陳 璞

（東莞市第八人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，廣東 東莞 523000）

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是世界范圍內(nèi)的慢性疾病，以前骨關(guān)節(jié)炎只是簡(jiǎn)單的被認(rèn)為由于磨損而受到的損害，而現(xiàn)在一致認(rèn)為骨關(guān)節(jié)炎是由局部和系統(tǒng)因素的復(fù)雜作用造成的［1］。骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的年齡一般為40 歲以上，主要表現(xiàn)在手指、肩膀、臀部、膝蓋或腳踝疼痛等。50 歲以上的患者有關(guān)節(jié)疼痛、晨起僵硬和功能障礙等表現(xiàn)［2］。這些骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生嚴(yán)重影響老年人的身心健康，給患者和政府醫(yī)療帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病與多種因素有關(guān)，關(guān)節(jié)滑膜對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，有研究表明OA 發(fā)生的重要機(jī)制是由滑膜病變引起的［3］。在OA發(fā)生與發(fā)展當(dāng)中，滑膜病變通過(guò)多種途徑引起骨類疾病的發(fā)生與發(fā)展［4］。近年來(lái)OA 的遺傳學(xué)研究成果豐碩，表觀遺傳學(xué)、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，OA 相關(guān)的基因參與了滑膜發(fā)育相關(guān)通路，這些基因的突變導(dǎo)致有關(guān)通路的紊亂最終可能會(huì)造成OA 的發(fā)生［5］。目前，雖然有大量研究正在探索OA 的發(fā)生機(jī)制，但是其真正的發(fā)病原因及機(jī)制尚不明確，其發(fā)病機(jī)制的研究對(duì)OA 的早期診斷及有效的治療具有重要的意義。目前主要采用影像學(xué)檢查來(lái)進(jìn)行早期的診斷，由于早期診斷的手段比較單一，因此，骨性關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制研究顯得尤為重要。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，生物學(xué)領(lǐng)域的公共數(shù)據(jù)庫(kù)共享了大部分與疾病相關(guān)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，這些海量數(shù)據(jù)很容易獲得，包括本文研究的OA 數(shù) 據(jù) 集。 本 文 利 用R 語(yǔ) 言“l(fā)imma”包 對(duì)GSE55235［6］和GSE55457［6］芯片預(yù) 處理、差異 分析等，篩選出OA 患者與正常患者的上調(diào)和下調(diào)的差異基因，接著對(duì)差異表達(dá)基因做GO和KEGG富集分析，然后通過(guò)R 語(yǔ)言“STRINGdb”包構(gòu)建了基于差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，以此篩選與OA 發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵基因。本研究的主要目的是篩選與OA 的發(fā)病機(jī)制相關(guān)的關(guān)鍵基因，并揭示OA 的潛在的發(fā)病機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 GEO 芯片數(shù)據(jù)的獲取從美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的NCBI 下載基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO），GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）的基因表達(dá)譜是現(xiàn)在最全面的公開(kāi)數(shù)據(jù)集［7］。從NCBI 下載的基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)GSE55235 與GSE55457，這兩套芯片均為Affymetrix human genome U133A 芯片，平臺(tái)都為Affymetrix GPL96，2 個(gè)數(shù)據(jù)集都包含來(lái)自正常膝關(guān)節(jié)的10 例滑膜組織樣本以及關(guān)節(jié)置換下來(lái)的10 例膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎滑膜組織樣本。

1.2 差異表達(dá)基因的篩選芯片數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)預(yù)處理后進(jìn)行差異表達(dá)分析。利用R 語(yǔ)言“affy”［8］包進(jìn)行預(yù)處理和“l(fā)imma”［9］包進(jìn)行差異表達(dá)分析，得出差異表達(dá)基因。其中調(diào)整后的P 值（adjusted p）＜0.05，|logFC|＞1 作為差異基因的篩選條件分別選擇兩個(gè)數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)的基因，并且將兩個(gè)數(shù)據(jù)集中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的基因分別取交集篩選出共同表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的基因作為進(jìn)一步分析的對(duì)象，得到了差異基因的表達(dá)熱圖。我們采用多重檢驗(yàn)校正（FDR）來(lái)校正P值。

1.3 差異基因的GO 和KEGG 富集分析采用R語(yǔ)言“clusterProfiler”［10］包對(duì)與骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的差異基因進(jìn)行了GO 和KEGG 富集分析。其中GO 富集分析分別從生物進(jìn)程（Biological processes，BP）、細(xì) 胞 組 成（Cellular component，CC）和 分 子 功 能（Molecular function，MF）等3 個(gè) 方 面 進(jìn) 行 富 集。KEGG 富集分析差異基因相關(guān)通路，計(jì)算這些差異基因與通路的相關(guān)顯著性，篩選到與OA 發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)的信號(hào)通路。通路以基因數(shù)目＞2 和富集的P.adjust＜0.05作為富集分析的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建STRING 數(shù)據(jù)（http：//www.string-db.org/）是蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)庫(kù)［11］。其包含蛋白質(zhì)之間的直接相互作用和間接相互作用。本研究通過(guò)R 語(yǔ)言“STRINGdb”［12］包構(gòu)建了骨性關(guān)節(jié)炎差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié) 果

