李 彬，李素芬，王唯斯，楊 娜，自加吉，熊 偉,2

惡性胸膜間皮瘤中間皮素表達的臨床病理相關(guān)性及其預(yù)后意義

李 彬1，李素芬1，王唯斯1，楊 娜1，自加吉3，*熊 偉1,2

（1. 大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，云南，大理 671000；2．云南省高校臨床生物化學(xué)檢驗重點實驗室，云南，大理 671000；3. 大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，云南，大理 671000）

通過探討間皮素（MSLN）與惡性胸膜間皮瘤臨床病理之間的相關(guān)性及其預(yù)后意義。采用R 3.6.3對美國公共癌癥基因數(shù)據(jù)庫（TCGA）進行數(shù)據(jù)挖掘和分析，利用Oncomine數(shù)據(jù)庫對非癌組織與癌組織中MSLN的表達量進行比較分析，采用基因表達譜動態(tài)分析（GEPIA）構(gòu)建Kaplan-Meier生存模型探究MSLN表達量對惡性胸膜間皮瘤患者預(yù)后的影響，使用cBioportal進行MSLN基因相關(guān)性可視化分析。結(jié)果表明，MSLN在正常組織中低表達，惡性胸膜間皮瘤組織中高表達；MSLN的表達水平與惡性胸膜間皮瘤的腫瘤類型及組織學(xué)診斷類型相關(guān)；在MPM患者中，MSLN高表達的患者總生存率顯著高于MSLN低表達的患者。因此，間皮素有望作為惡性胸膜間皮瘤診斷或治療的潛在新靶點。

惡性胸膜間皮瘤；間皮素；數(shù)據(jù)挖掘；預(yù)后意義

惡性間皮瘤（Malignant mesothelioma, MM）是一種較為罕見的、具有高度侵襲性的漿膜表面腫瘤，多發(fā)于胸膜間皮[1]。胸膜間皮瘤是由環(huán)境、生物和遺傳因素引起的腫瘤。流行病學(xué)和實驗數(shù)據(jù)都清楚地證明了石棉暴露與惡性間皮瘤發(fā)生之間的關(guān)系[1]。惡性胸膜間皮瘤（Malignant pleural mesothelioma, MPM）預(yù)后較差，5年內(nèi)患者的生存率僅為5％左右[2]。胸膜腔積液是惡性胸膜間皮瘤的主要發(fā)病方式，并且其誤診率較高，大多被誤診為肺結(jié)核，惡性胸膜間皮瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移規(guī)律不同于一般肺癌[3]。目前，MPM的診斷標(biāo)準(zhǔn)主要為胸腔鏡活檢，缺乏較為便捷以及靈敏度高的血清學(xué)標(biāo)志物檢測。因此，發(fā)掘新的腫瘤標(biāo)志物能有效提升早期MPM的檢出率，從而為患者提供及時的治療。

間皮素（mesothelin，MSLN）是在分離單克隆抗體(Mab)K1時發(fā)現(xiàn)的一種分子質(zhì)量為40 kDa的細胞膜糖蛋白[4]，其在胸腹腔及心包間皮細胞中呈低表達，但在肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中高表達[5]，因此，間皮素可以作為診斷或治療此類特異性較高的腫瘤的血清學(xué)標(biāo)志物[6-7]。大量的研究發(fā)現(xiàn)，MPM屬于特異性較強的惡性腫瘤，單一的生物學(xué)標(biāo)志物無法準(zhǔn)確進行診斷[8]。MSLN表達與MPM的相關(guān)性及作用機制尚不明確，本研究利用美國公共癌癥基因數(shù)據(jù)庫（The Cancer Genome Atlas, TCGA）和Oncomine基因芯片數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)挖掘，并分析討論MSLN與MPM之間的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫中篩選目的基因在腫瘤與非瘤組織中的相關(guān)性

