姜 藝，顧天豪，夏添松

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺病科，江蘇 南京 210029

在現(xiàn)有的乳腺癌動(dòng)物模型中，嚙齒類動(dòng)物模型憑借價(jià)格低廉、實(shí)驗(yàn)周期短、操作方便等特點(diǎn)，已經(jīng)成為乳腺癌研究中的主要?jiǎng)游锬Ｐ?。但嚙齒類動(dòng)物在端粒長(zhǎng)度、細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力、激素反應(yīng)性和腫瘤微環(huán)境等方面和人類存在較大差異［1］。例如在乳腺癌轉(zhuǎn)移方面，小鼠更加傾向于肺轉(zhuǎn)移，而人類主要發(fā)生骨轉(zhuǎn)移、肝臟轉(zhuǎn)移和腦轉(zhuǎn)移。嚙齒類動(dòng)物的乳腺癌模型存在一定局限性，其他動(dòng)物模型的特殊屬性對(duì)此作出了有效的補(bǔ)充。

本文檢索了近20年來國內(nèi)外乳腺癌實(shí)驗(yàn)的相關(guān)文章，通過綜述樹鼩、犬、豬、兔和斑馬魚等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，歸納現(xiàn)有的特殊乳腺癌動(dòng)物模型，分析模型的優(yōu)缺點(diǎn)，為乳腺癌動(dòng)物模型的選擇提供更恰當(dāng)?shù)男畔ⅰ?/p>

1 樹 鼩

1.1 建模背景

相比于傳統(tǒng)的嚙齒類動(dòng)物，樹鼩（Tupaia be?langer）通過全基因組測(cè)序，證實(shí)其在進(jìn)化層次和系統(tǒng)發(fā)育上更接近于人類［2］。因此可作為一種新型的乳腺癌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。早在1966年，《自然》雜志首次報(bào)道了樹鼩可形成自發(fā)性乳腺癌［3］。此外，也不斷有研究者人工誘導(dǎo)樹鼩肺癌和肝癌的報(bào)道，證明了誘導(dǎo)樹鼩乳腺癌模型具有可行性。

1.2 建模方式

1.2.1 自發(fā)性乳腺癌

樹鼩常自發(fā)乳腺腫瘤，發(fā)病率約為1%，其病理類型主要為導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤、乳頭狀癌和浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌［4］。免疫組化示超過70%的樹鼩自發(fā)性乳腺腫瘤呈激素受體（hormone receptor，HR）陽性，HER?2基因不擴(kuò)增；其余為雌激素受體（estrogen receptor，ERα）陰性、孕激素受體（progesterone receptor，PR）陰性、HER?2基因無擴(kuò)增的三陰性乳腺癌。

1.2.2 化學(xué)致癌物誘導(dǎo)

7，12?二甲基苯并蒽（7，12?dimethylbenz anthra?cene，DMBA）是一種激素依賴性的致癌物，通過乳腺脂肪墊注射、灌胃等方法，誘導(dǎo)樹鼩產(chǎn)生乳腺腫瘤而建立樹鼩的腫瘤模型，組織病理學(xué)檢查確認(rèn)為乳腺原位導(dǎo)管癌。通過對(duì)照試驗(yàn)，DMBA 處理可能縮短了樹鼩的壽命和增加了患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)［5］。

相較于單獨(dú)使用致癌劑DMBA 對(duì)樹鼩進(jìn)行處理，聯(lián)合使用孕激素緩釋片醋酸甲羥孕酮（medroxy?progesterone acetate，MPA）皮下埋植的實(shí)驗(yàn)組腫瘤發(fā)生率顯著提高。HE 染色結(jié)果顯示腫瘤多為導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤和浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，其中以導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤為主［6］。

1.2.3 生物學(xué)因素誘導(dǎo)

多瘤病毒中間T 抗原（polyoma virus middle T antigen，PyMT）的慢病毒系統(tǒng)感染樹鼩乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞，其過表達(dá)的癌基因可高效誘導(dǎo)乳腺癌。將制備好的慢病毒載體注射到樹鼩乳腺導(dǎo)管內(nèi)，8周后樹鼩全部產(chǎn)生腫瘤。實(shí)驗(yàn)證明PyMT誘導(dǎo)的乳腺癌模型具有成瘤快、潛伏期短、效率高等特點(diǎn)［7］，順鉑、表阿霉素等化療藥物均能有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

