張益慶

（浙江省嘉興市南湖區(qū)余新中心醫(yī)院藥劑科 嘉興314009）

腎性貧血（RA）是由于各種因素造成腎臟促紅細(xì)胞生成素（EPO）產(chǎn)生不足或尿毒癥毒素積累干擾紅細(xì)胞生成和代謝導(dǎo)致的貧血，是慢性腎衰竭患者常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。 目前西醫(yī)治療RA 主要是應(yīng)用促紅細(xì)胞生成素及鐵劑，但因成本較高，給患者帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)壓力，臨床應(yīng)用受限。 黑地黃丸主要出自《素問(wèn)病機(jī)氣宜保命集》，該集或?yàn)閺堅(jiān)厮鶆?chuàng)，黑地黃丸主要由熟地、蒼術(shù)、干姜、大棗四味藥組成[1]?！侗Ｃ费缘溃骸爸侮?yáng)盛陰虛，脾腎不足……面多青黃，而無(wú)常色，此藥益腎養(yǎng)血。 ”已有研究表明，黑地黃丸可以有效治療慢性腎衰竭所致RA，可提高RA患者的血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，對(duì)腎功能有一定保護(hù)作用[2]，然而目前對(duì)黑地黃丸治療RA 的機(jī)制研究相對(duì)較少。 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在網(wǎng)絡(luò)生物和多向藥理學(xué)的基礎(chǔ)上，針對(duì)中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑等特點(diǎn)，提出研究中藥復(fù)方或單味藥臨床作用機(jī)制的新方法、新策略，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究黑地黃丸治療慢腎衰導(dǎo)致的RA 的作用機(jī)制。 現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 黑地黃丸藥物成分收集與篩選 基于藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)：吸收、分布、代謝、排泄（ADME），分別以“熟地”“蒼術(shù)”“干姜”“大棗”為關(guān)鍵詞在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP, http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php） 按口服生物利用度（OB）≥30%、類(lèi)藥性（DL）≥0.18 條件篩選中藥成分。

1.2 黑地黃丸有效成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 從TCMSP 中查詢(xún)黑地黃丸有效成分對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白， 并導(dǎo)入U(xiǎn)nitprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.Unitprot.org/）查詢(xún)靶標(biāo)蛋白的基因名稱(chēng)，同時(shí)進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3 RA （Renal anemia） 疾病的靶點(diǎn) 預(yù) 測(cè) 在OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.omim.org/）、PharmGkb 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.pharmgkb.org/）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/） 以關(guān)鍵詞“Renal Anemia”進(jìn)行檢索，對(duì)RA 相關(guān)的靶點(diǎn)基因進(jìn)行收集， 并導(dǎo)入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因名標(biāo)準(zhǔn)化處理后歸納整理。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）的構(gòu)建與分析 先將黑地黃丸有效成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行去重， 再與RA 疾病靶點(diǎn)組建“成分-疾病”靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，取兩者交集，組成“成分-疾病”映射文件，即尋找成分與疾病共有的靶點(diǎn)。 運(yùn)用交集出的共有靶點(diǎn)與化合物成分，通過(guò)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)建立“黑地黃丸-RA 靶點(diǎn)”的PPI網(wǎng)絡(luò)。 運(yùn)用Cytoscape 軟件對(duì)“有效成分-RA”靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行節(jié)點(diǎn)度（dregree=8.4）值篩選，得到“有效成分-RA”靶點(diǎn)核心網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO 生物功能富集分析 將上述作用靶點(diǎn)輸入到DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行生物功能富集分析。 再將作用靶點(diǎn)復(fù)制到基因搜索列表，對(duì)應(yīng)基因標(biāo)示符選擇“OFFCIAL-GENE-SYMBOL”物種及背景設(shè)定為人，然后進(jìn)行分析獲得結(jié)果。

1.6 KEGG 代謝通路富集分析 利用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)相應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行代謝通路分析。 物種及背景設(shè)定為人，選擇KEGG-PATHWAY，并以“P＜0.05”進(jìn)行篩選，最終得到分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 黑地黃丸的有效成分收集和篩選 通過(guò)運(yùn)用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，以“熟地”“蒼術(shù)”“干姜”“大棗”為關(guān)鍵詞進(jìn)行成分搜索， 共得到黑地黃丸有效成分406個(gè)，其中熟地76 個(gè)，蒼術(shù)49 個(gè)，干姜148 個(gè)，大棗133 個(gè)；基于藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（ADME），按照口服生物利用度（OB）≥30%、類(lèi)藥性（DL）≥0.18 條件，進(jìn)行有效性篩選，同時(shí)查閱文獻(xiàn)進(jìn)行補(bǔ)充，共得到黑地黃丸有效成分45 個(gè)，其中熟地2 個(gè)，蒼術(shù)9 個(gè)，干姜5 個(gè)，大棗29 個(gè)，由結(jié)果得知黑地黃丸主要包含甾醇類(lèi)、生物堿、苷類(lèi)、萜類(lèi)和黃酮類(lèi)等成分具有良好的OB 和DL 值，如豆甾醇、槲皮素、葡萄糖苷-qt、繡線(xiàn)菊堿A 等。 見(jiàn)表1。