2.1 差異基因分析開(kāi)始使用affy 包進(jìn)行原始芯片歸一化處理，然后通過(guò)R語(yǔ)言“l(fā)imma”包的差異分析，GSE55235 數(shù)據(jù)集共篩選出差異基因總數(shù)為756，其中包括467 個(gè)上調(diào)基因和289 個(gè)下調(diào)基因。GSE55457 數(shù)據(jù)集共篩選出240 個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因56 個(gè)，下調(diào)基因184 個(gè)。將兩個(gè)數(shù)據(jù)集中得到的上調(diào)和下調(diào)的基因分別取交集，共得到共同上調(diào)基因20 個(gè)，共同下調(diào)基因36 個(gè)?；诠灿械?6個(gè)差異基因，表1 中顯示了前30 個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)情況，這些差異基因是以adjusted P＜0.05 和|logFC|＞1為標(biāo)準(zhǔn)篩選的。利用R語(yǔ)言中的“pheatmap”包繪制GSE55235 和GSE55457 基因熱圖（圖1～圖2）。

表1 前30個(gè)差異表達(dá)基因的顯著性情況

圖1 GSE55235差異表達(dá)基因熱圖

圖2 GSE55457差異表達(dá)基因熱圖

2.2 GO 富集分析為了探索差異基因的生物學(xué)功能，我們通過(guò)R 語(yǔ)言clusterProfiler 包對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎差異基因進(jìn)行了GO 富集分析，由BP、CC 和MF三部分構(gòu)成（圖3）。生物進(jìn)程（BP）中差異基因主要富集在蛋白質(zhì)磷酸化的負(fù)調(diào)控（negative regulation of protein phosphorylation）、磷酸化的負(fù)調(diào)控（negative regulation of phosphorylation）、上皮細(xì)胞增殖（epithelial cell proliferation）、細(xì)胞對(duì)外部刺激的反應(yīng)（cellular response to external stimulus）、轉(zhuǎn)移酶活性的負(fù)調(diào)控（negative regulation of transferase activity）中。在細(xì)胞組成（CC）中，主要富集在蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)（pro?teinaceous extracellular matrix）、細(xì)胞外基質(zhì)（extra?celluar matrix）中，關(guān)節(jié)軟骨是透明軟骨，由細(xì)胞外基質(zhì)包裹軟骨細(xì)胞組成，細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分是膠原和蛋白多糖，正常軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)基因表達(dá)異常的時(shí)候，平衡狀態(tài)被破壞就會(huì)導(dǎo)致OA 的發(fā)生。在分子功能（MF）中，主要富集在糖胺聚糖結(jié)合（glycosaminoglycan binding）、生長(zhǎng)因子結(jié)合（growth factor binding）、MAP 激酶磷酸酶活性（MAP kinase phosphatase activity）、糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合（glucocorticoid receptor binding）中。

2.3 KEGG 富集分析為了篩選到與OA 相關(guān)通路，通過(guò)clusterProfiler 包對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的差異基因進(jìn)行了KEGG 通路富集分析（圖3）。通過(guò)KEGG 富集分析，發(fā)現(xiàn)差異基因主要集中在MAPK signaling pathway、Epstein-Bar virus infection、Human T-cell leukemia virus 1 infection、PI3K-Akt signaling pathway、 Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、ErbB signaling pathway 和HIF-1 signaling pathway 等通路中。WANG 等研究表明乳鐵蛋白通過(guò)MAPK信號(hào)通路促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎老鼠的軟骨細(xì)胞增殖［13］。ZHANG 等證實(shí)microRNA?130a 通過(guò)PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路引起軟骨細(xì)胞骨關(guān)節(jié)炎［14］

圖3 OA差異基因GO功能分析和KEGG通路分析以及差異基因構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 差異基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析基于STRING 的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，我們通過(guò)R 語(yǔ)言“STRINGdb”包構(gòu)建了PPI 網(wǎng)絡(luò)，其中包括39 點(diǎn)，95 個(gè)邊（圖3D）。在56 個(gè)差異基因中，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，按照度的大小來(lái)表示該基因在網(wǎng)絡(luò)中的重要性的標(biāo)準(zhǔn)，度值排在前10 的基因分別為VEGFA、JUN、MYC、ATF3、DUSP1、NR4A1、CDKN1A、NR4A2、GADD45B和KLF6（表2）。

