郝志云，王繼卿，羅玉柱，胡 江，劉 秀，李少斌

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省牛羊基因改良工程實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070)

Wnts(Wingless-type MMTV integration site family member)是一種分泌蛋白質(zhì)，通過(guò)細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的信號(hào)途徑來(lái)調(diào)節(jié)生命活動(dòng)。它主要通過(guò)經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt途徑發(fā)揮作用，其經(jīng)典途徑主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和亞細(xì)胞定位。非經(jīng)典途徑除了激活Wnt/Ca2+信號(hào)途徑以外，還通過(guò)Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴(lài)性(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ, CamK II)蛋白激酶和蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)影響細(xì)胞遷移及細(xì)胞黏附，同時(shí)依賴(lài)細(xì)胞極性(planar cell polarity, PCP)途徑，通過(guò)激活JNK/ROCK調(diào)控細(xì)胞的生命活動(dòng)。WNT5A(Wnt family member 5A)蛋白是Wnt非經(jīng)典途徑的代表，當(dāng)它與細(xì)胞膜受體結(jié)合后，通過(guò)WNT、PCP及WNT/Ca2+信號(hào)通路將信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，激活下游的信號(hào)分子(JNK、CaMK II、PKA等)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、形態(tài)變化、骨架重排及極性等過(guò)程[1-2]。目前，關(guān)于WNT5A基因的研究主要集中于乳腺形態(tài)發(fā)生、毛囊發(fā)育、乳腺癌、腫瘤等方面。在小鼠乳腺發(fā)育中，WNT5A可以抑制乳腺導(dǎo)管的延伸和側(cè)向分支。Roarty等[3]采用Elvax緩慢遞送法[4]分別在小鼠乳腺脂肪墊中植入WNT5A與WNT5A-/-蛋白顆粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WNT5A-/-的乳腺組織具有較快的發(fā)育能力，主要表現(xiàn)為具有較大的末端芽、伸長(zhǎng)的導(dǎo)管和增加的導(dǎo)管分支及其增殖。同時(shí)，WNT5A基因也能夠抑制毛囊毛干的生長(zhǎng)。李瑤等[5]在鵝胚胎期皮膚中研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的WNT5A抑制了次級(jí)毛囊的發(fā)育。隨著WNT5A表達(dá)量的降低，次級(jí)毛囊的深度不斷增加。研究還發(fā)現(xiàn)，WNT5A基因調(diào)節(jié)了孕體著床及妊娠期發(fā)育，在孕體滋養(yǎng)外胚層，它以Rho激酶依賴(lài)的方式增加了滋養(yǎng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移[6]。然而，在家畜中，WNT5A僅在綿羊孕體著床中有較少研究，其它方面未有相關(guān)報(bào)道。

為了深入研究WNT5A基因的結(jié)構(gòu)特征以及在不同組織中的表達(dá)情況，本研究以高泌乳量的小尾寒羊和低泌乳量的甘肅高山細(xì)毛羊?yàn)檠芯繉?duì)象，在兩個(gè)綿羊品種的泌乳高峰期(產(chǎn)后第21天)，采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、卵巢、背最長(zhǎng)肌、乳腺和皮膚9個(gè)組織，應(yīng)用RT-PCR及生物信息學(xué)方法，克隆了綿羊WNT5A基因的CDS序列，分析核苷酸和氨基酸的序列和結(jié)構(gòu)特征，檢測(cè)該基因在乳腺等9個(gè)組織中的基因表達(dá)規(guī)律，以期為闡明WNT5A基因的生物學(xué)功能提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣品采自于甘肅天?？h松山鎮(zhèn)金子河綿羊繁育場(chǎng)。選擇高泌乳量的小尾寒羊和低泌乳量的甘肅高山細(xì)毛羊各3只，均為健康無(wú)病、體重接近3歲、第4胎。當(dāng)其處于泌乳高峰期(產(chǎn)后第21天)時(shí)，屠宰后采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、卵巢、背最長(zhǎng)肌、乳腺和皮膚各0.5 g左右。組織樣用DEPC水沖洗完后裝入2 mL凍存管，然后立即投入液氮中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

按照Trizol Reagent(Invitrogen, CA, USA)說(shuō)明書(shū)要求，提取組織中的總RNA。提取后的RNA用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280及其濃度，質(zhì)檢合格的RNA保存于-80 ℃冰柜中備用；根據(jù)Takara公司的PrimeScriptTMRT reagent(with gDNase)說(shuō)明書(shū)要求，對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA稀釋成100 ng/μL溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 WNT5A基因引物設(shè)計(jì)及克隆

