肝臟是一種新陳代謝器官，不斷向機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)，并消除體內(nèi)廢物和有毒有害物質(zhì)。肝臟也是一個(gè)具有復(fù)雜免疫活性的部位，可產(chǎn)生具有調(diào)節(jié)免疫功能的細(xì)胞因子，清除侵入者使機(jī)體內(nèi)環(huán)境恢復(fù)平衡。然而，不能被消除的入侵者或未被控制的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致肝臟的慢性感染，出現(xiàn)肝纖維化、肝細(xì)胞功能障礙和脂肪變性等病理性改變。許多研究表明，內(nèi)毒素中的脂多糖（LPS）成分可通過(guò)多種有害途徑引起肝細(xì)胞損傷。隨著對(duì)內(nèi)毒素研究的加深，如何發(fā)掘保肝藥物，緩解肝細(xì)胞損傷顯得尤為重要。

異丙酚是臨床上用于靜脈全麻常用藥物之一，具有醒腦快、持續(xù)輸注、無(wú)蓄積等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)異丙酚對(duì)腎臟、肝臟等器官具有較好的保護(hù)作用。Wei等報(bào)道異丙酚對(duì)肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。然而，異丙酚是否對(duì)LPS所致肝損傷有保護(hù)作用尚不清楚。所以本實(shí)驗(yàn)用20 mg/L的LPS誘導(dǎo)L-02細(xì)胞損傷，觀測(cè)不同劑量異丙酚（PPF）對(duì)其保護(hù)作用，為臨床上治療感染性休克提供一定的基礎(chǔ)理論和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

異丙酚（貨號(hào)D126608）購(gòu)自Sigma公司；LPS購(gòu)自Sigma公司，用滅菌水配成2g/L母液備用；RPMI Medium 1640培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco公司；青-鏈霉素（penicillin-strepotomycin，P/S）購(gòu)自Thermo公司；MTT、人丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒、人天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）ELISA試劑盒購(gòu)自酶免公司；白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子α（TNFα）引物由金斯瑞生物科技有限公司合成；Hifair?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit和Hieff?qPCR SYBR? Green Master Mix購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗核因子-κB（NF-κB）p65、NF-κB、p-肌醇依賴酶1α（IRE1α）、IRE1α、激活轉(zhuǎn)錄因子6（ATF-6）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 儀器

倒置熒光顯微鏡（德國(guó)徠卡）；DFC500照相系統(tǒng)（德國(guó)萊卡）；多功能酶標(biāo)儀（南京德鐵）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo公司）；超低溫冰箱（青島海爾）；蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）。

1.3 L

-

02細(xì)胞的培養(yǎng)

將L-02細(xì)胞（人正常肝細(xì)胞系，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院饋贈(zèng)）培養(yǎng)于含有10% FBS和1% P/S的RPMI 1640培養(yǎng)基中，含有5%二氧化碳-95%空氣的37℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，取生長(zhǎng)期的細(xì)胞以5×10/mL的密度接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被的96孔板中，每孔100μL。

1.4 LPS誘導(dǎo)L

-

02細(xì)胞損傷模型的制備

將細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)字表法分為0（正常組）、5、10、15、20、25 mg/L的LPS組，每組6個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%以上時(shí)，加入不同濃度的LPS，置于含有5%二氧化碳-95%空氣的37℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)6、12、24、48 h，四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）檢測(cè)各組細(xì)胞的存活情況，確定損傷模型。

1.5 PPF給藥處理及分組

將細(xì)胞分為正常組、LPS模型組（LPS）、LPS+25和50μmol/L PPF給藥組以及LPS+4 mmol/L 4-苯基丁酸（PBA）的陽(yáng)性藥組，每組6個(gè)復(fù)孔，觀察PPF對(duì)LPS致肝細(xì)胞損傷的保護(hù)情況。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活能力

