趙舒雅 李航 樊賽軍

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 300192

宮頸癌是世界上最常見的女性惡性腫瘤之一，居全球女性癌癥患者病死原因的第二位[1]，在發(fā)展中國(guó)家尤為常見。近年來，我國(guó)宮頸癌患者也逐漸增多，每年病死于宮頸癌的患者約有5 萬(wàn)例[2]，且患者年齡呈年輕化趨勢(shì)。從病因角度分析，約有95%的患者因人乳頭瘤狀病毒（HPV）感染罹患宮頸癌，部分感染者體內(nèi)的人乳頭瘤狀病毒（HPV）隨時(shí)間延長(zhǎng)而被清除，還有部分患者因持續(xù)感染導(dǎo)致宮頸癌變[3]。放療是治療宮頸癌的常用方法，但約有30%的晚期宮頸癌患者經(jīng)放療后出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后不佳，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[4]。因此，如何有效增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性，減少放療對(duì)正常組織的放射損傷及放療后的不良反應(yīng)，提高放療的療效，成為亟待解決的問題。

龍蝦肽酶樣金屬內(nèi)肽酶（astacin-like metalloendopeptidase，ASTL）是一類與卵母細(xì)胞表面相關(guān)的鋅基質(zhì)金屬蛋白酶。ASTL 基因編碼含有431 個(gè)氨基酸、相對(duì)分子質(zhì)量為46 000 的蛋白產(chǎn)物。生物信息學(xué)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，ASTL 蛋白由N 端信號(hào)肽、含有催化位點(diǎn)模序的蛋白酶功能區(qū)和C 末端多肽組成[5]。ASTL 的基因序列在不同物種間相對(duì)保守（如人與小鼠的同源率高達(dá)75.2%），但基因的組織表達(dá)特異性顯著，同時(shí)ASTL 蛋白可以在精卵相互作用時(shí)發(fā)揮功能，并在受精過程中阻止多精入卵[6]。有研究結(jié)果表明，ASTL 在腫瘤和正常細(xì)胞中存在表達(dá)差異，其表達(dá)水平與子宮癌、卵巢癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，并可作為診斷子宮癌的生物標(biāo)志物；同時(shí)由于膜蛋白易與抗體結(jié)合，加入蛋白抗體可促進(jìn)ASTL 在溶酶體中的降解，進(jìn)而影響子宮癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此ASTL還可以作為子宮癌免疫治療的一種新型藥物靶點(diǎn)[7-8]。本研究探討ASTL 蛋白在人宮頸癌ME-180細(xì)胞抵抗輻射中的作用，旨在為宮頸癌及ASTL 與放療增敏的相關(guān)臨床與基礎(chǔ)研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DMEM 液體培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自以色列Biological 生物科技公司；青鏈霉素雙抗購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；Hoechst 33342 反應(yīng)液、二甲基亞砜、谷氨酰胺、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]溶液、RIPA 裂解液、蛋白加樣緩沖液、Triton X-100、牛血清白蛋白、抗熒光衰減封片劑均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Lipofectamine 3000、Trizol試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 生命技術(shù)有限公司；ECL超敏發(fā)光液購(gòu)自白鯊生物科技公司；短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）ASTL（sh-ASTL）質(zhì)粒購(gòu)自蘇州金唯智生物科技有限公司；cDNA 合成試劑盒購(gòu)自日本 TaKaRa 公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒、聚偏氟乙烯（PVDF）膜均購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；兔抗人ASTL 抗體購(gòu)自上海滬震生物科技公司；磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，pAKT）抗體、 甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體均購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；AKT 抗體、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G 及熒光素異硫氰酸酯（FITC）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G 均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU）試劑盒購(gòu)自南京恩晶科技生物有限公司；細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒均購(gòu)自上海貝博生物科技有限公司。Gammacell?40 Exactor137Cs γ 射線照射源，劑量率為1 Gy/min，購(gòu)自加拿大Best Theratronics 公司；RT-6500 酶標(biāo)分析儀購(gòu)自深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；D3024R 離心機(jī)購(gòu)自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器北京股份公司；TCS SP5 激光掃描共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)徠卡公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和照射