以普通牛(Bostaurus)的WNT5A基因序列(NM_001205971)作為模板，在綿羊基因組(Oar_v3.1)中進(jìn)行同源性搜索，根據(jù)相似性最高的序列，設(shè)計(jì)引物P1和P2，其中P1用于WNT5A基因CDS區(qū)的克隆，P2引物用于后續(xù)的RT-qPCR分析，β-actin基因作為內(nèi)參引物，引物具體信息見(jiàn)表1。以乳腺組織的cDNA作為模板，采用20 μL反應(yīng)體系擴(kuò)增綿羊WNT5A基因的CDS區(qū)序列，包括cDNA 0.8 μL(約100 ng/μL)，5 U/μL Taq預(yù)混酶10 μL，0.25 μmol/L上、下游引物各0.8 μL，ddH2O加至20 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)后,選擇目的條帶進(jìn)行切膠、純化回收并連接到質(zhì)粒克隆載體pMD19-T上，經(jīng)轉(zhuǎn)化、PCR鑒定后挑取陽(yáng)性單克隆穿刺培養(yǎng)，送至陜西楊凌天潤(rùn)奧科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 綿羊WNT5A基因的引物信息Table 1 Primer information for sheep WNT5A gene

1.4 WNT5A生物學(xué)信息學(xué)分析

利用NCBI查找該基因的開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)，并用Blast進(jìn)行驗(yàn)證；利用MEGA 5.0構(gòu)建物種進(jìn)化樹(shù)；用ExPasy站點(diǎn)上的ProtParam軟件分析綿羊WNT5A蛋白的理化性質(zhì)；利用NetPhos 2.0(http://cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測(cè)WNT5A蛋白的磷酸化位點(diǎn)，利用NetNGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預(yù)測(cè)WNT5A蛋白的糖基化位點(diǎn)；采用Swiss Model(http://swissmodel.expasy.org)在線(xiàn)進(jìn)行三維建模，然后用Pymol輸出蛋白質(zhì)模型；利用String在線(xiàn)分析WNT5A蛋白的網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系。

1.5 WNT5A基因的表達(dá)量分析

應(yīng)用相對(duì)定量SYBR Green I(Takara, Dalian, China)染料法，在A(yíng)pplied Biosystems QuantStudio6 Flex儀(Temerlife, USA)中檢測(cè)WNT5A基因的組織表達(dá)量。采用20 μL的RT-qPCR體系，包括：cDNA模板2 μL(<100 ng),0.25 μmol/L的上下游引物各0.4 μL、10 μmol/L SYBR qPCR Master Mix 10 μL和RNase-free ddH2O 7.2 μL。RT-qPCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，59 ℃退火34 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。溶解反應(yīng)：95 ℃變性15 s,60 ℃采集熒光信號(hào)60 s。待反應(yīng)結(jié)束后，分析反應(yīng)的熒光定量溶解曲線(xiàn)，判斷是否存在引物二聚體，以及PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性，收集數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)量[7],利用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 WNT5A基因的克隆

以小尾寒羊的乳腺cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)目的片段大小跟預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。經(jīng)過(guò)克隆測(cè)序后，獲得完整的CDS區(qū)序列，大小為1 062 bp，編碼353個(gè)氨基酸。

圖1 綿羊WNT5A基因CDS區(qū)序列擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果M. 1 kb DNA ladder D-1040(Bioneer);1. PCR productFig.1 The results of sequence amplification products of sheep WNT5A gene CDS region

通過(guò)Blast分析發(fā)現(xiàn)，克隆獲得的片段序列與山羊的WNT5A具有較高的序列同源性(98.7%)，與普通牛WNT5A之間的同源性為88.96%。基于GenBank中山羊(Caprahircus)、豬(Susscrofa)、普通牛(Bostaurus)、藏羚羊(Pantholopshodgsonii)、大鼠(Rattusnorvegicus)、小鼠(Musmusculus)和人類(lèi)(Homosapiens)WNT5A的氨基酸序列，結(jié)合本研究獲得的綿羊序列，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，本研究克隆所得序列首先與山羊的WNT5A序列聚到一支。由此說(shuō)明，本研究中獲得的序列為綿羊的WNT5A序列(圖2)。