收集經(jīng)過(guò)處理的接種于96孔培養(yǎng)板中各組細(xì)胞的培養(yǎng)基后，每孔加入終濃度為0.5 g/L的MTT溶液，置于含有5%二氧化碳-95%空氣的37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后棄掉培養(yǎng)液，加入150μL二甲基亞砜（DMSO）溶液在搖床上慢搖直至藍(lán)紫色甲瓚完全溶解，然后用多功能酶標(biāo)儀在492 nm處測(cè)定各組細(xì)胞的吸光度。

1.7 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中ALT和AST含量

按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)所示方法檢測(cè)上步收集的各組細(xì)胞上清液中ALT和AST的表達(dá)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組的ALT和AST的蛋白濃度。

1.8 qRT

-

PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中IL

-

1

β

、IL

-

6和TNF

-α

mRNA水平

按Trizol法取各組細(xì)胞的總RNA，按照Hifair?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit所示步驟將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。根據(jù)Hieff?qPCR SYBR? Green Master Mix（Low Rox Plus）所示比例構(gòu)建qPCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性0.5 min，95℃變性5 s，55℃退火0.5 min，共持續(xù)40個(gè)循環(huán)，引物序列如表1。IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA在各組細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平結(jié)果用2表示。

1.9 Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞中NF

-κ

B p65、NF

-κ

B、p

-

IRE1

α

、IRE1

α

和ATF

-

6蛋白水平

取培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中的各組細(xì)胞，分別加入各種蛋白酶抑制劑，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞收集起來(lái)；4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清于1.5 mL離心管中等待定量。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，各組取30μg蛋白煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，320 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h，5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，按1∶1 000比例加入NF-κB p65、NF-κB、p-IRE1α、IRE1α、ATF-6和GAPDH抗體稀釋液，TBST洗膜3次，每次5 min，1∶1 000比例加入HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h。ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)成像，Image J軟件計(jì)算灰度值，采用目的條帶與內(nèi)參蛋白條帶光密度比值作為結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 PCR相關(guān)序列

2 結(jié)果

2.1 不同濃度LPS對(duì)人肝細(xì)胞存活能力的影響

由圖1可知，在LPS處理0 h時(shí)，通過(guò)MTT法檢測(cè)各組人正常肝細(xì)胞的存活能力，發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞存活能力與正常組（0 mg/L LPS）之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05），說(shuō)明各組細(xì)胞在處理前狀態(tài)一致，保證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性；而LPS對(duì)肝細(xì)胞活力的影響具有劑量以及時(shí)間依賴性（見(jiàn)圖1），LPS作用24 h在濃度范圍內(nèi)接近線性變化并且劑量為20 mg/L的細(xì)胞（存活率為50.74%）處于亞健康狀態(tài)，因此選擇20 mg/L LPS作用24 h作為致肝損傷模型劑量。

圖1 MTT法比較不同濃度LPS對(duì)各組肝細(xì)胞的存活率影響

2.2 PPF改善損傷肝細(xì)胞的形態(tài)

如圖2所示，正常組肝細(xì)胞貼壁較好，結(jié)構(gòu)完整，折光性較強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)比較清晰；LPS組細(xì)胞胞體大部分皺縮成圓球狀，貼壁性不好容易脫落，鏡下可見(jiàn)部分細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)基中；而給予低高濃度的PPF組和PBA陽(yáng)性藥組細(xì)胞狀態(tài)較LPS組有所改善，貼壁較好，細(xì)胞胞體大都成紡錘體或梭形，數(shù)目明顯增多。

2.3 PPF提高損傷肝細(xì)胞的存活能力

與正常組（100±9.30）%相比，LPS組肝細(xì)胞存活率顯著降低為（54.26±7.77）%（

P

＜0.01）；而給予低高濃度的PPF和PBA的細(xì)胞存活能力顯著上升［LPS+25μmol/L PPF：（66.86±4.31）%，LPS+50μmol/L PPF：（84.71±7.30）%，LPS+4 mmol/L PBA：（83.74±7.48）%］（