1.3 模型特點(diǎn)

樹鼩與人類有相近的親緣關(guān)系，其乳腺形態(tài)和結(jié)構(gòu)也與人類相似。同時(shí)其體型小、繁殖快、飼養(yǎng)成本較低，是一種較為理想的動(dòng)物模型。但樹鼩誘導(dǎo)出的腫瘤形態(tài)不規(guī)則，難以準(zhǔn)確測(cè)量，且絕大部分為乳頭狀癌，與人類主要的浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌存在一定差異，也成為阻礙模型進(jìn)一步發(fā)展的主要原因［8-9］。

2 犬

2.1 建模背景

人乳腺腫瘤（human breast cancer，HBC）與犬乳腺腫瘤（canine mammary tumor，CMT）在發(fā)病年齡、病因病程、激素水平和疾病預(yù)后等方面具有相似性。其中，人和犬類的乳腺導(dǎo)管原位癌（ductal carcinoma in situ，DCIS）在組織病理、分子特征如激素受體、表皮生長(zhǎng)因子、p53抑癌基因突變等方面均尤為相似［10］，因此犬模型可能是乳腺癌研究的良好選擇。

2.2 建模方式

犬類常自發(fā)良、惡性乳腺腫瘤，發(fā)病率占所有犬類腫瘤的13.4%。雌性犬類乳腺癌發(fā)病率為41.7%，是女性乳腺癌發(fā)病率的3倍［11］。研究結(jié)果表明，孕激素處理的犬患乳腺腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加，而早期卵巢子宮切除術(shù)可以有效降低犬乳腺癌發(fā)病率。同時(shí)，肥胖和高脂肪飲食也是犬類乳腺癌的影響因素。

病理學(xué)研究表明，近半數(shù)的犬乳腺腫瘤為惡性，絕大多數(shù)起源于上皮細(xì)胞。犬乳腺癌多數(shù)表達(dá)ER，ER表達(dá)與組織學(xué)分化呈負(fù)相關(guān)。約50%的犬乳腺癌轉(zhuǎn)移至局部淋巴結(jié)和肺，骨轉(zhuǎn)移并不常見［12］。

2.3 模型特點(diǎn)

相比于嚙齒類動(dòng)物，犬的基因組序列與人類基因組序列有高度同源性［13］。因此，犬和人類自發(fā)性乳腺腫瘤在組織病理學(xué)類型、腫瘤遺傳學(xué)特點(diǎn)、分子靶點(diǎn)種類、生物學(xué)行為和對(duì)常規(guī)治療的反應(yīng)等方面具有許多共同特征［14-15］。這些共同特性表明犬可能是研究乳腺癌的極佳模型。犬模型在探索乳腺癌發(fā)病機(jī)制、研究藥物療效和安全性檢測(cè)等方面都具有廣闊的前景［16］。但是犬類的自發(fā)乳腺腫瘤模型誘導(dǎo)困難，目前也尚未有關(guān)于犬的人源腫瘤異種移植模型的研究報(bào)道。

3 豬

3.1 建模背景

乳腺癌相關(guān)基因1（BRCA1）直接與遺傳性乳腺癌相關(guān)，其突變失活會(huì)增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。而BRCA1 基因在豬體內(nèi)編碼1 863 個(gè)氨基酸的核蛋白，與人類完全一致。豬乳腺癌模型的建立對(duì)BRCA1 基因研究具有重要意義。Donninger 等［17］開發(fā)了豬乳腺癌模型，確定了BRCA1基因在豬細(xì)胞中的滅活促進(jìn)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，驗(yàn)證了以豬為模型研究BRCA1基因缺陷乳腺癌的概念，并建立了首個(gè)豬乳腺癌細(xì)胞系。

3.2 建模方式

3.2.1 生物學(xué)因素誘導(dǎo)