Oncomine 數(shù)據(jù)庫(http://www.oncomine.org) 是目前最大的腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)獲取平臺，可用于進行基因表達差異分析，離群值分析、組織類型分類等數(shù)據(jù)分析處理功能，本研究中，在Oncomine數(shù)據(jù)庫中設(shè)置搜索條件為①“Gene:”；②“Analysis Type: Cancer vs. Normal Analysis”；③“Cancer Type: Othere Cancer- Mesothelioma-Pleural Malignant Mesothelioma ”；④“Simple Type: Clinical Specimen”。

1.2 在TCGA數(shù)據(jù)庫中收集惡性胸膜間皮瘤數(shù)據(jù)

使用R 3.6.3軟件，利用Epicalc函數(shù)包從美國公共癌癥基因數(shù)據(jù)庫TCGA（http://tcga-adtaa. nci.nih.gov/tcga/）下載并預(yù)處理惡性胸膜間皮瘤的數(shù)據(jù)集，進行表達量的分析，同時下載臨床病理資料數(shù)據(jù)，進行臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析。

1.3 TCGA乳腺癌數(shù)據(jù)集篩選和臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)性分析

通過R 3.6.3下載得到數(shù)據(jù)集MSLN-meso_ tcga，其中包含87例關(guān)于胸膜間皮瘤的樣本病例。通過對應(yīng)臨床數(shù)據(jù)資料進行對比篩選分析，剔除缺失數(shù)據(jù)及無效數(shù)據(jù)，僅保留TCGA數(shù)據(jù)庫中完整有效的數(shù)據(jù)集82例。根據(jù)測序結(jié)果分析，惡性胸膜間皮瘤組織樣本中MSLN的表達量為11.26~108975.7，中位數(shù)為14905.26，以該表達量中位數(shù)為界限，樣本MSLN表達量高于中位數(shù)，則定義為MSLN高表達（high）；反之，則定義為MSLN低表達（low），根據(jù)這個定義，間皮瘤組織中MSLN高表達41例，低表達41例。

1.4 間皮瘤分子病理分型

TCGA數(shù)據(jù)集根據(jù)間皮瘤的病理學(xué)分型將其分為3類分子分型。（1）肉瘤樣型Sarcomatoid Type；（2）上皮樣型Epithelioid Type；（3）雙向混合型Biphasic Type。

1.5 MSLN表達水平與惡性胸膜間皮瘤患者的預(yù)后相關(guān)性

為探究MSLN的表達量與惡性胸膜間皮瘤之間的預(yù)后關(guān)系，本研究采用基因表達譜動態(tài)分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis, GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn)數(shù)據(jù)庫對數(shù)據(jù)構(gòu)建Kaplan-Meier模型，從而探究MSLN與MPM之間的預(yù)后關(guān)系。

1.6 MSLN的相關(guān)性研究

cBioportal（http://www.cbioportal.org/）是基于公共數(shù)據(jù)庫研究分析癌癥基因數(shù)據(jù)的可視化工具，通過自定義數(shù)據(jù)從而探求基因改變和臨床之間的聯(lián)系，并使其可視化。通過選擇間皮瘤和MSLN，可得出MSLN于其他基因的相關(guān)性可視化分析圖。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

建立間皮瘤患者的臨床病理數(shù)據(jù)集，將患者年齡、性別、AJCC 病理分期、T分期、M分期、N分期、癌癥類型、組織學(xué)診斷和MSLN表達量進行量化賦值，結(jié)果見表1。采用R 3.6.3進行統(tǒng)計學(xué)分析及繪圖，使用Shapiro-Wilk檢測癌組織中MSLN 表達水平兩組數(shù)據(jù)正態(tài)分布情況，結(jié)果顯示MSLN表達水平不符合正態(tài)分布。因此，間皮瘤組織的 MSLN表達水平的比較采用 Mann-Whitney U 非參數(shù)檢驗，臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析，組間比較采用χ2檢驗及Fisher 精確概率法，生存分析采用 Kaplan-Meier模型。

表1 惡性胸膜間皮瘤患者預(yù)后影響因素及其賦值關(guān)系

Table 1 Prognostic factors influencing patients with malignant pleural mesothelioma and their relationship

