孫燕勇 付紹印, 何小龍 王 標(biāo) 劉永斌* 張文廣*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 畜牧研究所，呼和浩特 010031)

大多數(shù)真核生物基因由外顯子和內(nèi)含子組成，其轉(zhuǎn)錄的mRNA前體經(jīng)過RNA剪接，其中內(nèi)含子被切除，外顯子連接在一起形成成熟的mRNA序列。通過選擇外顯子和剪接位點(diǎn)，一個(gè)mRNA前體通過不同的剪接方式產(chǎn)生不同mRNA剪接異構(gòu)體的過程稱為可變剪接[1]?？勺兗艚邮歉叩日婧松锘蛘{(diào)控的核心模式，可以參與動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育[2]、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]和生物/非生物脅迫下的積極調(diào)控反應(yīng)等[4-5]，也可以導(dǎo)致肌無力[6]、肌肉增生[7]、細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)缺陷、鈣調(diào)控、細(xì)胞連接和內(nèi)吞作用紊亂等負(fù)面影響[8]。動(dòng)物需要不同類型的肌肉才能生存，如循環(huán)、運(yùn)動(dòng)、繁殖和消化。在肌肉發(fā)育過程中如何轉(zhuǎn)錄調(diào)控產(chǎn)生不同類型的肌肉是肌肉領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近幾年的研究表明，可變剪接和RNA調(diào)控對(duì)肌肉發(fā)育同等重要，RNA結(jié)合蛋白功能的改變會(huì)導(dǎo)致肌肉發(fā)育問題[9-10]。盡管有數(shù)百個(gè)基因被預(yù)測(cè)會(huì)結(jié)合RNA在肌肉中表達(dá)，但其功能描述較少[11]。隨著測(cè)序方法和分析軟件的開發(fā)與更新，研究者不斷突破讀段、通量和準(zhǔn)確定量等問題瓶頸，并通過RNA-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)保守的可變剪接對(duì)肌肉組織功能具有關(guān)鍵影響[12-13]。本文分別就肌肉可變剪接的產(chǎn)生及常見模式，引起蛋白多樣性的分子機(jī)制，可變剪接在人、小鼠和常見家畜肌肉上的研究進(jìn)展及高通量測(cè)序數(shù)據(jù)量化可變剪接方面進(jìn)行了概述，為進(jìn)一步研究動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過程中可變剪接的分子調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 肌肉可變剪切的產(chǎn)生和常見模式

肌肉是動(dòng)物個(gè)體最具活力的組織之一，它有一種天生的能力來調(diào)節(jié)對(duì)環(huán)境和生理變化的適應(yīng)，包括運(yùn)動(dòng)、飲食和疾病等，其適應(yīng)性是通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄過程實(shí)現(xiàn)的，而且直接與RNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)的機(jī)制也可能調(diào)節(jié)肌肉生理，所以轉(zhuǎn)錄后機(jī)制在肌肉生物學(xué)領(lǐng)域具有重要的研究意義[14-15]。轉(zhuǎn)錄后過程包括4個(gè)主要步驟：加帽、可變剪接、切割和mRNA前體的聚腺苷酸化，最終產(chǎn)生成熟的mRNA?？勺兗艚邮寝D(zhuǎn)錄后的調(diào)控機(jī)制之一，通過這種機(jī)制，單個(gè)基因可以產(chǎn)生1個(gè)以上的mRNA轉(zhuǎn)錄本，從而表達(dá)多種具有不同特征的蛋白質(zhì)亞型[18]。肌肉是表現(xiàn)出最高水平的組織特異性和保守可變剪接的組織之一，在哺乳動(dòng)物和雞中該特征尤為顯著[1]。雖然人、牛、綿羊、豬與雞的基因組分別只有大約20 000、19 981、20 908、21 594和 15 495 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因[16-17]，但每個(gè)基因產(chǎn)生的獨(dú)特的mRNA亞型可能是基因個(gè)數(shù)的10倍以上[18]。