人宮頸癌HeLa 細(xì)胞、ME-180 細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心。用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)ME-180 細(xì)胞；用含10%胎牛血清、3%谷氨酰胺、1%青鏈霉素雙抗的DMEM 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa 細(xì)胞。培養(yǎng)條件為5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶約80%時(shí)進(jìn)行傳代亞培養(yǎng)。

根據(jù)細(xì)胞處理方法的不同，按以下方式進(jìn)行分組。（1）將ME-180 細(xì)胞分為4 組：對(duì)照組、照射組（4 Gy）、ASTL 抗體組和ASTL 抗體+照射組（4 Gy），采用EdU 染色、MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的存活情況和增殖能力，并于照射后0、24、48、72 h采用免疫熒光、Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ASTL 在細(xì)胞中的定位情況。（2）將ME-180 細(xì)胞分為2 組：照射組、ASTL 抗體+照射組，分別進(jìn)行0、2、4、8 Gy 照射，并采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)每組細(xì)胞的增殖能力。（3）將HeLa 細(xì)胞分為2 組：對(duì)照組、ASTL 抗體組，分別進(jìn)行0、2、4、8 Gy 照射，采用MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的存活情況。（4）將ME-180 細(xì)胞分為2 組：短發(fā)夾RNA 對(duì)照組（sh-對(duì)照組）、短發(fā)夾RNA ASTL 轉(zhuǎn)染組（sh-ASTL 組），采用qRT-PCR、Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AKT 等靶基因的表達(dá)；同時(shí)，分別用0、5、10 nmoL/L 的抗體處理ME-180 細(xì)胞，采用Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體中和對(duì)靶基因表達(dá)情況的影響。（5）將ME-180細(xì)胞分為2 組：對(duì)照組、照射組（4 Gy），采用Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ASTL、AKT 等靶基因的表達(dá)情況。

以上除第（4）組實(shí)驗(yàn)提到的抗體濃度，其他實(shí)驗(yàn)所用抗體濃度均為5 nmoL/L。所有照射均使用137Cs γ 射線照射源，劑量率為1 Gy/min。

1.3 EdU 染色實(shí)驗(yàn)

將接受不同處理后且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ME-180細(xì)胞，按1×103個(gè)/孔接種于96 孔板中，4 Gy 照射后24 h 進(jìn)行EdU 染色實(shí)驗(yàn)。制備適量50 μmol/L的EdU 培養(yǎng)基，每孔100 μL，37℃孵育2 h；PBS洗2 次，每次5 min；加入50 μL 4%多聚甲醛室溫固定30 min，固定完成后棄去細(xì)胞固定液；加入3%牛血清白蛋白洗2 次；加入100 μL 0.5%Triton X-100 的PBS，室溫孵育10 min；加入100 μL PBS，脫色搖床洗5 min；加入100 μL 1×X Apollo?染色反應(yīng)液，室溫、避光條件下，脫色搖床孵育30 min；棄除染色反應(yīng)液后，加入滲透劑（0.5%Triton X-100 的PBS），每孔100 μL，室溫反應(yīng)10 min，除去滲透劑；加入100 μL 的甲醇洗2 次，每次5 min；加入100 μL PBS 洗滌，5 min；加入100 μL 1×Hoechst 33342 反應(yīng)液，搖床孵育30 min，注意避光，棄去反應(yīng)液；加入100 μL PBS 清洗2 次。染色完成后，立即觀察并獲取圖像。

1.4 MTT 實(shí)驗(yàn)

ME-180 細(xì)胞、HeLa 細(xì)胞接受不同劑量（0、2、4、8 Gy）的射線照射后，按3×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，培養(yǎng)20 h 后，每孔加入20 μL 的 MTT溶液，于37℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，加入100 μL 二甲基亞砜，搖床低速振搖10 min。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞在490 nm 處的吸光度。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)

ME-180 細(xì)胞接受不同劑量（0、2、4、8 Gy）的射線照射后，立即將約2000 個(gè)不同處理組的細(xì)胞接種至60 mm 的培養(yǎng)皿中。細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)3 周至出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，棄掉培養(yǎng)基用甲醇固定30 min，加姬姆薩應(yīng)用液染色30 min，流水洗凈，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)≥50 個(gè)作為1 個(gè)克隆，計(jì)算克隆數(shù)。細(xì)胞克隆形成率=照射細(xì)胞克隆數(shù)/未照射同種細(xì)胞克隆數(shù)×100%。