利用SV40 LT慢病毒載體破壞細(xì)胞p53和Rb抑癌因子的功能，構(gòu)建永生化的豬乳腺細(xì)胞系。Don?ninger等［17］使用針對(duì)BRCA1的miRNA片段，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到永生化的豬乳腺細(xì)胞，產(chǎn)生配對(duì)的BRCA1+/-細(xì)胞系。BRCA1 基因敲除的細(xì)胞幾乎無法表達(dá)BRCA1 核蛋白；BRCA1 的下調(diào)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增強(qiáng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表現(xiàn)出了腫瘤干細(xì)胞的特征［18］。

3.2.2 基因修飾

利用重組腺相關(guān)病毒（rAAV）介導(dǎo)的基因靶向技術(shù)，以第11 外顯子為靶點(diǎn)，將育卡坦小型豬取下的原代豬成纖維細(xì)胞進(jìn)行基因敲除；篩選后利用人工克隆的體細(xì)胞核移植技術(shù)，將克隆好的胚胎移植到母豬子宮，成功繁育出克隆BRCA1 基因敲除（BRCA1+/Δ11）的育卡坦小型豬［19］。

3.3 模型特點(diǎn)

與嚙齒類動(dòng)物模型相比，豬的生物系統(tǒng)和癌癥遺傳學(xué)與人類更為相似，相比于小鼠只需要2 個(gè)致癌損傷就可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化，豬細(xì)胞需要5 個(gè)或更多致癌突變才能發(fā)生變化［20］。BRCA1 缺陷乳腺癌的豬模型有應(yīng)用于乳腺癌預(yù)防和治療相關(guān)研究的潛力。但這一模型目前存在的主要問題是BRCA1 單倍基因缺失的小豬沒有存活超過18 d，這一問題也限制了該模型在乳腺癌研究中的廣泛應(yīng)用。

4 兔

4.1 建模背景

為更好地研究轉(zhuǎn)移性乳腺癌（metastatic breast cancer，MBC），評(píng)估新治療策略對(duì)原發(fā)腫瘤及其轉(zhuǎn)移的影響，建立了兔轉(zhuǎn)移性乳腺癌模型，以期研究兔轉(zhuǎn)移性乳腺癌模型的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移情況，改善敏感的腫瘤轉(zhuǎn)移篩查方式［21］。

4.2 建模方法

VX2 癌是一種鱗狀上皮性睪丸癌，細(xì)胞株可用于誘導(dǎo)兔乳頭狀瘤的轉(zhuǎn)化。手術(shù)植入腫瘤組織塊或注射含有VX2 癌細(xì)胞的組織塊懸浮液至兔的乳墊下，超聲影像學(xué)表明誘導(dǎo)的乳腺腫瘤在2～4 周迅速擴(kuò)大，隨后生長(zhǎng)速度相對(duì)減慢［22］。

4.3 模型特點(diǎn)

兔模型發(fā)生迅速、病程短，通過乳腺脂肪墊注射VX2腫瘤塊懸液，使腫瘤在短時(shí)間內(nèi)快速生長(zhǎng)并廣泛轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)了相對(duì)較高的腫瘤誘導(dǎo)率。尤其可觀察到兔MBC 模型中腋淋巴結(jié)和肺的區(qū)域性淋巴組織轉(zhuǎn)移，與人類MBC 有相似之處，具有腫瘤生長(zhǎng)快、轉(zhuǎn)移范圍廣等特點(diǎn)［23］。由于VX2的組織病理學(xué)類型為鱗癌而非乳腺癌常見的腺癌，因此VX2模型適用于轉(zhuǎn)移性淋巴組織治療的研究，不適用于腫瘤發(fā)生或生物學(xué)特性的研究。

5 斑馬魚

5.1 建模背景

斑馬魚（zebrafish）是一種小型的熱帶淡水魚，其透明的胚胎易于觀察到腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，為一種理想的異種移植腫瘤模型。斑馬魚與哺乳動(dòng)物在生理和遺傳方面具有高度的相似性，適用于臨床異種移植模型的研究［24］。

5.2 建模方式

MDA?MB?231是一種高度侵襲性的三陰性乳腺癌細(xì)胞系，廣泛用于乳腺癌轉(zhuǎn)移的體內(nèi)研究，可以在斑馬魚的不同部位播散和定植。將mCherry抗體標(biāo)記的人乳腺癌MDA?MB?231 細(xì)胞注射到斑馬魚胚胎卵黃囊中，在熒光顯微鏡下可以觀察到癌細(xì)胞的侵入、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，以及腫瘤周圍和腫瘤內(nèi)的血管生成［25］。腫瘤的生長(zhǎng)浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移依賴于血管的形成，新生微血管密度是反映腫瘤血管形成程度的指標(biāo)［26］。