P

＜0.05），

F

=34.125，

P

＜0.001。

2.4 PPF降低損傷肝細(xì)胞中AST和ALT的含量

表2 結(jié)果顯示，LPS組細(xì)胞上清液中AST和ALT濃度與正常組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）；在孵育了低高濃度PPF和PBA后的細(xì)胞上清液中AST和ALT濃度顯著降低，與LPS組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。

2.5 PPF降低損傷肝細(xì)胞中IL

-

1

β

、IL

-

6和TNF

-α

mRNA的表達(dá)

如表3所示，與正常組比較，LPS組細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)明顯上升（

P

＜0.01）；與LPS組相比，給予低高濃度PPF組和PBA組細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)降低（

P

＜0.01）。

2.6 PPF降低損傷肝細(xì)胞中NF

-κ

B蛋白的磷酸化

如圖3所示，LPS組NF-κB p65蛋白水平較正常組相比顯著性升高［（3.16±0.42）比（1.00±0.16），

P

＜0.01］；而給予了低高濃度PPF組和PBA組的細(xì)胞中NF-κB p65蛋白水平明顯降低至（2.50±0.38），（1.81±0.20）和（1.84±0.17）（

P

＜0.01），且不同組間均數(shù)比較，

F

=47.267，

P

＜0.001。

圖2 光鏡下各組人肝細(xì)胞的形態(tài)（×100）

表2 各組L-02細(xì)胞中ALT和AST濃度/（mg/L，±s）

表3 各組細(xì)胞中相關(guān)炎性因子的mRNA表達(dá)/±s

圖3 比較各組L-02細(xì)胞中核因子-κB（NF-κB）磷酸化蛋白水平的表達(dá)

2.7 PPF降低損傷肝細(xì)胞中ATF

-

6和p

-

IRE1

α

蛋白的表達(dá)

表4和圖4結(jié)果顯示，與正常組相比，LPS組ATF-6和p-IRE1α表達(dá)量明顯增加（

P

＜0.01）；低高濃度PPF和PBA組能降低ATF-6和p-IRE1α的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。

3 討論

機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重感染，尤其是革蘭陰性菌感染時(shí)極易引起感染性休克。機(jī)體中的致病微生物及其毒產(chǎn)物等進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)后，首先激活宿主的免疫細(xì)胞，釋放各種細(xì)胞因子，隨后損傷機(jī)體重要器官如肝臟，導(dǎo)致肝細(xì)胞缺血缺氧、代謝紊亂、功能障礙，甚至肝功能衰竭。LPS是存在于革蘭陰性菌細(xì)胞壁中的主要成分之一，當(dāng)細(xì)菌裂解或死亡時(shí)，LPS才會(huì)從細(xì)胞中釋放出來(lái)，發(fā)揮對(duì)宿主的毒性作用。內(nèi)毒素血癥是肝功能衰竭發(fā)生的外源性物質(zhì)基礎(chǔ)，我們選用LPS誘導(dǎo)L-02人正常肝細(xì)胞損傷，體外模擬感染性休克對(duì)肝細(xì)胞的損傷。結(jié)果表明，LPS會(huì)導(dǎo)致L-02人正常肝細(xì)胞形態(tài)變差，核固縮，存活能力明顯下降；而給予不同濃度的PPF對(duì)LPS致人肝細(xì)胞形態(tài)有一定的改善作用；顯著提高損傷肝細(xì)胞的存活能力，且呈濃度依賴性，說(shuō)明PPF對(duì)受損的肝細(xì)胞具有保護(hù)作用。ALT和AST是臨床上最常用的肝功能檢測(cè)指標(biāo)之一，有研究表明，肝細(xì)胞損傷時(shí)，ALT和AST表達(dá)明顯升高，其表達(dá)水平與肝細(xì)胞受損的程度呈正相關(guān)。為了確定PPF是否對(duì)受損的肝細(xì)胞具有保護(hù)作用，我們采用ELISA試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中AST和ALT的濃度。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS組肝細(xì)胞中ALT和AST表達(dá)顯著升高，說(shuō)明模型的成功建立；而給予不同濃度的PPF后降低了ALT和AST的含量。