2.2 WNT5A蛋白的理化性質(zhì)

綿羊WNT5A蛋白的原子組成為C1689H2658N494O503S27，分子質(zhì)量為38798.31，等電點(diǎn)為9.02。WNT5A蛋白含有20種氨基酸，其中Ala含量最高(9.6%)，His含量最低(1.7%)。WNT5A的消光系數(shù)在280 nm時(shí)為58 870，不穩(wěn)定系數(shù)為43.68，說(shuō)明該蛋白是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白。WNT5A在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)半衰期為30 h，脂肪系數(shù)為71.36，總平均親水性為-0.283，說(shuō)明該蛋白是一個(gè)疏水蛋白。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)包含31個(gè)磷酸化位點(diǎn)，主要以絲氨酸(19)為主，還有蘇氨酸(6)和酪氨酸(6)磷酸化位點(diǎn)。糖基化位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，WNT5A蛋白存在3個(gè)N-連接的糖基化修飾位點(diǎn)，分別是第114、120和326位天冬酰胺殘基的酰胺氮原子。

綿羊WNT5A蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由45.04%(159個(gè))的無(wú)規(guī)則卷曲(Coil)、40.79%(144個(gè))的α-螺旋(Helix)、9.63%(34個(gè))的延伸鏈(Extenden strand)和1.53%(16個(gè))的β轉(zhuǎn)角(Turn)組成(圖3)。總體來(lái)看，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋為主，延伸鏈和β轉(zhuǎn)角則貫穿于整個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，由此判斷該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)為混合型。利用Swiss Model軟件分析了WNT5A蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)是由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、β轉(zhuǎn)角及延伸鏈互相折疊形成的簡(jiǎn)單空間構(gòu)象。

圖2 WNT5A氨基酸序列的同源性分析Fig.2 Homology analysis of the amino acid sequence of WNT5A

圖3 WNT5A蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)藍(lán)色的線(xiàn)表示α-螺旋，綠色的線(xiàn)表示β-轉(zhuǎn)角，紅色的線(xiàn)表示延伸鏈，淺紅色的線(xiàn)代表無(wú)規(guī)則卷曲Fig.3 Spatial structure of WNT5A protein The blue line represents α-helix. The green line represents β-turn, the red grey line represents extended strand and the light grey line represents random coil

蛋白互作分析結(jié)果表明，WNT5A與卷曲蛋白受體(Frizzled, FZD)、低密度脂蛋白相關(guān)蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein, LRP)及受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RYK)有互作關(guān)系(圖4)。

2.3 WNT5A基因的組織表達(dá)特征分析

應(yīng)用RT-qPCR法，檢測(cè)了小尾寒羊和甘肅高山細(xì)毛羊中WNT5A基因的組織表達(dá)情況。結(jié)果表明，WNT5A基因在采集的9個(gè)組織中均表達(dá)，并且其表達(dá)具有組織特異性。在小尾寒羊中，WNT5A基因表達(dá)量由高到低的順序依次為：皮膚>心臟>卵巢>乳腺>背最長(zhǎng)肌>腎臟>肝臟>肺臟>脾臟；在甘肅高山細(xì)毛羊中，WNT5A基因的表達(dá)量由高到低的順序依次為：皮膚>心臟>背最長(zhǎng)肌>乳腺>肺臟>腎臟>肝臟>脾臟>卵巢。其次WNT5A的表達(dá)也呈現(xiàn)出品種特異性，WNT5A在甘肅高山細(xì)毛羊皮膚、乳腺、背最長(zhǎng)肌、腎臟、肺臟、脾臟和肝臟中的表達(dá)量高于小尾寒羊(P<0.05)，在甘肅高山細(xì)毛羊卵巢中的表達(dá)量低于小尾寒羊(P<0.05)，而在心臟中該基因的表達(dá)量無(wú)差異(P>0.05)(圖5)。

圖4 綿羊WNT5A蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖Fig. 4 The protein interaction network of WNT5A protein sheep

