進行電學(xué)摻雜.但面對一些壽命很短的檢測物時， 利用受體分子檢測目標(biāo)分子的方法就會失效.當(dāng)檢測物壽命很短時， 利用剪切反應(yīng)則能快速檢測目標(biāo)分子.圖9 所示為一個超高靈敏度的羥基自由基的石墨烯FET 傳感器.羥基自由基超高的反應(yīng)活性和超短的壽命阻礙對其進行高靈敏度的檢測.這個器件則是利用羥基自由基的內(nèi)剪切反應(yīng)來改變原卟啉對石墨烯溝道的電學(xué)摻雜， 從而實現(xiàn)超低檢測極限(10—9mol/L)的實時檢測(2 s).這種在傳感界面處精確構(gòu)筑一些化學(xué)小分子， 從而精準(zhǔn)控制被檢測分子的相關(guān)化學(xué)反應(yīng)， 為超短壽命物質(zhì)的檢測提供了有效而可靠的方法[72].

2.8 二維材料的三維結(jié)構(gòu)界面構(gòu)筑

生物傳感過程中， 除了對表面進行修飾不同的生物探針來構(gòu)筑傳感界面之外， 還可以對二維材料的幾何結(jié)構(gòu)進行改造， 構(gòu)建一些基于二維材料的三維結(jié)構(gòu)來提升傳感界面的性能.如圖10 所示，Hwang 等[73]利用預(yù)拉伸襯底， 然后在110 ℃下退火， 石墨烯隨著柔性襯底一起褶皺， 產(chǎn)生納米結(jié)構(gòu)的褶皺石墨烯薄膜.這類具有納米結(jié)構(gòu)的石墨烯薄膜有效增加了傳感界面的德拜長度， 在褶皺結(jié)構(gòu)的凹陷處， 其德拜長度遠大于平坦石墨烯的德拜長度.因此， 凹陷處DNA 鏈將有更多的堿基對能夠?qū)κ┊a(chǎn)生電學(xué)摻雜效應(yīng)， 極大提升了傳感信號， 降低了生物傳感器的檢測極限(檢測極限為600 zmol/L 在緩沖溶液中， 20 amol/L 在人血清溶液中).

圖7 (a) 石墨烯場效應(yīng)晶體管陣列帶有一個微流道通道的示意圖; (b) 器件界面示意圖; (c) 器件光學(xué)顯微鏡圖; (d) DNA 探針修飾示意圖， 兩種DNA 通過?；Ｑ宓鞍缀玩溍褂H和素連接到石墨烯表面， 其中一種DNA 修飾熒光分子Cy3， 另外一種修飾熒光分子Cy5.先分別在奇數(shù)位點施加+1.2 V 電壓， 偶數(shù)位點施加—1.2 V 電壓， 將帶有Cy3 的DNA 探針固定到奇數(shù)位點; 然后在偶數(shù)位點加+1.2 V 偏壓， 奇數(shù)位點不加偏壓， 帶有Cy5 的DNA 探針被固定到偶數(shù)位點上; (e)帶有Cy3 和Cy5 的FET 陣列的共聚焦熒光成像圖， 其中Cy3 發(fā)出紅色熒光， Cy5 發(fā)出綠色熒光[70]Fig.7.(a) Illustration and image of an 8-graphene-electrode/FET array with a microfluidic channel on top.This entire device sits on a printed circuit board.(b) Cross-sectional illustration of an individual graphene site.(c) Optical micrograph of a portion of a fabricated graphene array.For an individual graphene site， W = 90 μm and L = 45 μm (scale bar， 120 μm).(d) During the immobilization of Cy3-labelled probe DNA and associated streptavidin， even- (odd-) numbered sites are biased at 1.2 V (—1.2 V) (20 and 120 s for streptavidin and Cy3-labelled probe DNAs， respectively).During the subsequent immobilization of Cy5-labelled probe DNAs and associated streptavidin， the even- (odd-) numbered sites are left unbiased (biased at 1.2 V)， with the same timing scheme as before.(e) Confocal fluorescence image (false coloured) of the array with Cy3 and Cy5 probe DNAs shown， respectively， as red and green， and the corresponding normalized fluorescence intensity.The averaged fluorescence intensities across the four evennumbered and four odd-numbered graphene sites with Cy5 intensity are normalized to the maximum Cy3 intensity; *P ＜ 0.05; **P ＜0.01; error bars represent ± 1 s.d.Scale bar， 100 μm[70].