表1 黑地黃丸有效成分

2.2 黑地黃丸有效成分靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)及與成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 運(yùn)用TCMSP 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)， 將黑地黃丸45 個(gè)有效成分在數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)進(jìn)行檢索，獲取有效成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，共725 個(gè)。 并將靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)nitprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.Unitprot.org/）進(jìn)行基因名標(biāo)準(zhǔn)化處理，再通過(guò)Cytoscape3.7.2 軟件構(gòu)建“黑地黃丸-有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，該圖由183 個(gè)節(jié)點(diǎn)組成，紅色“V”代表中藥名，綠色圓形代表黑地黃丸有效成分，粉紅色正方形代表有效成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的邊表示藥物成分與成分靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，平均自由度8.4，最大自由度104，最小自由度1。 見(jiàn)圖1。

圖1 黑地黃丸有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 疾病靶點(diǎn)信息的收集 在OMIM、PharmGkb、GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Renal Anemia”“RA”為關(guān)鍵詞進(jìn)行數(shù)據(jù)搜索整理， 其中GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)以“Relevance score＞30”進(jìn)行篩選，共尋找到靶點(diǎn)基因400 個(gè)，其中OMIM（200 個(gè)）、PharmGkb（13 個(gè)）、GeneCards（187 個(gè)）；將以上數(shù)據(jù)庫(kù)合并整理后并導(dǎo)入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化處理， 再以Uniprot ID 為標(biāo)準(zhǔn)，用EXCEL 表格的“刪除重復(fù)值”功能，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行去重，最終篩選得到疾病靶點(diǎn)315個(gè)；并運(yùn)用Cytoscape3.7.2 軟件構(gòu)建“疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。 見(jiàn)圖2。

圖2 RA-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 利用EXCEL表格篩選功能， 將315 個(gè)RA 疾病靶點(diǎn)和725 個(gè)藥物有效成分靶點(diǎn)進(jìn)行合并，取兩者交集，得到藥物成分和疾病的共有靶點(diǎn)17 個(gè)，見(jiàn)表2。將這17 個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)建立“黑地黃丸-RA 靶點(diǎn)”的PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3，共得到17 個(gè)節(jié)點(diǎn)，69 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為8.12；將該結(jié)果以STV 格式導(dǎo)出，再通過(guò)Cytoscape3.7.2 軟件對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，以“＞平均Degree 值8.11”為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到12個(gè)核心節(jié)點(diǎn)，它們分別是：白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、干擾素γ（IFNG）、前表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、血紅素加氧酶1（HMOX1）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（TP53）、白介素-2（IL-2）、凝血酶原（F2）、 糖皮質(zhì)激素受體（NR3C1）、 一氧化氮合酶（NOS3），具體見(jiàn)圖4。說(shuō)明該12 個(gè)靶點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)重要地位， 提示這些靶點(diǎn)可能是黑地黃丸發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵所在。

表2 藥物-疾病共有靶點(diǎn)

圖3 PPI 蛋白互作圖

圖4 核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO生物功能富集分析 運(yùn)用DAVID6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)17 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行生物功能富集分析，確定了129 個(gè)GO 條目。 其中生物學(xué)過(guò)程（BP）條目最多，有107 個(gè)：主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、基因表達(dá)的正調(diào)控、一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控等107 個(gè)生物過(guò)程；分子功能（MF）相關(guān)條目有14 個(gè)：主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、生長(zhǎng)因子活性、細(xì)胞因子活性、酶結(jié)合等分子功能；細(xì)胞組成（CC）相關(guān)條目有8 個(gè)，主要涉及細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜等；以靶點(diǎn)富集數(shù)目多少為原則，篩選出前20 條GO 生物功能富集結(jié)果。結(jié)果提示：黑地黃丸治療RA 可能與蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞外空間、細(xì)胞質(zhì)、RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等生物功能有關(guān)。 見(jiàn)表3。

表3 前20 條GO 生物功能分析

2.6 KEGG 代謝通路富集分析 運(yùn)用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)17 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行代謝通路富集分析，共獲得39 條通路。以P＜0.05 為條件篩選，按富集基因數(shù)降序原則排序， 得到前20 條KEGG 代謝通路， 其中富集靶點(diǎn)數(shù)目前三位的通路主要包括：HIF-1 信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌癥的途徑（Pathways in cancer）。 以上數(shù)據(jù)顯示，黑地黃丸的有效成分可能通過(guò)作用于這些代謝通路發(fā)揮其治療RA 的潛在作用。 見(jiàn)表4。