5.3 模型特點(diǎn)

與傳統(tǒng)的嚙齒類動(dòng)物模型相比，斑馬魚模型遺傳操作簡(jiǎn)單，胚胎發(fā)育快速，內(nèi)部結(jié)構(gòu)可視，繁衍后代豐富。其模型制作方法簡(jiǎn)單、周期短，可以減少藥物反應(yīng)時(shí)間，更好地了解藥物敏感性，在藥物活性評(píng)價(jià)方面發(fā)揮獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。胚胎透明可以在顯微鏡下實(shí)時(shí)活體觀察腫瘤血管生成和遷移特征。繁殖能力強(qiáng)便于進(jìn)行統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)和遺傳研究。但斑馬魚模型也存在著無乳腺組織、無組織器官發(fā)病等問題，模型的適用范圍存在局限性［27］。

6 其 他

除上述列舉的乳腺癌動(dòng)物模型外，還有一些特殊動(dòng)物模型具有研究?jī)r(jià)值。貓乳腺癌與人類乳腺癌在發(fā)病年齡、發(fā)病情況、組織病理學(xué)特征和轉(zhuǎn)移模式等方面具有相似性。80%以上貓乳腺腫瘤為惡性，早期即迅速發(fā)展和轉(zhuǎn)移，故貓乳腺癌為良好的侵襲性乳腺癌模型。腫瘤細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)后，將穩(wěn)定的細(xì)胞株作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌種植到小鼠體內(nèi)，以便進(jìn)一步研究［28-29］。

非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型，如獼猴，在許多病理生理特征上與女性相似。雌性獼猴的月經(jīng)周期、生殖器官對(duì)激素反應(yīng)與人類相似，乳腺的分泌和神經(jīng)支配也有解剖學(xué)上的相似性。猴模型證實(shí)了雌激素治療可能會(huì)影響乳腺上皮細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)，而雌激素+黃體酮治療會(huì)大幅增加乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［30］。

7 總結(jié)

理想的乳腺癌動(dòng)物模型應(yīng)當(dāng)有助于研究乳腺癌的發(fā)生機(jī)制、診斷方式和治療方案，有助于提高治療效果和預(yù)后。嚙齒類動(dòng)物作為乳腺癌研究的主要?jiǎng)游锬Ｐ?，仍存在著和人類相似程度低等一系列問題。常見的特殊動(dòng)物乳腺癌模型采用不同的建模方法，具有各自的模型特點(diǎn)（表1），可以從不同方面、在不同程度上彌補(bǔ)嚙齒類動(dòng)物模型的不足。針對(duì)不同類型乳腺癌選擇特殊動(dòng)物模型進(jìn)行研究，可以豐富乳腺癌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類，對(duì)乳腺癌研究具有重要意義。其中，樹鼩和犬是良好的乳腺癌研究模型，具有基因序列高度同源等特點(diǎn)，在研究乳腺癌發(fā)病機(jī)制和藥物療效等方面具有廣闊前景。豬模型因BRCA1 基因與人相近適用于基因工程。兔模型因轉(zhuǎn)移方式與人類相似，適合轉(zhuǎn)移性乳腺癌的研究。斑馬魚模型易于觀察，可以通過異種移植模型研究三陰性乳腺癌。貓自發(fā)性乳腺癌多為惡性，適合于研究侵襲性乳腺癌。

乳腺癌特殊動(dòng)物模型在遺傳進(jìn)化、腫瘤特性、生物特性等方面更有優(yōu)勢(shì)，可以在一定程度上彌補(bǔ)嚙齒類動(dòng)物模型的缺陷。但目前這些模型也存在著如建模形式單一、研究成本過高、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏少等諸多制約因素，仍需更多的研究探索其在腫瘤研究中的價(jià)值。

表1 特殊乳腺癌動(dòng)物模型特點(diǎn)Table 1 Characteristics of special breast cancer animal models