1.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

將1×105個(gè)ME-180 細(xì)胞接種到放置有蓋玻片的6 孔板中，24 h 后進(jìn)行4 Gy 照射4 min。（1）分別在照射后0、24、48、72 h 去掉培養(yǎng)基，PBS 清洗2 次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，室溫下固定15 min。（2）0.3% Triton X-100 室溫下處理細(xì)胞15 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h。（3）加入兔抗人ASTL 抗體（1∶400 稀釋）30 μL，4℃孵育過夜，PBS 清洗 3 次，加入異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（1∶1000 稀釋） ，室溫孵育1 h，PBS 清洗。（4）PBS 中搖晃清洗3 次，滴加50 μL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液于蓋玻片，室溫孵育30 min。（5）PBS 中搖晃清洗3 次，用30 μL抗熒光衰減封片劑進(jìn)行封片，干燥后于熒光顯微鏡下觀察。使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察照射后不同時(shí)間點(diǎn)（0、24、48、72 h）ASTL 在細(xì)胞中的定位情況。

1.7 Western blot 實(shí)驗(yàn)

PBS 清洗處理后的ME-180 細(xì)胞，將150 μL/孔R(shí)IPA 裂解液加入6 孔板，并置于冰上裂解細(xì)胞2 h，10 000×g離心10 min，取上清液。加入等體積的2 倍濃度的蛋白加樣緩沖液，沸水煮沸5 min，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，將聚偏氟乙烯（PVDF）膜切成凝膠大小，在100%甲醇中預(yù)浸一下后浸泡在緩沖液中，保持膜和凝膠濕潤(rùn)；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；依次加入兔抗人ASTL 抗體（1∶400稀釋）、AKT 抗體、pAKT 抗體、ERK1 抗體（均為1∶1000 稀釋），4℃孵育過夜；用TBST（ tris buffered saline with tween）緩沖液洗3 次，每次15 min；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（1∶2000 稀釋）室溫孵育1 h，TBST 洗3 次，每次15 min；用ECL（enhanced chemiluminescent）發(fā)光法檢測(cè)蛋白的表達(dá)。

1.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和抗體處理

轉(zhuǎn)染前1 d，將密度為1×105個(gè)/mL 的ME-180細(xì)胞接種于6 孔板中，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度保持在70%左右。用125 μL 無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基分別與3.75 μL、7.5 μL 的Lipofectamine 3000混合，混勻后室溫下孵育5 min，為A 液；用125 μL無血清無抗生素的DMEM 培養(yǎng)基稀釋sh-ASTL，1 μg/孔sh-ASTL，混勻后孵育5 min，為B 液；將A、B 溶液混勻即為轉(zhuǎn)染液，孵育30 min。轉(zhuǎn)染時(shí)去掉6 孔板中的培養(yǎng)基，PBS 洗2～3 次，每孔加入約2 mL 無血清無抗生素的DMEM 培養(yǎng)基，將孵育后的轉(zhuǎn)染液加入6 孔板中，輕輕搖晃混合；于37℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h 后換為含血清、青鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)[9]。24 h后收集細(xì)胞，檢測(cè)ME-180 細(xì)胞中AKT、ASTL等mRNA 與靶基因的表達(dá)情況。同時(shí)，分別用0、5、10 nmoL/L 的抗體處理ME-180 細(xì)胞，檢測(cè)抗體中和對(duì)靶基因表達(dá)情況的影響。

1.9 qRT-PCR 檢測(cè)AKT 表達(dá)

將700 μL/孔 Trizol 試劑加入6 孔板裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，將提取的RNA 按照cDNA合成試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，將甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）mRNA 的表達(dá)量作為內(nèi)參。進(jìn)行qRT-PCR，分析其擴(kuò)增曲線和融解曲線。擴(kuò)增條件： 95℃預(yù)變性 30 s；95℃變性3 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40 次，數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。 實(shí)驗(yàn)所需引物來源于GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）以及miRBase（https://www.mirbase.org）數(shù)據(jù)庫(kù)，通過Primer Premier 5 軟件（購(gòu)自美國(guó)PREMIER Biosoft公司）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，具體序列見表1。

表1 mRNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物序列Table 1 The primers for quantitative real-time PCR analysis of the mRNA

