馬宇倩　馬孝紅　路會俠

【摘要】 目的：觀察小鼠異位子宮內(nèi)膜組織中自噬標(biāo)記物Beclin 1及血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達變化情況，探討維甲酸（Retinoic Acid，RA）對異位子宮內(nèi)膜病灶中自噬及血管生成的作用。方法：100只BALB/c雌性小鼠分為5組：CTRL組，EMs組，LOW組[100 mg/（kg·d）]，HIGH組[200 mg/（kg·d）]，CQ組;藥物灌胃7 d后處死取材，行Real-time PCR，Western blotting定量分析及MVD測定。結(jié)果：EMs組、LOW組Beclin 1、VEGF mRNA表達均高于CTRL組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;HIGH組Beclin 1、VEGF mRNA表達均低于LOW組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。EMs組、LOW組Beclin 1、VEGF蛋白表達均高于CTRL組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;HIGH組Beclin 1、VEGF蛋白表達均低于LOW組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。EMs組、LOW組MVD計數(shù)均高于CTRL組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;HIGH組MVD計數(shù)低于LOW組和EMs組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：高劑量維甲酸可抑制EMs異位病灶中的自噬及血管生成。

【關(guān)鍵詞】 子宮內(nèi)膜異位癥 維甲酸 自噬 血管生成

Effects of Retinoic Acid on Autophagy and Angiogenesis in Ectopic Endometrial Tissue/MA Yuqian， MA Xiaohong， LU Huixia. //Medical Innovation of China， 2021， 18（36）： 0-026

[Abstract] Objective： To observe the expression of autophagy marker Beclin 1 and vascular endothelial growth factor （VEGF） in mouse ectopic endometrium， and to explore the effect of Retinoic Acid （RA） on autophagy and angiogenesis in ectopic endometrium. Method： 100 BALB/c female mice were divided into 5 groups， CTRL group， EMs group， LOW group [100 mg/（kg·d）]， HIGH group [200 mg/（kg·d）]， CQ group; after 7 days of drug gavage， they were killed and taken for real-time PCR， Western blotting quantitative analysis and MVD determination. Result： The mRNA expressions of Beclin 1 and VEGF in EMs group and LOW group were higher than those in CTRL group， the differences were statistically significant （P<0.05）; the mRNA expressions of Beclin 1 and VEGF in HIGH group were lower than those in LOW group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The protein expressions of Beclin 1 and VEGF in EMs group and LOW group were higher than those in CTRL group， the differences were statistically significant （P<0.05）; the protein expressions of Beclin 1 and VEGF in HIGH group were lower than those in LOW group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The MVD counts in EMs group and LOW group were higher than those in CTRL group， the differences were statistically significant （P<0.05）; the MVD count in HIGH group was lower than that in LOW group and EMs group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： High dose Retinoic Acid can inhibit autophagy and angiogenesis in ectopic lesions of EMs.

[Key words] Endometriosis Retinoic Acid Autophagy Angiogenesis

First-author’s address： Clinical Medicine Collage of Dali University， Yunnan Province， Dali 671000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.36.006