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)中前10基因的度情況

3 討 論

OA 是骨科常見(jiàn)的關(guān)節(jié)慢性疾病，在美國(guó)的發(fā)病數(shù)目達(dá)到千萬(wàn)以上［15］。其特點(diǎn)主要是滑膜無(wú)菌性炎癥，其臨床癥狀為關(guān)節(jié)腫脹、疼痛等。甚至有可能導(dǎo)致殘疾，使得中老年人的生活質(zhì)量受到極大的影響，并且給患者帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)壓力［16］。所以對(duì)患者的早期診斷與治療非常重要。

本研究通過(guò)對(duì)OA 表達(dá)譜芯片GSE55235 和GSE55457進(jìn)行生物信息學(xué)的差異表達(dá)分析，總共得到56 個(gè)差異基因，其中包括20 個(gè)表達(dá)上調(diào)基因和36 個(gè)表達(dá)下調(diào)基因。然后對(duì)得出的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，得到與OA 發(fā)病相關(guān)的通路。最后，通過(guò)R 語(yǔ)言“STRINGdb”包來(lái)構(gòu)建了差異表達(dá)基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，其中包括39 個(gè)基因和95條相互關(guān)系。在56 個(gè)差異基因中，篩選出VEGFA、JUN、MYC、ATF3、DUSP1、NR4A1、CDKN1A、NR4A2、GADD45B和KLF6基因作為該網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵基因。有報(bào)道表明PI3K-Akt 與MAPK 信號(hào)通路都屬于破骨分化信號(hào)通路［17］，c-JUN（JUN）氨基末端激酶（c-JUN N-terminal kinase，JNK）作為MAPK 信號(hào)通路的關(guān)鍵分支，成為炎癥藥物治療的常見(jiàn)靶點(diǎn)［18］。而且在白細(xì)胞介素1 的誘導(dǎo)下JNX/c-JUN 信號(hào)通路可以抑制Col-2基因的表達(dá)，然后關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)正常組分的合成受到影響，從而降低關(guān)節(jié)軟骨的強(qiáng)度及韌性，最終導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生［19］。FISCH 等選擇了豐富的轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)節(jié)OA 中的差異表達(dá)基因，并通過(guò)創(chuàng)建軟骨特異性相互作用的局部網(wǎng)絡(luò)來(lái)對(duì)這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了優(yōu)先排序。該分析揭示了8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其中包括MYC 作為OA 中大量失調(diào)基因的靶標(biāo)之一，并在OA中被抑制表達(dá)［20］。Atf3通過(guò)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞中的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)參與OA 的發(fā)生與發(fā)展，而軟骨細(xì)胞中的炎性細(xì)胞因子/NF-kB/Atf3 的前饋環(huán)可能是OA 治療的新型治療靶點(diǎn)［21］。有研究表明與正常細(xì)胞相比，CDKN1A 基因（細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A，也稱為p21 或野生型p53 激活片段1）在OA 軟骨細(xì)胞中被下調(diào)［22］。由于其能夠阻止許多細(xì)胞類型增殖，因此提出了CDKN1A 的缺失導(dǎo)致OA 軟骨中細(xì)胞增殖的重新啟動(dòng)［23］。目前為止并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)KLF6 與OA 相關(guān)聯(lián)，但是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)KLF6 基因在骨關(guān)節(jié)炎與正常組織對(duì)比中表達(dá)具有顯著的差異，因此KLF6 可能在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用，其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGFA）水平升高與骨關(guān)節(jié)炎（OA）的發(fā)展有關(guān)，實(shí)際上VEGF可能參與了OA 特有的病理進(jìn)程，包括軟骨變性、骨贅形成、軟骨下骨囊腫和硬化、滑膜炎和疼痛。此外，廣泛的研究表明抑制VEGF信號(hào)傳導(dǎo)可降低OA的發(fā)展［24］。針對(duì)VEGFA、JUN、MYC、ATF3、DUSP1、NR4A1、CDKN1A、NR4A2、GADD45B和KLF6基因的檢測(cè)將有助于OA 的早期診斷與治療。這也預(yù)示著這些基因可能與OA的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

通過(guò)生物信息分析方法篩選到了OA 的差異表達(dá)基因，并對(duì)其進(jìn)行了富集分析，然后通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)分析，得出與OA 發(fā)生發(fā)展相關(guān)的相關(guān)基因。這有助于骨性關(guān)節(jié)炎的早期診斷和治療，為尋找與OA發(fā)生發(fā)展及治療相關(guān)靶點(diǎn)的研究提供了新的思路。