可變剪接的基本模式包括外顯子跳躍、可變5’和3’剪接位點(diǎn)、互斥外顯子、內(nèi)含子保留以及可變的起始外顯子、與可變的終止外顯子[19](圖1(a))。mRNA前體(Heterogeneous nuclear RNA，pre-mRNA)中最重要的剪接信號(hào)是5’剪接位點(diǎn)(5’SS)、3’剪接位點(diǎn)(3’SS)、分支位點(diǎn)(A)和多嘧啶束(Y(n))。5’和3’剪接位點(diǎn)分別以高度保守的GU和AG二核苷酸作為內(nèi)含子的第1個(gè)和最后2個(gè)核苷酸。U1小核糖核蛋白(Small nucleo ribose nucleoprotein，snRNP)復(fù)合體識(shí)別5’剪接位點(diǎn)，U2 snRNP復(fù)合體識(shí)別分支位點(diǎn)。U2AF蛋白識(shí)別3’剪接位點(diǎn)和聚嘧啶束。外顯子剪接增強(qiáng)子(ESEs)、外顯子剪接沉默子(ESSs)、內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子(ISEs)和內(nèi)含子剪接沉默子(ISSs)是pre-mRNA順勢(shì)調(diào)控基序，它們募集各種RNA結(jié)合蛋白(如SR和核內(nèi)不均一核糖蛋白，Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP)來調(diào)控可變剪接[19](圖1(c))。

除了在剪接過程中涉及到外顯子或剪接位點(diǎn)的二進(jìn)制選擇的基本模式外，轉(zhuǎn)錄組中還存在許多復(fù)雜的可變剪接模式[19](圖1(b))。在極端情況下，多個(gè)可變剪接區(qū)域的組合選擇可以從一個(gè)基因產(chǎn)生成千上萬的mRNA亞型[19]。由此產(chǎn)生的mRNA亞型可在細(xì)胞內(nèi)具有不同的調(diào)控性質(zhì)，如定位、穩(wěn)定性和翻譯效率，并可翻譯成結(jié)構(gòu)和功能不同的穩(wěn)定蛋白亞型。因此，可變剪接為擴(kuò)大真核生物的調(diào)控和功能庫(kù)提供了一個(gè)強(qiáng)大機(jī)制。

深藍(lán)色的方框表示組成剪接的外顯子。紅色、淡藍(lán)色和綠色的方框代表可變剪接的外顯子。

2 可變剪接增加蛋白多樣性

mRNA前體的可變剪接是一種基因調(diào)控的共轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機(jī)制，通過可變區(qū)域的包含或排除，一個(gè)基因可以編碼多種蛋白亞型，這通常被認(rèn)為是增加蛋白質(zhì)多樣性的主要機(jī)制[21]?？勺兗艚赢a(chǎn)生蛋白質(zhì)組多樣性，包括具有組織特異性或發(fā)育階段特異性功能的亞型[22]，這一過程受到高度調(diào)控，涉及反式剪接因子和順式調(diào)控基序，因此易受遺傳和體細(xì)胞突變的影響[23]?？勺兗艚涌梢愿淖兙幋a蛋白的性質(zhì)，包括其包含的結(jié)構(gòu)域、結(jié)合性質(zhì)、穩(wěn)定性、細(xì)胞內(nèi)定位和酶活性[24-25]。一般來說，可變剪接水平較高的基因往往具有較高數(shù)量的蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein interactions，PPI)[26]，那些發(fā)生可變剪接的組織特異性基因也往往在PPI網(wǎng)絡(luò)中處于更中心的位置[27]?？勺兗艚訁^(qū)域優(yōu)先編碼在蛋白質(zhì)表面發(fā)現(xiàn)的殘基[28]，這些殘基通常包含蛋白質(zhì)及其結(jié)合伴侶的相互作用位點(diǎn)[29]。事實(shí)上，通過對(duì)數(shù)百對(duì)蛋白質(zhì)亞型配對(duì)的蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)果進(jìn)行比較，大多數(shù)的相互作用不足一半。主異構(gòu)體和備選異構(gòu)體屬于不同的功能模塊，表明同一基因產(chǎn)生的一組剪接異構(gòu)體在功能上存在差異[32]?？傊?，這些結(jié)果與可變剪接在蛋白質(zhì)組多樣化和蛋白質(zhì)相互作用調(diào)節(jié)中的作用是一致的。