子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EMs）是有生長活性的子宮內(nèi)膜組織、腺體和間質(zhì)，異位到子宮腔以外的部位并生長，發(fā)病機制與自噬（autophagy）密切相關(guān)[1]。組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)異位內(nèi)膜組織最典型的特征之一就是密集的血管化及高表達的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）[2]，臨床使用抗血管治療可以降低EMs的復(fù)發(fā)率[3]。維甲酸（Retinoic Acid，RA）主要用于治療某些細胞增殖性疾病和高VEGF表達的疾病。RA可通過抑制細胞自噬從而抑制高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和管腔形成[4]。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)RA在體外可誘導(dǎo)異位內(nèi)膜基質(zhì)細胞中自噬標(biāo)記物Beclin 1表達增加[5]，但體內(nèi)異位內(nèi)膜組織中RA如何影響自噬，是否對EMs的血管生成（angiogenesis）有作用尚不清楚。本研究擬使用小鼠動物模型觀測RA對異位內(nèi)膜組織中Beclin1和VEGF表達的變化，進一步探討RA對EMs異位內(nèi)膜組織中自噬與血管生成的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 Beclin 1多克隆抗體（美國Cell Signal公司），VEGF多克隆抗體（美國Cell Signal公司），氯喹（Chloroquine，CQ），RA（美國 selleckchem公司），山羊抗兔二抗（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2 實驗動物分組與給藥 于2019年5-9月飼養(yǎng)SPF級BALB/c雌性成年小鼠共100只，體重（25.00±3.49）g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK（滇）2014-0011，共分為5組，每組20只。對照組（CTRL組）正常飼養(yǎng)，未做任何處理;其余采用自體移植法建立人工EMs小鼠模型，造模成功后，隨機分為：單純手術(shù)組（EMs組），RA低劑量組[LOW組，100 mg/（kg·d）]，RA高劑量組[HIGH組，200 mg/（kg·d）]，氯喹組[CQ組，40 mg/（kg·d）]，各組分別用相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)治療7 d。本動物實驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，符合動物倫理要求。7 d后，小鼠斷頭采血備用，同時摘取卵巢、剝離在位子宮內(nèi)膜和異位子宮內(nèi)膜，常規(guī)固定于4%多聚甲醛中，用于組織切片分析;取部分異位內(nèi)膜組織，去除周圍的腹壁組織，液氮冷凍保存待用。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 實時定量PCR檢測Beclin 1、VEGF mRNA表達 組織總RNA提取按Trizol試劑說明書進行，進行小鼠內(nèi)膜組織總RNA抽提純化和互補脫氧核糖核酸合成。每份樣本設(shè)計3個復(fù)孔?；靹蚝?，放入PCR儀，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃ 15 s、

60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，共30個循環(huán)。樣本RT-qPCR，95 ℃ 1 min，95 ℃ 3 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共35循環(huán)。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成。見表1。

1.3.2 蛋白印跡法（Western blotting）分析Beclin 1、VEGF蛋白表達 稱標(biāo)本質(zhì)量，勻漿凍干，蛋白小丸用蒸餾水溶解，樣本加到10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）上，電泳分離出待檢測蛋白后電轉(zhuǎn)移，脫脂牛奶室溫下封閉2 h，用洗脫緩沖液漂洗3次，10 min/次，加入抗體（1︰1 000），4 ℃過夜，再次漂洗，加入二抗

（1︰2 000），室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色并照相，用ImageJ分析各條帶吸光度值D。

1.3.3 微血管密度（microvessel density，MVD）測定 MVD（×200倍鏡下選擇5個最高MVD區(qū)域進行計數(shù)，取平均值）。所有剝離出來的異位內(nèi)膜組織標(biāo)本HE染色后，以抗CD34單克隆抗體標(biāo)記血管中層及斑塊的內(nèi)皮細胞，然后在高倍鏡下計數(shù)每一視野的微血管數(shù)，以被染成棕褐色的單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇作為1個血管計數(shù)，只要結(jié)構(gòu)不相連，其分支結(jié)構(gòu)也計作一條血管。計數(shù)方法：在至少3個異位內(nèi)膜血管著色最密集的區(qū)域和高倍鏡（×200，每個視野面積1.0 mm2）下計數(shù)微血管數(shù)，并取其平均值作為該片的MVD值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實時定量PCR檢測各組GAPDH、VEGF、Beclin 1 mRNA表達水平比較 EMs組、LOW組Beclin 1、VEGF mRNA表達均高于CTRL組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;HIGH組Beclin 1、VEGF mRNA表達均低于LOW組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;HIGH組Beclin 1、VEGF mRNA表達與CTRL比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。HIGH組Beclin 1、VEGF mRNA表達與CQ組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖1和表2。

2.2 蛋白印跡法分析各組GAPDH、VEGF、Beclin 1

mRNA表達水平 EMs組、LOW組Beclin 1、VEGF蛋白表達均高于CTRL組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;HIGH組Beclin 1、VEGF蛋白表達均低于LOW組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;HIGH組Beclin 1、VEGF蛋白表達與CQ組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖2、3和表3。

2.3 各組小鼠MVD計數(shù)比較 依據(jù)Weidne法行MVD計數(shù)，CD34染色的微血管結(jié)構(gòu)（圖4）。CTRL組MVD計數(shù)為（21.69±6.73），EMs組MVD計數(shù)為（68.07±5.54），LOW組MVD計數(shù)為（51.98±2.46），HIGH組MVD計數(shù)為（38.32±5.03），CQ組MVD計數(shù)為（30.91±3.23）。EMs組、LOW組MVD計數(shù)均高于CTRL組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;HIGH組MVD計數(shù)低于LOW組和EMs組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