影響因素賦值說明 年齡≤60歲=1，＞60歲=2 性別男=1，女=2 T分期T1+T2=1，T3+T4=2，TX=3 N分期N0=0，N1=1，N2=2，N3=3 ，NX=4 M分期M0=0，M1=1，MX=2 AJCC 病理分期I+Ⅱ期=1，Ⅲ+Ⅳ期=2 癌癥類型肉瘤樣型=1，上皮樣型=2，雙向混合型=3 組織學(xué)診斷肉瘤樣型=1，上皮樣型=2，雙向混合型=3 MSLN表達量生存時間生存狀態(tài)低表達=1，高表達=2實際生存時間（月）存活=0，死亡=1

2 結(jié)果

2.1 MSLN的表達量在正常細胞與MPM中的差異

通過Oncomine數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)篩選分析，所得結(jié)果顯示正常組織及有關(guān)惡性胸膜間皮瘤的共54個樣本中，結(jié)果顯示，與正常的肺組織和正常胸膜組織相比，惡性胸膜間皮瘤中MSLN的表達量與中的表達升高，組間有顯著差異（Fold change=15.497,=2.37×10-5），如圖1所示。

1：正常肺組織 2：正常胸膜組織 3：惡性胸膜間皮瘤

2.2 惡性胸膜間皮瘤組織中MSLN的表達及其臨床病理相關(guān)性

在TCGA 數(shù)據(jù)庫下載并整理得到臨床病理參數(shù)完整82例惡性胸膜間皮瘤病例資料，其中女性 16例，男性66例，年齡28~81歲，中位年齡64歲。對該數(shù)據(jù)集中乳腺癌患者預(yù)后的各影響因素進行賦值，通過統(tǒng)計學(xué)分析，其中惡性胸膜間皮瘤組織中MSLN 低表達41 例，高表達41 例。MSLN表達量與MPM患者的癌癥類型(＜0.001)以及組織學(xué)診斷類型(＜0.001)存在顯著相關(guān)性，而與患者的年齡、性別、T分期、N分期、M分期、AJCC 病理分期均無顯著相關(guān)性(均> 0.05)，詳見表2。

表2 MSLN表達量與惡性胸膜間皮瘤臨床病理特征的相關(guān)性

Table 2 Correlation between MSLN expression and clinicopathological features of malignant pleural mesothelioma

病理因素例數(shù)MSLN 表達P值χ2 低表達高表達 年齡（歲） 0.6490.210 ≤ 60311417 ＞60612724 性別 1.0000.000 女1688 男 66 33 33 T 分期（期） 0.502- T1+T2371423 T3+T443 26 17 TX211 N 分期（期） 0.148- N0412219 N11055 N2 24 816 N3 3 3 0 NX 4 3 1 M 分期（期） 0.316- M0532924 M1 2 0 2 MX 27 12 15 AJCC 病理分期（期） 0.7290.834 I+II251114 III+Ⅳ57 30 27 腫瘤類型 < 0.001- 上皮型220 肉瘤型57 21 36 混合雙向型23 18 5 組織學(xué)診斷 < 0.001- 上皮型220 肉瘤型57 21 36 混合雙向型23 18 5

2.3 MSLN表達水平與惡性胸膜間皮瘤患者的預(yù)后相關(guān)性

使用GEPIA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建Kaplan-Meier模型，結(jié)果表明，MSLN的表達對惡性胸膜間皮瘤患者的總生存率（OS）預(yù)后有影響（< 0.05），當(dāng)MSLN在腫瘤組織中低表達時，患者預(yù)后差；反之，MSLN高表達的患者預(yù)后較好。MSLN的表達水平對MPM患者的無疾病進展生存率（DFS）無顯著影響（> 0.05），如圖2所示。