盡管發(fā)生可變剪接的蛋白產(chǎn)物具有不同功能作用的例子有很多，但是，并非所有的可變剪接都必然導(dǎo)致功能蛋白的產(chǎn)生，也會(huì)存在以下幾種可能：首先，轉(zhuǎn)錄可能是非編碼的，不能翻譯成蛋白質(zhì)；第二，RNA穩(wěn)定性會(huì)受到影響；第三，mRNA定位改變可能會(huì)阻礙轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白質(zhì)的正確功能[30-31]。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在人類細(xì)胞中，有3/4的具有外顯子跳躍和轉(zhuǎn)錄本亞型的核糖體參與并可能被翻譯[32]。但是來自8個(gè)人類蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)分析(包括100多個(gè)組織，細(xì)胞株等)結(jié)果檢測(cè)到的多肽中只有0.4% 來自于可變剪接的轉(zhuǎn)錄本[33]。這說明在某些情況下，可變剪接的主要功能可能不需要在蛋白質(zhì)水平上，例如，一些帶有“終止子”的轉(zhuǎn)錄本永遠(yuǎn)不會(huì)產(chǎn)生蛋白質(zhì)。相反，可能通過將一部分pre-mRNA轉(zhuǎn)入無意義介導(dǎo)的衰變(NMD)途徑來下調(diào)表達(dá)，這種機(jī)制被稱為調(diào)節(jié)非再生性剪接和翻譯。

3 肌肉發(fā)育可變剪切研究

3.1 人與小鼠肌肉發(fā)育可變剪接調(diào)控

人和小鼠肌肉發(fā)育和功能廣泛受到可變剪接的調(diào)控[1]。大規(guī)模測(cè)序試驗(yàn)獲得已知的和新的可變剪接來解釋老鼠未分化的胚胎干細(xì)胞和擬胚體轉(zhuǎn)錄的RNA序列復(fù)雜性[34]。研究表明，在小鼠大腦、肝臟和骨骼肌組織大約3 500個(gè)不同的基因表達(dá)一個(gè)或多個(gè)可變剪接[35]。在人體主要組織中約有100 000個(gè)這類可變剪接，在20%的多外顯子基因中發(fā)現(xiàn)了新的剪接連接，其中許多是肌肉特異性的[36]。在心臟發(fā)育過程中，CUG-BP類Elav家族成員1(CELF1)、肌樣蛋白1(MBNL1)、RNA 結(jié)合蛋白-fox-1 homolog 1(RBFOX1)、RBFOX2、RNA結(jié)合蛋白24(RBM24)等多種調(diào)控可變剪接的RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding proteins，RBPs)表達(dá)水平發(fā)生顯著變化[37]。這些RBPs是肌肉RNA轉(zhuǎn)錄過程的關(guān)鍵調(diào)控因子，對(duì)mRNA表達(dá)、定位或功能的錯(cuò)誤調(diào)控都會(huì)導(dǎo)致mRNA穩(wěn)定性、可變剪接和相關(guān)的聚腺苷酸化缺陷，并且RBPs的剪接靶點(diǎn)已通過動(dòng)物模型結(jié)合全基因組方法得到鑒定[38-39]。MBNL和CELF家族是調(diào)節(jié)心臟和骨骼肌發(fā)育過程中發(fā)生可變剪接的代表[40-41]，它們可以調(diào)節(jié)可變剪接的協(xié)同和拮抗作用，最常見的是對(duì)可變剪接的拮抗調(diào)節(jié)[42]。肌肉發(fā)育是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的組織重塑過程，研究人員利用RNA-seq對(duì)小鼠腓腸肌全基因組的基因表達(dá)和可變剪接進(jìn)行了系統(tǒng)分析，時(shí)間點(diǎn)為胚胎期18.5 d到成年期的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果顯示，出生后的前2周是基因差異表達(dá)和可變剪接的動(dòng)態(tài)期，在發(fā)生可變剪接的基因中，鈣調(diào)節(jié)功能顯著增強(qiáng)[43]?？勺兗艚拥陌l(fā)生與胎兒發(fā)育并不相鄰，而是局限于出生后的前兩周[43]。差異表達(dá)基因和可變剪接的基因重疊極小，提示轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的獨(dú)立機(jī)制。差異表達(dá)的基因主要參與線粒體功能，而發(fā)生可變剪接的基因參與鈣調(diào)控、細(xì)胞連接和內(nèi)吞作用[43]。Ras-ERK通路調(diào)節(jié)多種細(xì)胞和生理反應(yīng)，包括細(xì)胞增殖、分化、動(dòng)物發(fā)育過程中的形態(tài)發(fā)生和成年人體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。DA-Raf1是A-Raf基因的剪接亞型，含有Ras結(jié)合域，但缺乏激酶結(jié)合域，對(duì)Ras-ERK通路呈顯性拮抗作用。DA-Raf1通過干擾Ras-ERK通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和骨骼肌細(xì)胞分化等作用[44]。另外，小鼠與人類有50% 以上的可變剪接在剪接方向和時(shí)間上是保守的，說明肌肉發(fā)育過程中的可變剪接在哺乳動(dòng)物中具有一定的保守性，這將為哺乳動(dòng)物的可變剪接研究提供參考。