真核細胞通過利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質(zhì)完成自噬，應(yīng)對環(huán)境改變。當(dāng)EMs異位病灶處于氧化應(yīng)激、炎癥等刺激下或患者雌、孕水平變化均可影響異位內(nèi)膜細胞的自噬活性[6-8]。

EMs具有侵襲、種植、轉(zhuǎn)移等與惡性腫瘤相似的特點，某些抑癌基因可能通過調(diào)節(jié)自噬參與EMs的發(fā)生發(fā)展[9]。Beclin 1既是抑癌基因，又是自噬的正向調(diào)控因子，在EMs病程中必不可少[10]。自噬能夠促進腫瘤血管生成，機制是通過保護性自噬維持細胞內(nèi)代謝平衡和細胞穩(wěn)態(tài)，從而調(diào)控血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）的形成[11]。自噬特異性基因Beclin 1參與了胃癌中VM的形成[12-13]。本實驗發(fā)現(xiàn)Beclin 1及VEGF在EMs異位病灶中高表達，MVD數(shù)量亦最大，提示自噬對血管生成有促進作用。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）聯(lián)合抗-VEGF在抑制視網(wǎng)膜新生血管中可能比單純抗-VEGF發(fā)揮更好的作用[14]。筆者應(yīng)用自噬抑制劑CQ同樣下調(diào)了異位病灶中VEGF的表達，與上述研究結(jié)果一致。

EMs的經(jīng)典治療為手術(shù)治療及術(shù)后長期藥物治療[15]。除對癥治療及激素療法外，新的治療如抗血管生成等“源頭治療”在臨床已有應(yīng)用，包括血管生長因子抑制劑，抗血管生成抑制劑等[16]。RA是天然維生素A的代謝產(chǎn)物，常用于治療某些細胞增殖性疾?。ㄈ绨籽。┖透遃EGF表達的惡性腫瘤。RA及其下游途徑通過控制促血管生成或抗血管生成信號調(diào)控血管生成。在脈絡(luò)膜、大腦皮質(zhì)及肺，RA以血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）為靶點調(diào)控血管生成[17]。崔仁哲等[18]報道RA可抑制角膜新生血管中VEGF的表達而抑制新血管的形成。全反式維甲酸（ATRA）可降低食管癌細胞VEGF等的表達影響新生血管的生成[19]。RA針對EMs中血管的作用報道較少。筆者前期細胞實驗發(fā)現(xiàn)RA可誘導(dǎo)異位內(nèi)膜基質(zhì)細胞中自噬的發(fā)生，且與濃度呈正相關(guān)[20]。在本次動物實驗中，高濃度RA抑制Beclin1并下調(diào)VEGF表達，作用效果與自噬抑制劑CQ幾乎相等，表現(xiàn)出對血管生成的調(diào)控作用。

RA調(diào)節(jié)血管生成的機制尚不十分清楚，已有報道PI3K/Akt/mTOR是重要的調(diào)節(jié)VEGF 表達的信號通路[21]，周凡[22]發(fā)現(xiàn)atRA（全反式維甲酸）可顯著激活3T3-L1 前脂肪細胞中PI3K/AKT/mTOR 通路; 孫林[23]實驗證明扶腎方可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路發(fā)揮抑制腹膜血管新生作用。RA對子宮內(nèi)膜異位癥中自噬及血管生成調(diào)節(jié)作用的機制及內(nèi)在的相關(guān)性，有待進一步

研究。

參考文獻

[1] YANG S，WANG H，LI D，et al.Role of endometrial autophagy in physiological and pathophysiological processes[J].J Cancer，2019，10（15）：3459-3471.

[2] Vallée A，Lecarpentier Y.Curcumin and Endometriosis[J].Int J Mol Sci，2020，21（7）：2440-2556.

[3] Kiani K，Rudzitiss-Auth J，Scheuer C，et al.Calligonum comosum （Escanbil） extract exerts anti-angiogenic， anti-proliferative and anti-inflammatory effects on endometriotic lesions[J].J Ethnopharmacol，2019，15（239）：111918.