A: overall survival: 總體生存率

B: disease free survival：無病生存率

圖2 MSLN表達量與總生存率的關(guān)系

Fig. 2 Relationship between MSLN expression and overall survival rate

2.4 胸膜間皮瘤中MSLN基因與其他基因表達的相關(guān)性

通過可視化分析，得出與MSLN基因表達相關(guān)性最高的9個基因，分別為ANXA8、BICDL1、CLDN15、COBL、FBXO2、PDZK1IP1、RSPO1、UPK1B、VSIR。經(jīng)分析，以上9種基因均與MSLN基因的表達有顯著性關(guān)聯(lián)（< 0.05），且均為正相關(guān)，即MSLN基因的表達量越高，則相關(guān)基因的表達量也越高，結(jié)果如圖3所示。

3 討論

惡性胸膜間皮瘤（MPM）是一種罕見的胸腔惡性腫瘤，起源于胸膜腔的間皮細胞[9]。MPM總體預(yù)后較差，上皮型MPM預(yù)后相對較好，肉瘤型預(yù)后最差，未經(jīng)治療的MPM中位生存期為12個月，6個月、1年和5年的生存率分別為55%、33%和5%[10]。本研究通過數(shù)據(jù)挖掘分析了間皮素（MSLN）的表達與惡性胸膜間皮瘤發(fā)生之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)MSLN在正常肺組織或胸膜組織中均呈現(xiàn)低表達，在MPM組織中呈現(xiàn)高表達，并且MSLN的表達量與腫瘤的病理類型以及組織學(xué)診斷類型有顯著相關(guān)性。然而，本研究的預(yù)后生存分析結(jié)果顯示，MSLN高表達的MPM患者總生存率明顯高于MSLN低表達的患者。吳海凈等利用病理診斷為胸膜間皮瘤及隨訪資料齊全的38例病例，研究間皮素的表達對惡性胸膜間皮瘤預(yù)后的影響，結(jié)果表明，間皮素高表達的患者的總生存期低于間皮素低表達的患者[11]。我們分析產(chǎn)生這種差異的原因可能有以下幾點：（1）本研究中使用的TCGA間皮瘤數(shù)據(jù)集中提供的是間皮素基因mRNA表達水平，而吳海靜等的研究采用免疫組化化學(xué)染色的方法，檢測的是間皮瘤組織中間皮素蛋白的表達水平。間皮素mRNA表達水平和蛋白質(zhì)表達水平對患者預(yù)后的影響可能存在一定的差異。（2）兩項研究中高表達和低表達分組的標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù)不一樣。本研究使用的數(shù)據(jù)是基于RNA二代測序結(jié)果，以間皮素mRNA表達量的三等分?jǐn)?shù)值為截斷值，進行高表達、中表達和低表達分組。吳海靜等的研究則是基于免疫組織化學(xué)評分結(jié)果劃分高表達和低表達組，導(dǎo)致患者預(yù)后分析的結(jié)果與本研究存在差異。（3）研究對象的樣本數(shù)的不同導(dǎo)致出現(xiàn)預(yù)后分析結(jié)果差異。本研究分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中82例患者的間皮素mRNA二代測序數(shù)據(jù)，而吳海靜等的研究結(jié)果是基于38例間皮瘤患者間皮素蛋白的表達水平來進行預(yù)后分析。因此，本研究結(jié)果提示，單一的間皮素檢測可能并不利于對患者預(yù)后進行評估和預(yù)測。間皮素與其他腫瘤生物學(xué)標(biāo)記物的聯(lián)合檢測，可能會相互彌補，提高預(yù)后判斷價值，減低患者的死亡率。

目前，血清可溶性間皮素相關(guān)肽（SMRP）已被提議作為MPM的診斷或預(yù)后生物標(biāo)志物[12]，而MSLN基因變異可以影響血清中SMRP的水平，并與MPM患者生存期縮短有關(guān)[13]。研究表明，通過沉默纖維蛋白3（Fibulin-3）基因，可以有效改變MPM細胞的生長[14]。后續(xù)研究中，我們將通過構(gòu)建MSLN基因沉默的MPM細胞模型，探究其對于MPM細胞增殖和生長的影響，從而對未來臨床MPM的治療提供實驗依據(jù)。同時，由于胸膜間皮瘤細胞的免疫應(yīng)答依賴于樹突狀細胞（dendritic cell, DC）為主的抗原呈遞給細胞從而識別[15]，因此，研發(fā)出抗癌疫苗，通過免疫應(yīng)答對胸膜間皮瘤進行相關(guān)治療。綜上所述，MSLN的高表達于惡性胸膜間皮瘤的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)，MSLN有希望作為MPM診斷或治療的潛在靶點。

