趙尚敏，李曉東，付增娟，鄂圓圓，張 輝，王 良，張自強(qiáng)，鄭文哲，張必周，白 晨，張惠忠

（內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

甜菜是我國(guó)北方主要經(jīng)濟(jì)作物之一，目前生產(chǎn)上使用的甜菜品種99%以細(xì)胞質(zhì)雄性不育系材料為母本，優(yōu)良授粉系材料為父本雜交選育而成。在育種工作中，為了選配出優(yōu)良的雜交組合，獲得優(yōu)異的創(chuàng)新品種，非常有必要對(duì)甜菜種質(zhì)資源材料進(jìn)行鑒定分析，進(jìn)一步明確種質(zhì)的遺傳背景及內(nèi)在遺傳結(jié)構(gòu)，從而可以更有效、準(zhǔn)確地選擇父母本，避免配制雜交組合的盲目性，進(jìn)一步提高雜交選育工作效率[1-2]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的DNA標(biāo)記為種質(zhì)資源鑒定提供一個(gè)簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的方法。DNA標(biāo)記可以覆蓋整個(gè)基因組，能客觀(guān)、準(zhǔn)確地檢測(cè)DNA 水平基因組的差異，能夠全面評(píng)估研究對(duì)象的多樣性，并揭示其遺傳本質(zhì)。利用遺傳多樣性的結(jié)果可以對(duì)物種進(jìn)行聚類(lèi)分析，進(jìn)而了解其系統(tǒng)發(fā)育與親緣關(guān)系[3-4]。利用分子標(biāo)記確定材料之間的親緣關(guān)系、遺傳距離及遺傳差異，可以進(jìn)一步劃分雜種優(yōu)勢(shì)群，提升雜種優(yōu)勢(shì)的潛力，從而顯著提高育種的預(yù)見(jiàn)性與選擇效率[5-7]。近年來(lái)，甜菜種質(zhì)資源的研究主要集中在遺傳多樣性的研究上，學(xué)者們利用不同分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同來(lái)源的甜菜資源材料進(jìn)行了分類(lèi)[2-3]。這些研究充分顯示了甜菜種質(zhì)資源豐富的遺傳多樣性和復(fù)雜的遺傳背景，但對(duì)于甜菜群體結(jié)構(gòu)分析的研究鮮有報(bào)道。

目前，群體結(jié)構(gòu)分析在玉米[8]、水稻[9]、大豆[10]等作物中已得到了廣泛應(yīng)用，但關(guān)于甜菜群體結(jié)構(gòu)的研究尚未開(kāi)展[11]。本研究采用SSR標(biāo)記對(duì)70份甜菜資源材料的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，以期為揭示甜菜種質(zhì)資源的進(jìn)化關(guān)系、加快甜菜種質(zhì)資源的利用效率和優(yōu)良親本的選配提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

本研究采用70份甜菜資源材料，其中，9份甜菜單胚不育系材料、11份單胚保持系材料、48份多胚授粉系材料、2份單胚雄性不育雜交種（表1）。這些材料是進(jìn)行甜菜雜交育種的骨干親本材料，對(duì)甜菜育種起著至關(guān)重要的作用。

1.2 DNA 提取、檢測(cè)

在田間采集70份甜菜資源材料的新鮮嫩葉，將采集的甜菜樣品按編號(hào)分裝好，放入真空冷凍抽干機(jī)凍干并研磨成粉，采用CTAB法，提取基因組DNA。然后采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 純度，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度[12]。

1.3 PCR 擴(kuò)增體系

SSR引物選用實(shí)驗(yàn)室已篩選并驗(yàn)證的多態(tài)性好、條帶清晰的12 對(duì)SSR引物（表2），均由上海生工合成。PCR 擴(kuò)增體系為10 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4℃，預(yù)變性5 min，94℃變性0.5 min，退火（引物不同，退火溫度不同）1 min，72℃延伸0.5 min，32個(gè)循環(huán)，72℃保溫5 min[13]。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物使用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染顯色，觀(guān)察并統(tǒng)計(jì)條帶。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

以DL2000DNA Marker 作為分子量參考，每個(gè)SSR位點(diǎn)，各組樣品在相同遷移率上有帶記為1，無(wú)帶記為0，建立SSR 分子標(biāo)記的1/0 矩陣數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)Cervus 3.0.7，計(jì)算樣品的群體遺傳多樣性。利用Pop Gen 1.32 軟件分析引物的等位基因數(shù)、等位基因頻率和Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)，并計(jì)算各個(gè)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息量（polymorphism information content，PIC）。利用Structure 軟件對(duì)供試材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，從而確定群體的分組及個(gè)體的分配。采用混合模型設(shè)置K值范圍為1～12，每個(gè)K值運(yùn)算重復(fù)5次，將MCMC（markov chain monte carlo）設(shè)置100 000次迭代，初始burn-in次數(shù)為100 000。若似然值隨亞群數(shù)的增大而增大，則采用△K 確定合適的K值。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性及遺傳多樣性分析