1.10 細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)蛋白的提取

取5×106～10×106個(gè)經(jīng)5 nmoL/L 兔抗人ASTL 抗體處理的ME-180 細(xì)胞，在4℃、500×g條件下離心3 min，小心去除培養(yǎng)基，收集細(xì)胞。用冷PBS 洗滌細(xì)胞2 次。按照細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白。細(xì)胞樣品中加入200 μL 冷的試劑A、 2 μL 蛋白酶抑制劑混合物、2 μL蛋白穩(wěn)定劑，高速渦旋振蕩15 s，置冰上10 min。再次高速渦旋振蕩5 s，然后在4℃、13 000×g條件下離心5 min?？焖賹⑸锨遛D(zhuǎn)移至另一預(yù)冷的干凈離心管，37℃水浴5～10 min，37℃下2 000×g離心5 min，此時(shí)溶液分為兩層（對(duì)著光線看），下層相約為20 μL，收集上層相，即為細(xì)胞質(zhì)蛋白。用150～200 μL 冷的試劑B 稀釋下層相，混勻后冰浴2 min，37℃水浴10 min，37℃下22 000×g離心5 min，此時(shí)溶液分為兩層（對(duì)著光線看），下層相約為20 μL，用100 μL冰冷的試劑C 稀釋下層相，即得細(xì)胞膜蛋白。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用 IBM SPSS Statistics 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布、方差齊性檢驗(yàn)后，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ASTL 對(duì)宮頸癌細(xì)胞放射敏感性的影響

EdU 染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ASTL 抗體組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.45，P＞0.05），照射組（4 Gy）和ASTL 抗體組與ASTL 抗體+照射組（4 Gy）比較，細(xì)胞增殖的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.25、11.16，均P＜0.05）（圖1A）。MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，照射后24、48、72 h 時(shí)照射組（4 Gy）和ASTL 抗體組ME-180 細(xì)胞增殖速度的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.16、2.33、2.57，均P＞0.05；t=2.11、2.43、2.77，均P＞0.05）；而與照射組相比，ASTL 抗體+照射組（4 Gy）ME-180 細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.17、10.32、14.27，均P＜0.05）（圖1B）。在HeLa細(xì)胞的MTT 實(shí)驗(yàn)中也得到同樣的結(jié)果，與照射組相比，ASTL 抗體+照射組2、4、8 Gy 受照射細(xì)胞的生長(zhǎng)受到顯著抑制，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.27、9.66、15.71，均P＜0.05）（圖1C）。ME-180細(xì)胞的克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與照射組相比，ASTL 抗體+照射組能夠顯著抑制8 Gy 照射后ME-180 細(xì)胞的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.63，P＜0.05）（圖1D）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ASTL 抗體能夠通過中和ASTL 抑制照射后ME-180 細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，初步揭示ASTL 在受到照射后的ME-180細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

圖1 ASTL 抗體對(duì)人宮頸癌ME-180 和HeLa 細(xì)胞放射敏感性的影響 A 為EdU 染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ME-180 細(xì)胞在接受不同條件處理后細(xì)胞的增殖情況，左圖中從左到右依次為EdU 染色、Hoechst 活細(xì)胞染色及二者合并圖，右圖為陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，a 表示與ASTL 抗體+照射組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.25、11.16，P＜0.05）；B 為MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ME-180 細(xì)胞在接受不同條件處理后的細(xì)胞存活情況，a 表示與照射組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.17、10.32、14.27，均P＜0.05）；C 為MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HeLa 細(xì)胞在接受不同條件處理后的細(xì)胞存活情況，a 表示與照射組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.27、9.66、15.71，均P＜0.05）；D 為克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ASTL 抗體對(duì)不同劑量照射后ME-180 細(xì)胞增殖能力的影響，a 表示與照射組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.63，P＜0.05）。ASTL 為龍蝦肽酶樣金屬內(nèi)肽酶；EdU 為5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷；Hoechst 為赫斯特活細(xì)胞染色；MTT 為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽Figure 1 Effect of astacin-like metalloendopeptidase antibody on radiosensitivity of human cervical cancer ME-180 and HeLa cells