3 討 論

WNT5A作為非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路配體之一，在細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等多個(gè)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。在WNT5A基因敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠中，β-catenin蛋白的表達(dá)量明顯增高，表明在機(jī)體發(fā)育過(guò)程中WNT5A可能通過(guò)促進(jìn)β-catenin的降解，從而>抑制了Wnt/β-catenin信號(hào)[8]。本研究采用RT-PCR技術(shù)克隆了WNT5A基因的CDS區(qū)序列，經(jīng)Blast比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，綿羊的WNT5A序列與山羊的序列具有高度同源性，表明該蛋白具有較高的保守性。綿羊WNT5A包含31個(gè)磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)N-連接的糖基化修飾位點(diǎn)，這與WNT5A在生物體中復(fù)雜的生物學(xué)功能相符。磷酸化是生物體最普遍的修飾方式之一，廣泛存在于生物體內(nèi)的各個(gè)方面，WNT5A通過(guò)磷酸化作用改變了自身的蛋白結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步引起了自身蛋白質(zhì)活性的變化，從而廣泛參與了細(xì)胞增殖、凋亡及分化等過(guò)程。N-連接的糖基化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后最普遍的修飾方式之一，糖基化修飾對(duì)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性、參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊及運(yùn)輸?shù)确矫嬗兄匾挠绊慬9]。因此，通過(guò)糖基化作用，可以改變WNT5A多肽的構(gòu)象，增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，對(duì)其發(fā)揮多重的生物學(xué)功能具有重要作用[10]。

圖 5 WNT5A基因在小尾寒羊和甘肅高山細(xì)毛羊不同組織中的表達(dá)量以小尾寒羊心臟為對(duì)照組；不同小寫(xiě)字母表示同一綿羊群體不同組織間差異顯著(P<0.05)Fig. 5 Expression of WNT5A gene in different tissues of Small-tail Han sheep and Gansu alpine merino sheepSmall-tail Han Sheep heart is the control;different small letters indicate significant difference in different tissues in the same sheep population (P<0.05)

String分析結(jié)果表明，WNT5A蛋白與FZD、LRP及RYK蛋白有互作關(guān)系。在細(xì)胞內(nèi)，WNT5A通過(guò)與FZD和LRP5/6結(jié)合，激活Wnt非經(jīng)典途徑，致使β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)積累，進(jìn)入核內(nèi)與Tcf/Lef形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，通過(guò)激活下游靶基因，調(diào)控了細(xì)胞的生命活動(dòng)[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在ROR2受體的情況下，WNT5A主要通過(guò)糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase 3, GSK3)非依賴(lài)性途徑促進(jìn)β-catenin降解來(lái)抑制經(jīng)典Wnt途徑，進(jìn)而抑制乳導(dǎo)管的發(fā)育及分支[13]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)不存在ROR2受體時(shí)，它可與RYK受體結(jié)合，能夠增強(qiáng)乳腺上皮生長(zhǎng)[14]。

RT-qPCR結(jié)果顯示，WNT5A基因在綿羊的9個(gè)組織中廣泛表達(dá)，并且具有明顯的組織特異性和品種特異性。WNT5A基因的廣泛表達(dá)可能與Wnt的多重生物學(xué)功能有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路廣泛參與了機(jī)體的發(fā)育及生長(zhǎng)過(guò)程[15-17,6]。本研究發(fā)現(xiàn)WNT5A基因在皮膚中的表達(dá)量最高，這說(shuō)明Wnt信號(hào)通路對(duì)毛囊生長(zhǎng)和發(fā)育具有至關(guān)重要的作用。Wnt/β-catenin途徑被認(rèn)為是毛囊周期維持不可或缺的通路[18]。在小鼠中，WNT5A基因抑制了次級(jí)毛囊生長(zhǎng)發(fā)育，拮抗Wnt/β-catenin信號(hào)通路[19]。同時(shí)，該基因也在綿羊心臟中高度表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠心肌細(xì)胞中，WNT5A表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化[20]，同時(shí)WNT5A在心臟中的高表達(dá)可能對(duì)心肌細(xì)胞分化和心臟形成具有重要的作用[15]。另外，WNT5A表達(dá)量的高低還與人的心力衰竭有關(guān)[21]。WNT5A在綿羊的肺臟、肝臟、腎臟和脾臟組織中也表達(dá)。研究已發(fā)現(xiàn)該基因在小鼠肺臟內(nèi)源性修復(fù)[22]、肝臟創(chuàng)傷修復(fù)[23]、腎臟纖維化[17]和骨髓造血細(xì)胞生成等[24]過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用。