3.2 牛肌肉發(fā)育可變剪接調(diào)控

在人類和小鼠研究的基礎(chǔ)上，牛肌肉的可變剪接調(diào)控也取得了一些進(jìn)展。He等[45]使用SOAPsplice軟件對(duì)胚胎135 d和成年肉牛的肌肉組織的可變剪接進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)兩者大約 66.6% 的基因經(jīng)歷了可變剪接，可變3’端剪接是最主要的類型，約占所有剪接類型的40.8%。Sun等[46]通過對(duì)胚胎、初生和成年的秦川牛肌肉組織的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，表明大部分基因表達(dá)在牛骨骼肌細(xì)胞分化和發(fā)育過程中發(fā)生了顯著的變化。各種剪接類型在胚胎期發(fā)生個(gè)數(shù)均最多，其中內(nèi)含子保留類型數(shù)目最多，其次為跳躍外顯子。初生和成年期外顯子跳躍類型占比最大。這與He等[46]研究報(bào)道的內(nèi)含子保留較少的可變剪接機(jī)制不盡相同。

但是，解析肌肉發(fā)育復(fù)雜性僅僅比較分析剪接類型與數(shù)量是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因此，基因編輯靶向剪接體研究也隨后在家畜中逐步開展。已知MBNL是miR-30-5p家族的候選靶點(diǎn)，是一種可變剪接調(diào)控因子。通過靶向剪接體試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-30-5p家族成員可以靈活調(diào)控MBNL的mRNA亞型表達(dá)[47]，進(jìn)而影響到MBNL1下游的肌肉相關(guān)基因INSR和Trim55的可變剪接，參與到INSR或Trim55所在的肌肉信號(hào)通路中[48]。

3.3 綿羊肌肉發(fā)育可變剪接調(diào)控

綿羊是一種重要的家畜，也是許多人類醫(yī)學(xué)研究的模型。綿羊肌肉中基因表達(dá)的研究將大大提高對(duì)肌肉生長(zhǎng)的認(rèn)識(shí)。雖然RNA-seq近幾年被廣泛應(yīng)用于各種生物，但在綿羊中的研究仍然比較少，可變剪接的相關(guān)研究更是缺乏。綿羊BEGAIN基因位于印跡DLK1基因的近端138 kb和美臀突變基因CLPG的203 kb位置處[49]，在綿羊骨骼肌發(fā)育過程中普遍表達(dá)[49]。有研究表明，BEGAIN基因的4個(gè)主要啟動(dòng)子和可變剪接的組合啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄本[49]在羊腦、腎臟、肝臟和骨骼肌中存在，這4種基因轉(zhuǎn)錄本以組織和啟動(dòng)子特異性的方式表現(xiàn)出父系或雙等位基因表達(dá)[49]。這說明與對(duì)DLK1-GTL2區(qū)域的核心基因簇的影響相反，CLPG突變不會(huì)改變BEGAIN的轉(zhuǎn)錄水平[49]。因此，雖然BEGAIN基因代表了另一個(gè)在綿羊DLK1-GTL2印跡域中的父系表達(dá)基因，但它的表達(dá)不受CLPG突變的遠(yuǎn)程調(diào)控元件的控制[49]。Zhang等對(duì)2種不同生長(zhǎng)速度的綿羊(小尾寒羊和杜泊羊)肱二頭肌構(gòu)建了2個(gè)cDNA文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)2組有多達(dá)5 116個(gè)和5 265個(gè)基因分別經(jīng)歷了13 827個(gè)和15 684個(gè)可變剪接[50]，共計(jì)超過1 / 4(分別為26.02%和25.28%)的基因發(fā)生了共29 511個(gè)可變剪接事件。此外，A3SS是綿羊中最常見的可變剪接類型，可變剪接均發(fā)生在1、2和3號(hào)染色體上，其發(fā)生頻率與綿羊染色體長(zhǎng)度一致(1、2和3號(hào)染色體最長(zhǎng))，這表明不同品種之間一些轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控機(jī)制可能是保守的[50]。