表4 前20 條KEGG 代謝通路富集分析

3 討論

RA 在中醫(yī)學(xué)中并無(wú)具體病名， 但近代中醫(yī)醫(yī)家學(xué)者將其歸屬于“腎勞、虛勞、血枯”等范疇。 病因多為先天不足、后天失養(yǎng)、外感邪氣、內(nèi)傷勞倦、情志久病、房勞傷腎等有關(guān)。 腎病后期五臟俱虛，濁邪壅滯脾胃，使脾胃受納水谷精微失調(diào)，氣血化生無(wú)源，故氣血虧虛；精可化血，血可養(yǎng)精，腎病日久，腎精虧虛，則血源不足，使貧血加重；故脾腎虧虛為該病的基本病機(jī)。

黑地黃丸在治療慢性腎臟病及其并發(fā)癥、 改善腎功能方面具有良好效果。 中藥具有多成分、 多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥力學(xué)方法探討黑地黃丸治療RA 的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子作用機(jī)制。 研究結(jié)果顯示， 黑地黃丸與RA 共有17 個(gè)公共靶點(diǎn)，經(jīng)過(guò)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析和拓?fù)浞治龊蠊驳玫?2 個(gè)核心靶點(diǎn) ：IL-6、TNF、VEGFA、EGFR、IFNG、EGF、HMOX1、TP53、IL-2、F2、NR3C1、NOS3，提示該藥治療RA 具有多組分、 多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為RA 多屬慢性病貧血（ACD），可能與鐵吸收異常、巨噬細(xì)胞釋放鐵障礙、EPO 表達(dá)異常等有關(guān)。 有研究顯示IL-6 通過(guò)炎性機(jī)制反應(yīng)，可引起鐵代謝紊亂導(dǎo)致貧血，從而參與造血調(diào)控[3]；TNF-琢是造血負(fù)調(diào)控因子，影響鐵代謝，可以抑制紅系造血功能[4]；林雪峰等[5]分析發(fā)現(xiàn)免疫及炎癥反應(yīng)所介導(dǎo)的TNF-琢和IL-6 可能通過(guò)影響鐵代謝和EPO 生成抑制、EPO 的反應(yīng)鈍化等途徑參與ACD 的發(fā)生發(fā)展；王歡等[6]研究發(fā)現(xiàn)貧血情況下VEGFA 生成增多， 會(huì)促進(jìn)組織血管生成，從而代償性增加氧氣利用率；HMOX1 可分解血紅素產(chǎn)生鐵，是鐵在體內(nèi)重復(fù)利用的重要來(lái)源，在鐵代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用；因此可以推測(cè)其調(diào)節(jié)障礙會(huì)導(dǎo)致鐵的缺乏，從而引起貧血；EGF 可能與骨髓血管生成和造血有關(guān)[7]；眾多研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞可分泌造血負(fù)調(diào)控因子IFN-γ，具有較強(qiáng)的造血抑制活性[8]；NOS 作為合成一氧化氮（NO）的關(guān)鍵酶，也是造血負(fù)調(diào)控因子，INF-γ 還能強(qiáng)烈誘導(dǎo)一氧化氮合酶表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)NO 合成、釋放來(lái)抑制造血功能；還有研究發(fā)現(xiàn)貧血與免疫機(jī)制密切相關(guān)[9]，IL-2 不僅可反映T 細(xì)胞的功能，并且IL-2 異常與再生障礙性貧血（AA）的造血抑制有關(guān)。 由KEGG 代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)蛋白富集在HIF-1 信號(hào)通路上數(shù)目最多， 預(yù)測(cè)黑地黃丸治療RA 可能主要通過(guò)該通路發(fā)揮作用；HIF-1（低氧誘導(dǎo)因子）通過(guò)模擬機(jī)體缺氧，刺激機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性EPO，可提高紅細(xì)胞對(duì)鐵的利用性， 從而實(shí)現(xiàn)治療RA 的目的[10]；PI3K-Akt 信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和存活等重要生物過(guò)程，過(guò)度激活該信號(hào)通路會(huì)造成造血干細(xì)胞的耗竭[11]；癌癥與炎性反應(yīng)密切相關(guān)， 富集在癌癥通路上的EGFR，IL-6，VEGFA，TP53，EGF 等可能通過(guò)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與分化、氧化應(yīng)激等生物過(guò)程參與對(duì)RA 的治療； 于生友等[12]研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt 信號(hào)通路在腎小球足細(xì)胞凋亡中發(fā)揮保護(hù)腎小球足細(xì)胞作用； 推測(cè)黑地黃丸可以通過(guò)利用以上多種通路的調(diào)控保護(hù)腎功能， 改善尿毒癥誘導(dǎo)的紅細(xì)胞生成抑制、鐵利用障礙[13]等。

綜上所述，黑地黃丸治療RA 具有多靶點(diǎn)、多通路、多成分特點(diǎn)，同一靶點(diǎn)可通過(guò)多個(gè)信號(hào)通路和生物過(guò)程發(fā)揮作用，其機(jī)制較為復(fù)雜。本研究明確了黑地黃丸治療RA 的物質(zhì)成分基礎(chǔ)及潛在作用靶點(diǎn)，并通過(guò)富集分析闡釋了黑地黃丸作用的信號(hào)通路和分子機(jī)制， 為RA 的臨床治療和實(shí)驗(yàn)研究提供了新方法、新思路。