3 光學(xué)生物傳感界面構(gòu)筑

光學(xué)生物傳感器主要分為兩種， 一種是利用具有熒光猝滅能力的二維材料制備的熒光生物傳感器[20-24]， 另一種是利用二維材料的強等離激元共振(surface plasmon resonance， SPR)效應(yīng)制備的SPR 生物傳感器[74，75].一些典型的二維材料如氧化石墨烯、石墨烯和二硫化鉬等， 在能量轉(zhuǎn)移體系中是優(yōu)良的能量受體.染料上的能量易于轉(zhuǎn)移到這些二維材料上， 導(dǎo)致熒光猝滅.基于此原理， 被熒光標(biāo)記過的DNA 或者核酸適配體作為識別單元修飾在二維材料上， 可用于DNA、蛋白質(zhì)和其他生物小分子的檢測.此外， 相較于傳統(tǒng)金屬薄膜的SPR， 二維材料的SPR 對于光相位變化十分靈敏.基于這一原理， 在二維材料表面修飾一些生物探針， 當(dāng)其捕獲到目標(biāo)分子時， 二維材料界面處SPR的相位變化十分劇烈， 可實現(xiàn)對一系列生物分子的高靈敏傳感.相較于電學(xué)生物傳感器， 光學(xué)生物傳感器信號更穩(wěn)定， 可以避免溫漂等因素的干擾.但是光學(xué)生物傳感器測試系統(tǒng)較為復(fù)雜和龐大， 難以將器件微型化.

圖8 磷脂膜在二氧化硅和石墨烯上的示意圖 (a) 部分區(qū)域單層、部分區(qū)域雙層的磷脂膜在二氧化硅上; (b) 雙層磷脂膜修飾在石墨烯表面; (c) 在石墨烯襯底上的單層磷脂分子被牛血清分子包圍; (d) 鏈霉親和素被特異性綁定在生物酰化的基團上， 牛血清蛋白阻止了鏈霉親和素的非特異性綁定[71]Fig.8.Proposed membrane organization on silicon dioxide and graphene.1， 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) headgroups are marked in red， Biotin-PE headgroups in green.(a) Base monolayer and additional bilayer on silicon dioxide in air;(b) single bilayer on graphene in air and (c) monolayer of phospholipids on graphene surrounded by bull serum albumin (BSA) layer under water; (d) streptavidin can later be bound to the biotinylated headgroups of the phospholipids from solution with BSA and DOPC preventing unspecific binding to the substrate[71].

圖9 (a) 石墨烯FET 傳感器傳感機制示意圖; (b) 液柵晶體管I-V 曲線， 四條曲線分別為純石墨烯晶體管轉(zhuǎn)移曲線(黑色)， 經(jīng)歷金納米顆粒/半胱胺-原卟啉修飾石墨烯FET 的轉(zhuǎn)移曲線(紅色)， 經(jīng)歷金屬離子修飾后石墨烯FET 的轉(zhuǎn)移曲線(10—4 mol/L Cd+， 綠色)， 經(jīng)歷剪切反應(yīng)后石墨烯FET 的轉(zhuǎn)移曲線(10—4 mol/L·OH， 藍色); (c)， (d) 石墨烯/金/半胱胺-原卟啉傳感器對鉻離子和羥基的實時響應(yīng)曲線 (1 M = 1 mol/L)[72]Fig.9.Detection performance and mechanism of the FET sensor: (a) Schematic diagram of the ·OH detection; (b) liquid gate transfer curves of a FET device of pristine graphene (black)， after decoration of gold nanoparticle/cysteamine-protoporphyrin (red)， after metallic ions (10—4 mol/L Cd2+， green)， and after shear reaction (10—4 mol/L ·OH， blue)， when liquid gate voltage (Vg) varies from—400 to 800 mV; (c)， (d) real-time electrical responses of a graphene/Au/Cys-PP FET device upon successive addition of Cd2+ and subsequent ·OH[72].

3.1 等離激元共振傳感界面構(gòu)筑

圖10 (a)平坦石墨烯晶體管DNA 傳感器和褶皺石墨烯晶體管DNA 傳感器的截面示意圖， 黑色為探針DNA， 紅色為目標(biāo)DNA 鏈， 藍色線代表德拜長度， 在凹陷結(jié)構(gòu)中的DNA 鏈有更長的部分在德拜長度以內(nèi); (b)平坦石墨烯晶體管和褶皺石墨烯晶體管的制作流程示意圖; (c)狄拉克點偏移量與被測DNA 濃度關(guān)系圖 (1 M = 1 mol/L); (d)在人血清中， 石墨烯狄拉克點偏移與被測DNA 濃度關(guān)系圖[73]Fig.10.(a) Cross-sectional scheme of the flat (left) and crumpled (right) graphene FET DNA sensor.Probe (black) and target (red)DNA strands are immobilized on the surface of graphene.The blue dot lines represent Debye length in the ionic solution and the length is increased at the convex region of the crumpled graphene， thus more area DNA is inside the Debye length， which makes the crumpled graphene more electrically susceptible to the negative charge of DNA.(b) Fabrication of FETs and experimental process flow.Graphene on pre-strained PS substrate was annealed at 110 °C to shrink the substrate and crumple the graphene.Then source and drain electrodes were applied and solution-top gate was used.In case of flat graphene FET， the annealing process was omitted.(c) Dirac voltage shift of the FET sensor with detection of hybridization using DNA probe.NC is non-complementary control sequences used in the experiments.(d) Dirac voltage shift of the FET sensor with miRNA detection of hybridization.Target RNA spiked in human serum was treated on the FET sensor.Human serum is complex mixture of biological components[73].