利用12 對(duì)SSR引物對(duì)70份甜菜樣品進(jìn)行擴(kuò)增（圖1、圖2分別為引物Y1、Y2 對(duì)70份材料的擴(kuò)增電泳圖），在70份材料中擴(kuò)增出等位基因52個(gè)，每對(duì)引物的等位基因數(shù)為2～6個(gè)，平均等位基因數(shù)為4.33個(gè)；觀(guān)測(cè)雜合度（Ho）為0.06～0.60，平均為0.22；期望雜合度（He）為0.15～0.97，平均值為0.69。衡量種群遺傳多樣性用雜合度作為一個(gè)參數(shù)，若雜合度越高，則該種群遺傳多樣性越豐富[14]。因期望雜合度受取樣的影響較小，一般使用期望雜合度衡量種群的遺傳多樣性，而不是觀(guān)測(cè)雜合度。該供試材料的期望雜合度相對(duì)較高，表明該供試材料遺傳多樣性較豐富。

表1 供試資源材料

表2 所選引物序列及實(shí)驗(yàn)條件

多態(tài)信息含量（PIC）為0.10～0.96，平均為0.65。由BOSTSEIN 等[15]提出的PIC指標(biāo)，用基因變異程度高低來(lái)衡量。當(dāng)PIC＞0.5時(shí)，為高度多態(tài)位點(diǎn)；0.25＜PIC＜0.5時(shí)，為中度多態(tài)位點(diǎn)；PIC＜0.25時(shí)，為低度多態(tài)位點(diǎn)。在本試驗(yàn)中，檢測(cè)到的PIC 平均值0.648 大于0.5，進(jìn)一步說(shuō)明70份供試材料的遺傳差異較大，遺傳背景較復(fù)雜（表3）。

2.2 群體結(jié)構(gòu)分析

群體結(jié)構(gòu)分析是預(yù)先將供試材料設(shè)定幾個(gè)類(lèi)群，然后通過(guò)標(biāo)記結(jié)果計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的遺傳相似性比例和等位基因頻率，從而可以進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)出材料之間的共祖度，從更微觀(guān)角度表明各材料的遺傳背景[16]，遺傳相似性比例高的材料劃分在一個(gè)類(lèi)群。

圖1 引物Y1 對(duì)70份材料的DNA 擴(kuò)增結(jié)果

圖2 引物Y2 對(duì)70份材料的DNA 擴(kuò)增結(jié)果

表3 12 對(duì)SSR標(biāo)記的遺傳多樣性參數(shù)統(tǒng)計(jì)

該研究采用Structure 軟件對(duì)70份甜菜資源材料進(jìn)行分析，確定群體分組和個(gè)體的分配。結(jié)果顯示，自然對(duì)數(shù)ln P（D）值在K＝6時(shí)取得最大值（圖3），因此參照EVANNO 等[17]的統(tǒng)計(jì)模型，確定亞種群的K值為6，將70份甜菜種質(zhì)資源分為6個(gè)亞群（分別命名為G01～G06，表4）。分析各亞群發(fā)現(xiàn)，G01亞群由25份材料組成，在群體結(jié)構(gòu)圖中用淺紅色標(biāo)注，該亞群包括單胚不育系材料4份、單胚保持系材料4份、單胚雜交種1份、多胚授粉系材料16份；G02亞群由2份材料組成，在群體結(jié)構(gòu)圖中用藍(lán)色標(biāo)注，這2份材料都是多胚授粉系材料；G03亞群由10份材料組成，在群體結(jié)構(gòu)圖中用綠色標(biāo)注，該亞群包括單胚不育系材料2份、單胚保持系材料2份、多胚授粉系材料6份；G04亞群由16份材料組成，在群體結(jié)構(gòu)圖中用黃色標(biāo)注，該亞群包括單胚不育系材料1份、單胚保持系材料2份、多胚授粉系材料13份；G05亞群由8份材料組成，在群體結(jié)構(gòu)圖中用深紅色標(biāo)注，該亞群包括單胚不育系材料1份、單胚保持系材料2份、單胚雜交種1份、多胚授粉系材料5份；G06亞群由9份材料組成，在群體結(jié)構(gòu)圖中用棕色標(biāo)注，該亞群包括單胚不育系材料1份、單胚保持系材料2份、多胚授粉系材料6份。具體群體分類(lèi)情況見(jiàn)圖4。

圖3 K值曲線(xiàn)圖

通過(guò)Structure 軟件群體結(jié)構(gòu)的分析，當(dāng)某一資源材料在某一亞群中的百分比Q值越大，則認(rèn)為該資源材料血緣關(guān)系相對(duì)比較單一，否則認(rèn)為該資源材料血緣關(guān)系來(lái)源較復(fù)雜[18]。表5為70份甜菜資源材料在各個(gè)亞群中的Q值分布。70份甜菜資源材料中有31份Q＜0.6，占所有參試材料的44.3%，Q≥0.8 和Q≥0.9的材料分別占22.9%和10.0%，說(shuō)明各群體中小部分材料親緣關(guān)系比較單一，血緣是獨(dú)立的，大部分材料親緣關(guān)系比較復(fù)雜，相互滲透，含有其他類(lèi)群的基因成分，與多態(tài)性分析結(jié)果一致。