由于惡性胸膜間皮瘤的發(fā)病機制復(fù)雜，病例較為罕見，臨床收集病例較為困難，本研究使用美國公共癌癥基因數(shù)據(jù)庫（TCGA）中的惡性胸膜間皮瘤病例數(shù)據(jù)，臨床數(shù)據(jù)樣本量更大，所得結(jié)果可信度較高。本研究表明，在未來MPM的診斷治療中，通過結(jié)合遺傳因素和血清因素等多種檢測方式可為MPM患者提供更好的診斷或預(yù)后生物標(biāo)志物，為惡性胸膜間皮瘤的臨床診療奠定了理論基礎(chǔ)。

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CLINICOPATHOLOGIC CORRELATION OF MESOTHELIN EXPRESSION IN MALIGNANT PLEURAL MESOTHELIOMA AND ITS PROGNOSTIC SIGNIFICANCE

LI Bin1, LI Su-fen1, WANG Wei-si1, YANG Na1, ZI Jia-ji2,*XIONG Wei1,2

(1. Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Basic Medical Sciences, Dali University, Dali, Yunnan 671000, China; 2. Laboratory of Clinical Biochemistry Test of Yunnan Province, Dali University, Dali, Yunnan 671000, China; 3．Department of Pathology, College of Basic medical Sciences, Dali University, Dali, Yunnan 671000, China)

This study will further discuss the relationship between MSLN and malignant pleural mesothelioma. In the present study, R 3.6.3 was used for data mining and analysis of the US public cancer gene database (TCGA), and the Oncomine database was used to compare and analyze the expression of MSLN in non-cancer and cancer tissues, and dynamic analysis of gene expression profiling (GEPIA) was used to build a Kaplan-Meier survival model for exploring the effect of MSLN expression on the prognosis of patients with malignant pleural mesothelioma, and the cBioportal was used for visual analysis of MSLN gene correlation. The expression of MSLN was low in normal tissues, but high in cancer tissues; the expression of MSLN was correlated with the tumor type of malignant pleural mesothelioma; among MPM patients, the overall survival rate of patients with high MSLN expression was significantly higher than that with low MSLN expression. In conclusion, mesothelin can be used as a new target for the diagnosis or treatment of malignant pleural mesothelioma, which lays a theoretical foundation for the future attack of related cancers.

malignant pleural mesothelioma; mesothelin; data mining; prognosis

R734.3

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2021.02.009

1674-8085(2021)02-0050-06

2020-12-16；

2021-01-18

國家自然科學(xué)基金項目（31601155）

李 彬(1996-)，男，云南大理人，碩士生，主要從事細胞分子生物學(xué)研究(E-mail:812276241@qq.com);

李素芬(1993-)，女，山東濟寧人，碩士生，主要從事腫瘤分子生物學(xué)研究(E-mail:1446198172@qq.com);

王唯斯(1991-)，男，內(nèi)蒙古呼倫貝爾人，碩士生，主要從事腫瘤生物信息學(xué)研究(E-mail:313731142@qq.com);

楊 娜(1994-)，女，云南楚雄人，碩士生，主要從事腫瘤分子生物學(xué)研究(E-mail: 1432656992@qq.com);

自加吉(1980-)，男，云南大理人，講師，碩士，主要從事分子病理學(xué)研究(E-mail:dldxjcyxyzjj@163.com);

*熊 偉(1982-)，男，湖南株洲人，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事細胞分子生物學(xué)研究(E-mail:xiongwei@dali.edu.cn).