2.2 ASTL 在照射后的ME-180 細(xì)胞中的表達(dá)水平及定位

免疫熒光、Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ME-180細(xì)胞經(jīng)4 Gy 照射后，ASTL 蛋白在ME-180 細(xì)胞中的定位發(fā)生轉(zhuǎn)移。照射后0 h 時(shí)，標(biāo)記ASTL 蛋白的綠色熒光位于細(xì)胞膜；24 h 后，細(xì)胞膜綠色熒光強(qiáng)度降低，細(xì)胞質(zhì)綠色熒光強(qiáng)度升高；照射后48～72 h，ASTL 重新定位在細(xì)胞膜上（圖2A、B）。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ASTL 抗體加入后，細(xì)胞總蛋白量下降，ASTL 蛋白在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜的定位數(shù)減少，照射后24 h，ASTL 蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的定位數(shù)增加，但低于照射組（圖2C）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，照射后的ME-180 細(xì)胞中ASTL 蛋白水平上調(diào)，定位由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，且發(fā)揮功能后又重新定位至細(xì)胞膜。重新定位后，ASTL 蛋白量與轉(zhuǎn)移前無明顯差異。

圖2 4 Gy γ 射線照射對(duì)ASTL 蛋白在人宮頸癌ME-180 細(xì)胞中定位的影響 A 為免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ASTL 蛋白在照射后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平以及在細(xì)胞中的定位情況； B 為Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)照射后不同時(shí)間點(diǎn)ASTL 蛋白在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)水平；C 為加入抗體后Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)ASTL 蛋白在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)水平。ASTL 為龍蝦肽酶樣金屬內(nèi)肽酶；DAPI 為4′,6-二脒基-2-苯基吲哚；MERGE 為合并后圖像；GAPDH 為甘油醛-3-磷酸脫氫酶；ATP1B2 為鈉鉀三磷酸腺苷酶通道蛋白2Figure 2 Effect of 4 Gy γ-rays on the localization of astacin-like metalloendopeptidase protein in human cervical epidermal cancer ME-180 cells

2.3 ASTL 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)后對(duì)AKT 等靶基因表達(dá)水平及其信號(hào)通路的影響

采用qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ASTL 干擾后細(xì)胞中與輻射抵抗相關(guān)的部分癌基因的表達(dá)水平變化情況，結(jié)果顯示，ASTL 干擾片段轉(zhuǎn)入后，ME-180細(xì)胞中與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因表達(dá)水平下降最明顯的為AKT，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.94，P＜0.05）（圖3A）。通過Western blot 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了ASTL 對(duì)AKT 信號(hào)通路中相關(guān)靶基因的調(diào)控作用，結(jié)果顯示，ASTL 干擾或加入ASTL 抗體對(duì)輻射后ME-180 細(xì)胞的AKT等靶基因的表達(dá)水平下調(diào)作用顯著（圖3B）。ME-180 細(xì)胞接受4 Gy 照射后，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，照射組（4 Gy）ASTL、AKT 等靶基因的表達(dá)水平顯著升高（圖3C）。綜上，ASTL 抗體或sh-ASTL 可通過中和ASTL 抑制AKT 信號(hào)通路，從而增強(qiáng)ME-180 細(xì)胞的放射敏感性。

圖3 Sh-ASTL 或ASTL 抗體對(duì)人宮頸癌ME-180 細(xì)胞中AKT 等靶基因表達(dá)的影響 A 為qRT- PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ME-180 細(xì)胞中干擾ASTL 后相關(guān)基因的表達(dá)水平變化，a 表示與sh-對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.94、6.37、9.16， 均P＜0.05）；B 為ME-180細(xì)胞接受4 Gy γ 射線照射后24 h 時(shí)，Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ASTL 干擾或抗體中和對(duì)AKT 信號(hào)通路中相關(guān)基因表達(dá)水平的影響；C 為4 Gy γ 射線照射對(duì)ASTL、AKT 等基因表達(dá)水平的影響。AKT 為蛋白激酶B；ATM 為共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因；PDK 為3-磷酸肌醇依賴蛋白激酶；ERK 為細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶；CHK 為沉默細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶；PTEN 為人第10 號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因；Survivin 為凋亡抑制蛋白存活素；ASTL 為龍蝦肽酶樣金屬內(nèi)肽酶；sh-ASTL 為用短發(fā)夾 RNA 敲降A(chǔ)STL；pAKT 為磷酸化蛋白激酶B；GAPDH 為甘油醛-3-磷酸脫氫酶Figure 3 Effect of Sh-ASTL or ASTL antibody on the expression of protein kinase B gene and other target genes in human cervical cancer ME-180 cells