表4 70份甜菜資源材料在各組群中的分布（K=6）

圖4 70份甜菜資源材料的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

表5 各群體Q值分布

2.3 群體主成分分析（PCA分析）

基于SSR標(biāo)記多態(tài)信息，對(duì)供試材料進(jìn)行主成分分析（principal components analysis，PCA），得到材料的主成分聚類(lèi)情況。根據(jù)距離近表示親緣關(guān)系近，距離遠(yuǎn)則親緣關(guān)系遠(yuǎn)的原則，通過(guò)PCA分析，可以知道哪些材料相對(duì)比較接近，哪些材料相對(duì)比較疏遠(yuǎn)。70份資源材料PCA 聚類(lèi)情況見(jiàn)圖5。本研究通過(guò)PCA分析劃分為4 部分（a、b、c、d），劃分結(jié)果與群體結(jié)構(gòu)劃分的6個(gè)類(lèi)群基本對(duì)應(yīng)：在PCA 聚類(lèi)圖的a部分是G01、G05類(lèi)群總和，說(shuō)明這兩個(gè)類(lèi)群之間親緣關(guān)系比較近，b 部分和G03類(lèi)群對(duì)應(yīng)，c 部分對(duì)應(yīng)G04類(lèi)群，d 部分對(duì)應(yīng)G06類(lèi)群，G02類(lèi)群沒(méi)有歸在a、b、c、d 任何一個(gè)部分，且與a、b、c、d 部分距離比較遠(yuǎn)，說(shuō)明G02類(lèi)群的材料與其他類(lèi)群材料親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)，血緣是獨(dú)立的。PCA 劃分的4個(gè)部分間有少量材料相互滲透（圖5），6個(gè)類(lèi)群差異顯著，在PCA分析圖中距離也較遠(yuǎn)，因此PCA分析所得的結(jié)論和群體結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果兩者基本上是吻合的，進(jìn)一步說(shuō)明群體結(jié)構(gòu)分析的準(zhǔn)確性。

圖5 群體主成分分析

3 結(jié)論與討論

親本資源是育種工作的基礎(chǔ)，明確育種基礎(chǔ)材料遺傳多樣性、遺傳背景及遺傳結(jié)構(gòu)，對(duì)選育新品種有非常重要的作用。該研究對(duì)70份甜菜資源材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，該研究供試材料的期望雜合度較高，平均為0.69，表明供試材料遺傳多樣性較豐富；多態(tài)信息含量（PIC）平均為0.65，大于0.5，說(shuō)明70份供試材料的遺傳差異較大，遺傳背景較復(fù)雜；但由于PIC值在0.10～0.96，變化范圍比較大，進(jìn)一步說(shuō)明有些材料遺傳差異極其明顯，但有些材料差異很小。

群體結(jié)構(gòu)分析將70份甜菜資源材料分為6個(gè)亞群，其中，G01亞群25份材料、G02亞群2份材料、G03亞群10份材料、G04亞群16份材料、G05亞群8份材料、G06亞群9份材料，除G02亞群只包括授粉系材料外，其余亞群既包括不育系與保持系，也包括授粉系。70份材料中，Q＜0.6的占44.3%，Q≥0.8 和Q≥0.9的分別占22.9%和10.0%，根據(jù)Q值的大小，進(jìn)一步說(shuō)明各群體中小部分材料親緣關(guān)系比較單一，血緣是獨(dú)立的，大部分材料親緣關(guān)系比較復(fù)雜，相互滲透，含有其他類(lèi)群的基因成分，與多態(tài)性分析結(jié)果一致。

主成分分析進(jìn)一步驗(yàn)證了群體結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性，分析的結(jié)果兩者基本上是吻合的，進(jìn)一步分析了群體之間的親緣遠(yuǎn)近。根據(jù)距離近表示親緣關(guān)系近，距離遠(yuǎn)則親緣關(guān)系遠(yuǎn)的原則，可知同一類(lèi)群材料間親緣性最近，G01 與G05類(lèi)群材料間親緣性較近，G02類(lèi)群與其他類(lèi)群親緣性最遠(yuǎn)，且血緣是獨(dú)立的，遺傳背景較單一。

通過(guò)該研究的分析，進(jìn)一步反映了親本材料間遺傳多樣性、遺傳背景及內(nèi)在的遺傳結(jié)構(gòu)。在育種工作中，可以更有針對(duì)性地對(duì)材料加以選擇和利用。決定甜菜育種成敗的關(guān)鍵是親本選配，在選擇親本材料作為雜交育種親本時(shí)，除考慮材料間的親緣關(guān)系外，還要考慮其復(fù)雜的遺傳組分[19]，盡可能挑選親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，遺傳背景不同的材料作為父母本，這樣才能提高雜種優(yōu)勢(shì)，有助于選育出更好的后代雜交創(chuàng)新品種，對(duì)指導(dǎo)甜菜雜交育種工作與未來(lái)的甜菜育種研究具有重要指導(dǎo)意義。