王小云，脫聰聰,黃志蕓,丁旭，周瑫，史金涵，俞樹良，霍歸國,張繼,3*

1(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州，730070)3(西北師范大學(xué) 新農(nóng)村發(fā)展研究院，甘肅 蘭州，730070)

羌活(NotopterygiumincisumTing ex H.T.Chang)為傘形科多年生植物，主要分布在我國云南、四川、甘肅和青海一帶，在解表散寒、祛風(fēng)除濕和止痛等方面功效俱佳[1-2]。關(guān)于羌活揮發(fā)油組成的研究已經(jīng)十分普遍，但這些研究主要集中于干燥羌活或中成藥羌活所得揮發(fā)油的成分研究[3-7]。李春麗等[7]研究了不同采摘期的羌活揮發(fā)油的成分差異，但他們對于羌活樣品仍然采用了干燥的處理方式。有研究表明是否干燥與不同的干燥方式對中草藥原料的成分有很大的影響[8]。

紅外光譜作為一種綠色、便捷的分析手段，因其不需要繁瑣的樣品處理，已廣泛應(yīng)用于構(gòu)建各類揮發(fā)油的紅外指紋圖譜[9-12]。揮發(fā)油的抑菌和抗氧化性能是評價其生物活性的主要方法。劉景坤等[13]報道了羌活地上部分提取物對3種農(nóng)業(yè)病原真菌(番茄早疫病原菌、灰葡萄孢菌和尖孢鐮刀菌)具有明顯的抑制作用。研究表明，羌活揮發(fā)油在關(guān)節(jié)消炎及鎮(zhèn)痛方面具有顯著的效果[5-6]，羌活種子揮發(fā)油具有一定的抗氧化活性[14]。然而，關(guān)于新鮮羌活揮發(fā)油的組成、抗氧化和抑菌活性研究十分缺乏。

本文以云南省麗江市生長期內(nèi)的新鮮羌活莖葉為原料，未經(jīng)任何干燥處理，利用水蒸汽提取法獲得新鮮羌活揮發(fā)油，并利用GC-MS鑒定其成分，利用傅里葉紅外光譜(Fouier transform infrared,FT-IR)構(gòu)建其紅外指紋圖譜。研究新鮮羌活揮發(fā)油在生物活性方面的抗氧化潛力和抑菌活性，為羌活的科學(xué)評估以及應(yīng)用方向提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

新鮮羌活(NotopterygiumincisumTing ex H.T.Chang)，云南麗江翠森茂生物科技有限責(zé)任公司；KBr、乙醚(分析純)，中華試劑網(wǎng)。

HP6890/5973型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Hewlett-packard 公司; Bluestar紫外可見光分光光度計,北京萊伯泰科儀器有限公司; is10傅里葉紅外光譜測定儀，美國Thermo Fisher 公司;WFX-210原子吸收分光光度計，上海皖寧精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 新鮮羌活揮發(fā)油的提取

精密稱取1 kg新鮮羌活置于不銹鋼鍋中，料液比1∶12(g∶mL)，浸泡3 h，水蒸汽提取12 h，直至揮發(fā)油含量不再增加。新鮮羌活的揮發(fā)油產(chǎn)率為2.4%。

1.2.2 揮發(fā)油的GC-MS分析

參照劉衛(wèi)根等[1]的GC-MS測試條件并稍作改進(jìn)。GC條件：初始溫度60 ℃，以10 ℃/min升至210 ℃，持續(xù)2 min，隨后4 ℃ /min升至280 ℃，持續(xù)2 min。進(jìn)樣模式為分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，分流比20∶1。

1.2.3 揮發(fā)油的FT-IR圖譜測定

參照趙玉叢等[9]的方法，利用FT-IR測定羌活揮發(fā)油的指紋特征吸收峰。將光譜純KBr壓片，采集背景。吸取少量揮發(fā)油滴于KBr壓片表面,輕搖，使揮發(fā)油分布均勻形成薄層，在400～4 500 cm-1范圍內(nèi)掃描揮發(fā)油，掃描次數(shù)累計至32次，分辨率0.74 cm-1。

1.2.4 揮發(fā)油的抑菌活性及其機(jī)制探究

采用濾紙片擴(kuò)散法考察新鮮羌活揮發(fā)油對待測菌株的抑制活性。將滅菌的直徑為6.0 mm的圓形濾紙片置于含有菌懸液的LB培養(yǎng)基上，以無菌水設(shè)置對照組，其余濾紙片均滴加5 μL揮發(fā)油。將LB培養(yǎng)基封口并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12 h后，測量抑菌圈直徑，重復(fù)3次。參照文獻(xiàn)[15-16]的測定方法，采用倍比稀釋法將100 μL新鮮羌活揮發(fā)油(最終體積分?jǐn)?shù)為80,40,20,10,5,2.5,1.25,0.625,0 μL/mL)與活化后的菌懸液(菌體濃度1×106CFU/mL)混合后分別滴入無菌96孔平底微量培養(yǎng)板中，確定揮發(fā)油對供試菌株的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)值。