光學(xué)生物傳感器的界面修飾工程和電學(xué)生物傳感器是相似的， 都是通過表面的DNA 鏈或者適配體來捕獲目標(biāo)分子(DNA、生物分子、金屬離子等).但是， 基于光學(xué)原理的生物傳感器在捕獲目標(biāo)分子后產(chǎn)生的通常是光學(xué)信號的變化， 比如表面等離激元共振吸收峰的偏移、熒光猝滅等.如圖11所示， Zeng 等[76]構(gòu)筑了一個石墨烯-金的超表面結(jié)構(gòu)， 在表面等離激元導(dǎo)致電場最強時， 產(chǎn)生了一個相位奇變點， 這一奇變點對石墨烯-金周圍介質(zhì)極度靈敏， 當(dāng)有物質(zhì)吸附到石墨烯表面， 奇變點處的相位就會產(chǎn)生很大的變化.此外， 利用石墨烯的SP2軌道雜化結(jié)構(gòu)， 可與帶有苯環(huán)的生物分子形成π-π 相互作用， 有效地捕獲一些生物分子， 如DNA、細胞因子等.Kravets 等[77]利用石墨烯與金納米錐陣列形成的強耦合， 在600 nm 處產(chǎn)生一個強相位奇點， 實現(xiàn)單分子檢測.除了利用生物探針捕獲檢測物之外， 分子的振動指紋也可以用于檢測化學(xué)分子.Daniel 等[78]利用石墨烯納米帶陣列在中紅外產(chǎn)生的強等離激元， 放大了分子振動的吸收峰， 實現(xiàn)了對化學(xué)分子的精準(zhǔn)識別.

3.2 熒光共振能量轉(zhuǎn)移生物傳感界面構(gòu)筑

由于石墨烯具有很強的熒光猝滅能力(遠超過傳統(tǒng)有機材料)和生物相容性， 基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的石墨烯生物傳感器也引起了大量的研究.他們被廣泛應(yīng)用在DNA、蛋白質(zhì)和金屬離子的檢測中.金屬離子檢測主要基于其與寡核苷酸相互作用這一原理.例如， 基于銀離子與胞嘧啶、汞離子與胸腺嘧啶特殊的相互作用， 一系列銀離子與汞離子傳感器被制造.如圖12(a)所示， Wen 等[79]利用含有胞嘧啶的寡核苷酸與氧化石墨烯(GO)耦合形成的生物傳感器檢測銀離子.當(dāng)銀離子被添加進溶液中， 帶有熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)， 增加了氧化石墨烯與熒光分子的距離， 使其不再被氧化石墨烯猝滅.熒光強度提供了銀離子量化的可讀數(shù)據(jù)， 這個傳感器展示了優(yōu)異的特異性識別能力和較低的檢測極限(5 nmol/L)， 這一濃度達到了美國環(huán)境保護機構(gòu)飲用水的標(biāo)準(zhǔn).其他科研人員也利用這一傳感機制并進一步調(diào)節(jié)器件設(shè)計， Cui 等[80]利用石墨烯量子點作為熒光標(biāo)記替代傳統(tǒng)的熒光染料， 發(fā)展了一個超靈敏的汞離子傳感器.