表4 各組細(xì)胞中ATF-6和p-IRE1α蛋白的表達(dá)/±s

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組L-02細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)

越來(lái)越多的證據(jù)表明，肝臟調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥有關(guān)。誘發(fā)炎癥的病原體相關(guān)分子和損傷相關(guān)分子會(huì)激活所謂的“急性期反應(yīng)”，主要是由IL-6、轉(zhuǎn)錄激活因子3、促炎細(xì)胞因子IL-1β和腫瘤壞死因子α（TNF-α）介導(dǎo)的早期全身反應(yīng)。急性期反應(yīng)的靶點(diǎn)肝細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生急性期蛋白，使代謝和分泌蛋白的儲(chǔ)備適應(yīng)變化的需求。急性期蛋白可迅速誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生以防御為主的非特異性反應(yīng)，清除入侵機(jī)體的病原體或損傷的組織，同時(shí)激活抗炎和肝臟免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。但是，未能被清除的病原體或損傷的組織及炎癥進(jìn)一步發(fā)展，則可導(dǎo)致肝臟慢性感染、自身免疫反應(yīng)及惡性腫瘤的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組相比，LPS組人肝細(xì)胞中的IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)顯著升高。說(shuō)明LPS可能通過(guò)炎性因子釋放來(lái)?yè)p傷肝細(xì)胞，而給予不同劑量的PPF后的人肝細(xì)胞與LPS組相比，IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA水平的表達(dá)顯著降低。說(shuō)明PPF可以通過(guò)抑制炎性因子的釋放來(lái)發(fā)揮對(duì)受損肝細(xì)胞的保護(hù)作用。

有證據(jù)表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)直接相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）是蛋白質(zhì)折疊修飾組裝以及細(xì)胞內(nèi)鈣貯存的場(chǎng)所，約1/3新合成的蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)到ER內(nèi)并折疊成正確的三維結(jié)構(gòu)，然后運(yùn)輸?shù)竭_(dá)目的地。當(dāng)?shù)鞍装l(fā)生不正確的加工或修飾時(shí)，將會(huì)引起ER平衡失調(diào)，從而導(dǎo)致ER應(yīng)激。早期的ER應(yīng)激通過(guò)激活非折疊蛋白反應(yīng)（UPR）減輕ER內(nèi)壓力，而長(zhǎng)期嚴(yán)重的ER應(yīng)激則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡。NF-κB是一類轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，參與多種炎癥基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。靜息狀態(tài)下，NF-κB與NF-κB抑制蛋白（IκB）形成復(fù)合物，以無(wú)活性形式存在于胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受多種外界因素（包括應(yīng)激性損傷細(xì)菌脂多糖病毒氧自由基和細(xì)胞因子）刺激后，IκB激酶復(fù)合物（IKK）被激活并磷酸化IκB，使NF-κB游離并暴露核定位位點(diǎn)，游離的NF-κB迅速移位到細(xì)胞核，與NF-κB反應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)域的特異性序列結(jié)合，參與炎癥反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。目前研究發(fā)現(xiàn)UPR的3條信號(hào)通路，即PERK、IRE1α和ATF-6均能激活NF-κB。本研究發(fā)現(xiàn)LPS組細(xì)胞NF-κB p65、p-IRE1α/IRE1α和ATF-6的表達(dá)較正常組明顯升高，低高劑量PPF治療后NF-κB p65、p-IRE1α/IRE1α和ATF-6增強(qiáng)的作用被抑制。為了進(jìn)一步證實(shí)PPF對(duì)LPS損傷的肝細(xì)胞的治療效果，我們采用了ER-stress的抑制劑PBA作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量PPF與PBA的治療效果相當(dāng)。

綜上所述，PPF有助于緩解LPS誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞損害反應(yīng)，抑制炎性因子的釋放，發(fā)揮肝保護(hù)作用。其機(jī)制可能與PPF減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，抑制炎癥通路NF-κB的活化，維持體內(nèi)細(xì)胞所處的微環(huán)境穩(wěn)定有關(guān)，但具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。