3 討論

宮頸癌的基本治療方法為放療和手術(shù)治療。放療通過能量的釋放阻止細(xì)胞生長(zhǎng)并破壞癌細(xì)胞的生物學(xué)功能，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)，使其減小甚至消失的目的[9-10]。目前放療已成熟應(yīng)用于多種腫瘤治療中。對(duì)于一些無法進(jìn)行手術(shù)的晚期宮頸癌患者來說，放療也能緩解疼痛，延長(zhǎng)壽命，并提高患者生存質(zhì)量[11-12]。目前，放療在宮頸癌的臨床應(yīng)用中仍存在許多問題。尤其隨著放療過程的進(jìn)展，宮頸癌患者的癌細(xì)胞的放射敏感性逐漸降低，腫瘤瘤體持續(xù)快速生長(zhǎng)，發(fā)生浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移，再次降低了患者的生存質(zhì)量[13-14]。

在前期研究中，我們通過人蛋白質(zhì)圖譜（HPA）、癌癥基因圖譜（TCGA）及腫瘤芯片（Scotto Cervix）數(shù)據(jù)庫(kù)獲取了ASTL 基因在多種臨床腫瘤組織中的表達(dá)情況，其中，ASTL 基因在宮頸癌中的異常表達(dá)最為顯著，因此，我們選擇人宮頸癌ME-180 細(xì)胞作為研究對(duì)象。通過人為加入ASTL 抗體中和膜蛋白ASTL，證實(shí)了ASTL 抗體對(duì)ME-180細(xì)胞的放射敏感性具有影響，且隨著照射劑量的增大，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞的存活與增殖情況差異愈顯著。隨后轉(zhuǎn)入ASTL 干擾片段，對(duì)ME-180 細(xì)胞中與宮頸癌發(fā)生相關(guān)的基因表達(dá)變化情況進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，AKT 等靶基因的表達(dá)水平下調(diào)顯著。

磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/AKT 通路是癌癥發(fā)展和治療中最重要的激酶信號(hào)網(wǎng)絡(luò)之一，AKT 是這一通路的中心介質(zhì)，其異常激活與許多惡性腫瘤有關(guān)，包括肺癌[15]、肝細(xì)胞癌[16]、乳腺癌[17]、鼻咽癌[18]和宮頸癌[19]等。活化的AKT 可參與細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[20]，調(diào)控細(xì)胞凋亡[21]進(jìn)程，并與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成等相關(guān)，參與多種生物學(xué)進(jìn)程。目前也有研究結(jié)果證實(shí)，AKT 與腫瘤化療耐藥[22]和輻射抵抗[20]相關(guān)，特別是其參與的信號(hào)通路在輻射抵抗中起關(guān)鍵作用[23]。本研究結(jié)果顯示，γ 射線照射后，ASTL 干擾顯著降低γ 射線照射后ME-180 細(xì)胞的存活與增殖能力，ASTL 抗體的增敏作用隨濃度增加而增強(qiáng)，并伴隨AKT 等靶基因的表達(dá)水平降低。這一結(jié)果提示，ASTL 通過影響AKT 信號(hào)通路介導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的輻射抵抗。且本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，γ 射線照射后，ASTL 在細(xì)胞中的表達(dá)水平升高，并由細(xì)胞膜向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移。在今后的研究中，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)照射后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)的ASTL 蛋白功能開展研究，并且采用更為多樣的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行評(píng)估，深入探究其機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)ME-180 細(xì)胞的放射敏感性與ASTL 的表達(dá)水平相關(guān)，且照射后細(xì)胞的ASTL、AKT 表達(dá)水平升高，而人為中和ASTL后，ME-180 細(xì)胞抵抗輻射的能力降低，放射敏感性顯著提高。因此，隨著ASTL 對(duì)宮頸癌放射敏感性調(diào)控機(jī)制相關(guān)研究的深入，其或可作為治療宮頸癌的新靶點(diǎn)，這具有非常重要的基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值和臨床意義，將為解決宮頸癌放療中細(xì)胞輻射抵抗的難題奠定理論基礎(chǔ)。

利益沖突本研究由署名作者按以下貢獻(xiàn)聲明獨(dú)立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明趙舒雅、李航負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)的實(shí)施、論文的撰寫；樊賽軍負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)的指導(dǎo)、論文的審閱與修改。