WNT5A的表達(dá)也呈現(xiàn)出品種特異性，WNT5A在甘肅高山細(xì)毛羊皮膚組織中的表達(dá)量高于小尾寒羊(P<0.05)，這可能與兩個(gè)品種的毛囊發(fā)育和被毛長(zhǎng)度差異有關(guān)。在小鼠毛囊中研究發(fā)現(xiàn)，WNT5A基因的表達(dá)量隨著毛囊生長(zhǎng)而逐漸增多[25]。由于甘肅高山細(xì)毛羊是細(xì)毛羊品種，其毛囊的數(shù)量多于粗毛羊的小尾寒羊，造成甘肅高山細(xì)毛羊中WNT5A基因的表達(dá)量高于小尾寒羊。同時(shí)星懿展等[25]采用腺病毒介導(dǎo)方式，對(duì)小鼠觸須毛囊進(jìn)行了體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)WNT5A處理組毛囊的毛干伸出長(zhǎng)度變短。由于甘肅高山細(xì)毛羊成年母羊的被毛長(zhǎng)度低于小尾寒羊成年母羊[26]，造成甘肅高山細(xì)毛羊中該基因的表達(dá)量較高，這也與WNT5A可以抑制毛干生長(zhǎng)的結(jié)論相一致[25]。

WNT5A基因在甘肅高山細(xì)毛羊乳腺組織中的表達(dá)量也高于小尾寒羊(P<0.05)，這與兩個(gè)品種間的泌乳量差異有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)定發(fā)現(xiàn)，小尾寒羊具有良好的產(chǎn)奶性能，產(chǎn)后30 d內(nèi)的平均產(chǎn)奶量為1 357 g/d。相比之下，甘肅高山細(xì)毛羊同期的產(chǎn)奶量為853 g/d。前人研究已發(fā)現(xiàn)，WNT5A可以抑制乳腺導(dǎo)管的延伸和側(cè)向分支[3]，而乳導(dǎo)管及側(cè)枝的發(fā)育程度與產(chǎn)奶量呈正相關(guān)，因此WNT5A具有抑制泌乳量的作用[27]。WNT5A在小尾寒羊卵巢中的表達(dá)量高于甘肅高山細(xì)毛羊，這可能與兩個(gè)品種間的產(chǎn)羔數(shù)差異有關(guān)。小尾寒羊是著名的多胎多羔品種，其平均產(chǎn)羔率為270%，而甘肅高山細(xì)毛羊一般為單胎單羔[28]。研究發(fā)現(xiàn)，WNT5A與孕體著床及妊娠期發(fā)育有關(guān)，子宮內(nèi)膜的WNT5A以旁分泌的方式對(duì)孕體滋養(yǎng)外胚層起作用，以通過(guò)激活Rho-ROCK途徑激酶的非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，增加了滋養(yǎng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移[6]。滋養(yǎng)層細(xì)胞主要負(fù)責(zé)為胎盤(pán)提供血液，以滿(mǎn)足胎兒在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求[29]。因此推測(cè)，WNT5A在小尾寒羊卵巢中有較高的表達(dá)量是為了保障多羔后代的存活和正常的生長(zhǎng)發(fā)育。

WNT5A在甘肅高山細(xì)毛羊背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量高于小尾寒羊，這可能與二者之間的肉質(zhì)嫩度差異相關(guān)。肌纖維主要由快肌纖維和慢肌纖維組成，快肌纖維直徑大于慢肌纖維。研究發(fā)現(xiàn)，有較高慢肌纖維比例和較低快肌纖維比例的肌肉具有較好的嫩度[30-31]。WNT5A/Ca2+與CaMK IIδ偶聯(lián)可以促進(jìn)肌肉的分化[16]，并在調(diào)控肌纖維類(lèi)型方面發(fā)揮著重要作用[32]。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒W(wǎng)NT5A感染雞胚后，雞翅快肌纖維增加而慢肌纖維減少[33]，說(shuō)明WNT5A可以導(dǎo)致肌肉嫩度變差。因此推測(cè)，高表達(dá)的WNT5A導(dǎo)致了甘肅高山細(xì)毛羊中快肌纖維增加和肌纖維直徑增大，最終使甘肅高山細(xì)毛羊的肌肉嫩度老于小尾寒羊。

4 結(jié) 論

本研究獲得了綿羊WNT5A基因的CDS區(qū)全長(zhǎng)序列，它是編碼353個(gè)氨基酸的不穩(wěn)定疏水蛋白。該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，β轉(zhuǎn)角、延伸鏈貫穿于整個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中。String分析結(jié)果表明，WNT5A與卷曲蛋白受體、低密度脂蛋白相關(guān)蛋白和受體酪氨酸激酶有相互作用。并且WNT5A基因表達(dá)具有組織特異性及品種特異性。