3.4 豬肌肉發(fā)育可變剪接調(diào)控

迄今，基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì)豬不同生長(zhǎng)速度和肥胖特征的差異基因表達(dá)的相關(guān)研究較多，有助于揭示影響這些特征表型變異的遺傳因素，而在mRNA亞型水平上的相關(guān)研究甚少[51-52]。豬肌肉發(fā)育中可變3’剪接是最常見的剪接類型[53]，這與人類(外顯子跳躍為普遍剪接類型)和水稻(內(nèi)含子保留為普遍剪接類型)等有所不同[54-55]。豬肌肉可變剪接具有一定復(fù)雜性，有些基因同時(shí)發(fā)生了4種剪接類型(如CSN1S1)。肌動(dòng)蛋白相關(guān)的LIM蛋白(ALP)與-肌動(dòng)蛋白在z盤上共定位，對(duì)整合細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控起關(guān)鍵作用。ALP發(fā)生可變剪接后得到的mRNA亞型在豬骨骼肌發(fā)育的產(chǎn)前、產(chǎn)后及兩品種間均有不同的表達(dá)譜，并且所有亞型均在分化的豬衛(wèi)星細(xì)胞中被誘導(dǎo)，這些結(jié)果為ALP剪接水平在調(diào)控豬骨骼肌發(fā)育中的作用提供了新的見解，提示其在肌源性分化中的作用[56]。另外，豬CAPZB基因存在2種可變剪接亞型CAPZB1和CAPZB2[57]。CAPZB1在20個(gè)組織中均有表達(dá)，CAPZB2主要表達(dá)于骨骼肌和心臟，這2種亞型在骨骼肌發(fā)育和品種間的表達(dá)譜也存在差異，被列入骨骼肌發(fā)育的候選基因。Cardoso等[58]的研究證明，豬肌肉中表達(dá)的基因約有10.9%發(fā)生了可變剪接，平均每個(gè)基因有2.9個(gè)轉(zhuǎn)錄本，外顯子跳躍是最常見的剪接類型，其次是5’剪接類型和3’剪接類型，通過比較不同背膘厚度豬肌肉的差異表達(dá)mRNA亞型，發(fā)現(xiàn)ITGA5、LITAF、TIMP1和ANXA2 mRNA亞型的高表達(dá)可能是引起背膘脂肪含量升高的原因。今后，對(duì)以上mRNA亞型調(diào)控功能的更廣泛深入了解將有助于闡明轉(zhuǎn)錄多樣性對(duì)豬肌肉表型的影響機(jī)理。

3.5 雞肌肉發(fā)育可變剪接調(diào)控

雞肌肉發(fā)育可變剪接的研究較少。近幾年，隨著RNA-seq分析的不斷深入，有研究將側(cè)重點(diǎn)轉(zhuǎn)向可變剪接，Li等[59]從白羽肉雞(42 d)和魯寧雞(70、120和150 d)采集肌肉組織測(cè)序，共注釋到16 958個(gè)基因，其中共有6 249個(gè)基因(36.85%)發(fā)生了可變剪接。這些可變剪接包括7種類型：跳躍外顯子、保留內(nèi)含子、可變5’剪接位點(diǎn)、可變3’剪接位點(diǎn)、可變5’UTR剪接位點(diǎn)、可變3’UTR剪接位點(diǎn)和其它類型。在這4 個(gè)樣本(42、70、120和150 d)中可變3’剪接位點(diǎn)數(shù)量最多，分別為4 221、4 401、4 409 和3 294，保留內(nèi)含子數(shù)量最少，6個(gè)參與肌肉發(fā)育和免疫應(yīng)答的DEGs(SRPK3、ENSGALG00000022884、CCL4、GATM、SESN1和PTTG1IP)在4種肌肉組織中均發(fā)生可變剪接[57]。