圖11 (a) 石墨烯超表面設(shè)計， 將石墨烯沉積在金表面; 為了激發(fā)石墨烯-金界面處表面等離激元極化， 一束光通過一個玻璃棱鏡照射在50 nm 金薄膜上， 然后反射到另外一個面; 金納米顆粒連接到DNA 上作為SPR 增強的標(biāo)簽; (b) 光的反射率(黑線)和相位(紅線)作為光照射在石墨烯-金界面處入射角的函數(shù)， 其中， 相位在SPR 曲線最小值處經(jīng)歷了一個奇變點; (c) 對比了純石墨烯和石墨烯加金納米顆粒(石墨烯先利用π-π 相互作用與DNA 連接， 然后將金納米顆粒連接到DNA 上， 從而增強DNA 檢測信號)兩種器件對單鏈DNA 濃度檢測的信號強度[76]Fig.11.Designs of graphene-gold metasurface architectures.(a) Basic architecture with a layer of graphene deposited on the gold surface.To excite surface plasmon polariton over the graphene-gold interface， a light beam is typically passed through a glass prism and reflected from a 50 nm gold film deposited on one of its facets.(b) Calculated reflectivity (black) and phase (red) of light as functions of the angle of light incidence of the gold-graphene interface， corresponding to maximum probing field.Phase experiences a sharp singularity in the minimum of SPR curve.(c) Response and magnitude of enhancement (in the bracket) obtained with(circles) and without (squares) exposing the monolayer graphene-coated sensing film to positive-charged Au NPs after ssDNA[76].

圖12 (a) 銀離子熒光傳感器示意圖， 特異性識別銀離子的DNA 鏈在和銀離子相互作用后導(dǎo)致DNA 鏈構(gòu)型改變， 從而DNA 鏈從氧化石墨烯上脫附， DNA 所攜帶的熒光分子產(chǎn)生熒光[79]; (b) 鉛離子調(diào)節(jié)DNA 酶與氧化石墨烯的相互作用的示意圖[81]; (c) 汞離子探測機制示意圖[82]Fig.12.(a) Schematic illustration of the fluorescence sensor for Ag+ ions based on the target-induced conformational change of a SSO and the interactions between the fluorogenic silver-specific oligonucleotide probe and graphene oxide (GO)[79].(b) Schematic for the Pb2+-modulated interactions between DNAzyme and GO.Inset is the fluorescence spectrum of a mixture of DNAzyme and GO upon interaction with 0 mol/L (top curve) and 2 mmol/L (bottom curve) of Pb2+ in a Tris-HCl buffer (50 mmol/L， pH = 7.4) solution containing 50 mmol/L NaCl[81].(c) Schematic of the proposed detection mechanism (for clarity， pristine graphene is used to represent GO)[82].

酶和氧化石墨烯的耦合功能化也構(gòu)建了一些新型熒光生物傳感器.如圖12(b)所示， Fan 等[81]研究了鉛離子與8-17 DNA 酶的相互作用， 他們基于鉛離子可剪切17S 鏈原理， 從而調(diào)節(jié)8-17 DNA酶與氧化石墨烯相互作用， 制備了一個靈敏的鉛離子傳感器.被剪切后的DNA 酶變成DNA 單鏈被吸附在氧化石墨烯表面， 熒光標(biāo)記被氧化石墨烯猝滅， 從而通過猝滅的熒光信號強度來量化鉛離子濃度[81].除此之外， 為了進一步改善傳感器靈敏度，許多信號擴增方法被嘗試.一個典型的信號擴增方案是利用雜化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來實現(xiàn)熒光信號擴增， 如圖12(c)所示.兩個發(fā)夾探針和一個輔助DNA 被設(shè)計和應(yīng)用， 當(dāng)汞離子被加入溶液中， 雜化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)通過汞離子和輔助DNA 開啟.雜化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生的雙鏈DNA 從氧化石墨烯表面脫附， 熒光信號被檢測到.這類基于雜化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的傳感器展現(xiàn)了高的靈敏度和選擇性， 檢測極限為0.3 nmol/L， 展示了其在生物檢測中極大的潛力[82].

4 結(jié) 論

二維材料自石墨烯被發(fā)現(xiàn)以來， 由于具有高表面積、穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)和優(yōu)異的電子轉(zhuǎn)移能力， 使其在生物傳感領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注， 目前也已經(jīng)出現(xiàn)大量相關(guān)研究報道.在這些基于二維生物傳感的研究中， 不乏一些高性能和高穩(wěn)定性的器件出現(xiàn)，初步滿足了實際應(yīng)用的需求.未來以下3 個方向還需要進一步研究.

1)當(dāng)前二維材料價格昂貴， 高質(zhì)量單晶二維材料的大面積生長仍然存在問題.探索低成本、高質(zhì)量、大面積的高效合成方法是推動二維材料實際應(yīng)用的重要課題.

2)二維材料傳感功能界面構(gòu)筑通常利用化學(xué)方法實現(xiàn)， 缺點是難以精準(zhǔn)控制傳感功能界面的生物探針位置與密度， 從而導(dǎo)致各批次器件的均一性還不夠理想.因此， 對于傳感功能界面生物探針位置及密度的精確控制至關(guān)重要.

3)與實際需求結(jié)合， 發(fā)展二維生物傳感器的商業(yè)化示范應(yīng)用， 為最終大規(guī)模應(yīng)用打開突破口.