[4]李蓉，陳琳，李亞，等.迷迭香酸通過調(diào)控自噬抑制高糖誘導(dǎo)的HRMEC血管生成[J].中國中醫(yī)眼科雜志，2020，10：691-698.

[5] LU H，LI S，WU Q.Retinoic acid regulates endometriotic stromal cell growth through upregulation of Beclin1[J].Arch Gynecol Obstet，2018，297（1）：93-99.

[6] LIU Y，LU C，F(xiàn)AN L.MiR-199a-5p Targets ZEB1 to Inhibit the Epithelial- Mesenchymal Transition of Ovarian Ectopic Endometrial Stromal Cells Via PI3K/Akt/mTOR Signal Pathway In Vitro and In Vivo[J].Reprod Sci，2020，27（1）：110-118.

[7]楊諾，李文.血紅素加氧酶1對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用[J].醫(yī)學(xué)綜述，2019，25（12）：2289-2295.

[8] Devis-Jauregui L，Eritja N，Davis M L，et al.Autophagy in the physiological endometrium and cancer[J].Autophagy，2020，13：1-19.

[9] ZHAN L，LI J，WEI B.Autophagy in endometriosis： friend or foe？[J].Biochem Biophys Res Commun，2018，495（1）：60-63.

[10]孔志偉，姚婷婷.自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3與子宮內(nèi)膜異位癥的研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2019，25（21）：4166-4173.

[11] DUAN S.Silencing the autophagy-specific gene Beclin-1 contributes to attenuated hypoxia-induced vasculogenic mimicry formation in glioma[J].Cancer Biomarkers，2018，21（3）：565-574.

[12] DONG X，HONG Y，SUN H， et al.NDRG1 suppresses vasculogenic mimicry and tumor aggressiveness in gastric carcinoma[J].Oncology letters，2019，18（3）：3003-3016.

[13] LU H，LI S，WU Q.Retinoic acid regulates endometriotic stromal cell growth through upregulation of Beclin1[J].Arch Gynecol Obstet，2018，297（1）：93-99.

[14]陳萌，李蓉，姚楊，等.自噬抑制聯(lián)合抗-VEGF對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞血管生成的作用[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2017，33（24）：38-42.

[15]中國醫(yī)師協(xié)會婦產(chǎn)科醫(yī)師分會子宮內(nèi)膜異位癥專業(yè)委員會，中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科學(xué)分會子宮內(nèi)膜異位癥協(xié)作組.子宮內(nèi)膜異位癥長期管理中國專家共識[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2018，53（12）：836-841.

[16] Lavogina D，Külli S，Lavrits A，et al.Chemosensitivity and chemoresistance in endometriosis-differences for ectopic versus eutopic cells[J].Reprod Biomed Online，2019，39（4）：556-568.

[17] Pawlikowski B，Wragge J，Siegenthaler J A.Retinoic acid signaling in vascular development[J].Genesis，2019，57（7-8）：e23287.

[18]崔仁哲，孫麗霞.維甲酸治療大鼠角膜堿燒傷的效果觀察[J].中華眼外傷職業(yè)眼病雜志，2018，40（5）：337-342.

[19] LI N，LU Y，LI D，et al.All-trans retinoic acid suppresses the angiopoietin-Tie2 pathway and inhibits angiogenesis and metastasis in esophageal squamous cell carcinoma[J/OL].PLoS One，2017，12（4）：e0174555.

[20]董少瑞，李紹波，路會俠.維甲酸對異位內(nèi)膜基質(zhì)細胞Beclin-1的影響研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2018，47（25）：3253-3256.

[21]馬金赫，王德瑩，陳秀慧，等.PI3K/Akt/mTOR和MAPK信號通路與子宮內(nèi)膜異位癥的研究進展[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2015，24（1）：78-80.

[22]周凡.atRA通過上調(diào)脂肪細胞VEGF表達促進內(nèi)皮細胞管形成及其機制研究[D].衡陽：南華大學(xué)，2020.

[23]孫林.基于PI3K/Akt/mTOR通路探討扶腎方抑制腹膜透析相關(guān)腹膜血管新生機制的研究[D].天津：天津中醫(yī)藥大學(xué)，2021.

（收稿日期：2021-04-26） （本文編輯：姬思雨）