Delta-like 1 homologue(DLK1)是調(diào)控哺乳動(dòng)物脂肪和肌肉發(fā)育的印跡基因。DLK1不同的剪接亞型在哺乳動(dòng)物的肌生成調(diào)控中具有不同的功能，而火雞和鵪鶉中沒有DLK1轉(zhuǎn)錄本可變剪接的存在[60]。肌生成抑制素(MSTN)通過抑制成肌細(xì)胞的增殖和分化，負(fù)調(diào)控肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育。最近，在家禽肌肉中發(fā)現(xiàn)了5種MSTN的可變剪接亞型(MSTN-A到MSTN-E)。MSTN-A在肌肉中高表達(dá)，其編碼的全長(zhǎng)肽具有抗肌生成活性。另一種亞型MSTN-B也在肌肉中高度表達(dá)，并編碼一種截短肽，該肽在體外具有促肌原性能力，包括促進(jìn)禽類肌肉前體細(xì)胞的增殖和分化[61]。

4 可變剪切的分析方法

4.1 可變剪切分析方法進(jìn)展

研究可變剪接對(duì)肌肉類型特異性發(fā)育和功能的影響需要具備識(shí)別可變剪接亞型的能力，定量分析可變剪接的傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)[62]。20世紀(jì)90年代末，發(fā)展成為使用表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)測(cè)序(即全長(zhǎng)mRNA的片段)，在真核生物中發(fā)現(xiàn)了廣泛的可變剪接[63]。至21世紀(jì)前10年，芯片數(shù)據(jù)的廣泛累積，實(shí)現(xiàn)了跨組織、細(xì)胞狀態(tài)和物種的全局可變剪接調(diào)控過程研究。然而這些技術(shù)通量低(qRT-PCR和ESTs)、噪音高(ESTs和芯片)，多局限于已知的可變剪接(RT-PCR和芯片)[64]。隨后開發(fā)的二代RNA測(cè)序(RNA-seq)，可以大規(guī)模并行運(yùn)算，在高通量測(cè)序儀一次運(yùn)行中產(chǎn)生數(shù)十億的短序列讀段，這不僅極大的改進(jìn)了芯片數(shù)據(jù)分析可變剪接的一些不足，還可以發(fā)現(xiàn)新基因和mRNA亞型、定量基因表達(dá)和定量分析可變剪接[65-66]。如今，測(cè)序技術(shù)又有了新突破，以太平洋生物科學(xué)(PacBio)和牛津納米孔技術(shù)(Nanopore)為代表的第三代測(cè)序方法(Iso-Seq)，成功識(shí)別了許多具有良好特征的轉(zhuǎn)錄本和可變剪接[67-68]。第三代測(cè)序具有讀段長(zhǎng)、通量低、錯(cuò)誤率高的特點(diǎn)，對(duì)于轉(zhuǎn)錄本和可變剪接的分析仍存在不足。研究人員將第三代測(cè)序儀的長(zhǎng)而易出錯(cuò)的讀段與第二代測(cè)序儀的短而準(zhǔn)確的讀段特點(diǎn)相結(jié)合，應(yīng)運(yùn)而生了一種混合方法，用于糾正測(cè)序錯(cuò)誤和從長(zhǎng)讀段中獲得亞型定量[66]。從測(cè)序發(fā)展的角度看，第三代長(zhǎng)讀段RNA-seq數(shù)據(jù)與EST的測(cè)序數(shù)據(jù)相似，針對(duì)EST數(shù)據(jù)開發(fā)的計(jì)算方法在PacBio和Nanopore RNA-seq數(shù)據(jù)同樣適用[69]。

4.2 RNA-Seq數(shù)據(jù)量化可變剪接

通過使用RNA-seq數(shù)據(jù)來直接量化單個(gè)可變剪接是目前比較普遍的方法。在這種方法中，從RNA-seq數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)可變剪接，計(jì)算與特定外顯子或剪接連接對(duì)齊的讀長(zhǎng)，并使用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)方法來量化可變剪接和檢測(cè)不同生物條件之間的差異可變剪接。在基于可變剪接的分析中，一個(gè)廣泛使用的度量標(biāo)準(zhǔn)是剪接百分比(PSI或Ψ)，它表示包含特定外顯子或剪接位點(diǎn)的基因mRNA轉(zhuǎn)錄的百分比[70]。對(duì)于給定的可變剪接，PSI值可以通過特定外顯子或剪接連接的RNA-seq讀長(zhǎng)計(jì)數(shù)來計(jì)算[71]。許多流行的用于可變剪接的RNA-seq分析的計(jì)算工具都是基于可變剪接開發(fā)的(MISO[71]、SpliceTrap[72]、rMATS[71]和MAJIQ[73]等)。這些工具對(duì)可變剪接(基本的和復(fù)雜的)的讀長(zhǎng)計(jì)數(shù)過程以及用于量化和確定差異可變剪接的統(tǒng)計(jì)方法的定義有所不同。盡管如此，對(duì)于同一組可變剪接，這些工具傾向于產(chǎn)生高度一致的PSI值[74]。鑒于PSI值代表了一個(gè)從讀長(zhǎng)計(jì)數(shù)中估計(jì)出來的比例，PSI估計(jì)值的置信區(qū)間取決于感興趣可變剪接在整個(gè)RNA-seq的序列覆蓋率，因此，更高的覆蓋率會(huì)導(dǎo)致更可靠的PSI估計(jì)值，這是可變剪接在RNA-seq分析中的一個(gè)關(guān)鍵問題。研究表明，基于RNA-seq讀長(zhǎng)計(jì)數(shù)建模得到PSI值的置信區(qū)間可以改進(jìn)下游統(tǒng)計(jì)推斷[72]。此外，SUPPA是一款通過轉(zhuǎn)錄本定量來獲取可變剪接定量的軟件，它使用一種混合算法利用完整的轉(zhuǎn)錄本定量來進(jìn)行基于可變剪接的分析，這種方法運(yùn)用偽對(duì)齊算法不僅計(jì)算速度快，而且可以擴(kuò)展到大型數(shù)據(jù)集。但是，它僅限于已有的文本注釋，不能發(fā)現(xiàn)或量化新的可變剪接，這個(gè)問題是分析可變剪接遺傳變異的一個(gè)阻礙，因?yàn)榛蚪M變異可以在單個(gè)轉(zhuǎn)錄組中產(chǎn)生新的可變剪接。

5 展 望

幾十年來，肌肉從受精卵發(fā)育為成體的分子驅(qū)動(dòng)過程一直是備受關(guān)注的研究課題，可變剪接在調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育和功能方面具有巨大潛力，它通過增加蛋白質(zhì)多樣性或蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的機(jī)制，影響鈣調(diào)控或肌纖維膜等功能廣泛參與到肌肉的發(fā)育轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程中。目前，人和小鼠肌肉發(fā)育的可變剪接研究較為廣泛，已經(jīng)鑒定了多種調(diào)控可變剪接發(fā)生的RNA結(jié)合蛋白。仍存在很多問題有待解決，第一，肌肉中可變剪接和聚腺苷酸化的網(wǎng)絡(luò)功能；第二，RBPs在肌肉發(fā)育中的調(diào)節(jié)機(jī)制還沒有完全確定；第三，表觀遺傳學(xué)對(duì)細(xì)胞過程的影響，可以結(jié)合肌肉細(xì)胞體外培養(yǎng)試驗(yàn)；第四，大量的剪接異構(gòu)體與可變剪接的功能效應(yīng)有待于研究。由于可變剪接在哺乳動(dòng)物之間具有一定的保守性，未來家畜肌肉發(fā)育的研究將建立在人和小鼠的研究基礎(chǔ)上，并結(jié)合染色質(zhì)狀態(tài)、表觀遺傳標(biāo)記和三維基因組等，進(jìn)一步研究家畜肌肉發(fā)育過程中可變剪接的調(diào)控和協(xié)調(diào)；揭示單個(gè)剪接亞型的生理功能；構(gòu)建控制發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)的剪接網(wǎng)絡(luò)，為培育高效生長(zhǎng)發(fā)育的動(dòng)物品種提供理論基礎(chǔ)。