參照SHI等[17]的制樣方法，利用掃描電鏡觀察銅綠假單胞桿菌經(jīng)揮發(fā)油作用前后的微觀形貌。參照文獻(xiàn)[18-19]的方法并稍作改進(jìn)，測定銅綠假單胞桿菌經(jīng)揮發(fā)油在MIC和MBC作用下，菌懸上清液在不同時間段內(nèi)的吸光值以及K+的濃度。

1.2.5 揮發(fā)油的抗氧化活性測定

參照文獻(xiàn)[20-21]的方法，測定新鮮羌活所得揮發(fā)油對DPPH自由基和·OH的清除活性，以VC作為陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 羌活揮發(fā)性成分分析及討論

新鮮羌活揮發(fā)油經(jīng)GC-MS分析，共分離出103種成分(圖1)，其中可以確定的成分共91種(表1)，占總含量的98.49%。相對含量高于1%的共18種，分別為D-檸檬烯、γ-松油烯、芹菜腦、胡蘿卜次醇、1,7,7-三甲雙環(huán)[2.2.1]庚-2-烯、萜品醇、(+)-α-蒎烯、α-紫穗槐烯、芳樟醇、欖香醇、α-月桂烯、D-香芹酮、α-紅沒藥醇、α-蓽澄茄醇和蓽澄茄油烯等。新鮮羌活揮發(fā)油的成分以倍半萜類物質(zhì)為主，烯烴類物質(zhì)的含量高達(dá)56.50%，醇類物質(zhì)的含量為21.95%，酮類物質(zhì)的含量為3.8%，酯類物質(zhì)的含量為2.2%，醛類物質(zhì)的含量為0.89%，烷烴類物質(zhì)的含量僅為0.3%。

圖1 羌活揮發(fā)油總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of volatile oil from N.incisum

唐國琳等[4]研究了四川、青海和甘肅等地11批羌活揮發(fā)油的得率及組成，除四川白玉絨蓋鄉(xiāng)產(chǎn)率為2.60%外其揮發(fā)油產(chǎn)率在0.60%～1.99%，代表成分為(+)-α蒎烯(1.60%～52.93%)、α-蒎烯(0.83%～21.61%)和松油烯(0.79%～14.66%)等。四川絨蓋鄉(xiāng)的羌活揮發(fā)油檢測出了較高含量(37.30%)的檸檬烯，高于新鮮羌活揮發(fā)油中的含量(18.83%)，但其中含量較高的肉豆蔻醚類物質(zhì)(20%～60%)在新鮮羌活揮發(fā)油中未檢出。這11批次羌活揮發(fā)油的主要成分包含烯烴類、醇類、醚類、酯類以及醛酮類，并含有少量的酚類和脂肪酸，缺乏烷烴類物質(zhì)等。

新鮮羌活揮發(fā)油中含量高于1%的胡蘿卜次醇(7.69%)、1,7,7-三甲雙環(huán)[2.2.1]庚-2-烯(4.41%)、α-紫穗槐烯(2.45%)、芳樟醇(2.11%)、α-紅沒藥醇(1.43%)和蓽澄茄油烯(1.10%)在四川、青海和甘肅等地的羌活揮發(fā)油中未檢出；新鮮羌活揮發(fā)油中的芹菜腦(13.16%)在四川、青海和甘肅羌活揮發(fā)油中的含量低于1%；新鮮羌活揮發(fā)油中的γ-松油烯(13.91%)的含量高于四川、甘肅和青海除四川白玉絨蓋鄉(xiāng)(14.66%)外，其他地區(qū)均低于6.3%)。上述分析說明，新鮮羌活揮發(fā)油富含烯醇類化合物，含有少量的酮酯類和醛類物質(zhì)，但缺乏醚類、酚類和脂肪酸等物質(zhì)。新鮮羌活的揮發(fā)油(2.4%)產(chǎn)率高于青海、甘肅和四川多地的干燥羌活。綜上所述，新鮮羌活揮發(fā)油與已報道的羌活揮發(fā)油在組成及其含量上具有顯著差異，這可能與產(chǎn)地、品種、生長期以及提取方式(是否干燥)有關(guān)。

表1 新鮮羌活揮發(fā)油的化學(xué)成分Table 1 Chemical constituents of volatile oils from fresh N.incisum

續(xù)表1

2.2 羌活揮發(fā)油的紅外指紋圖譜分析

a-4 500～500 cm-1的紅外圖譜;b-3 200～2 500 cm-1的二階圖譜;c-1 900～500 cm-1的二階圖譜圖2 新鮮羌活所得揮發(fā)油的紅外光譜圖及二階導(dǎo)數(shù)圖像Fig.2 Infrared spectrogram of volatile oil from fresh N.incisum and second derivative image

表2 新鮮羌活揮發(fā)油的紅外特征峰及其歸屬Table 2 The infrared characteristic peak and its attribution of the volatile oil from fresh N.incisum

羌活及其寬葉羌活揮發(fā)油紅外圖譜的研究目前尚未開展。參照趙玉從等[9]的研究，新鮮羌活揮發(fā)油與艾葉揮發(fā)油的紅外圖譜相似，共有峰(±1 cm-1)在3 444、3 077、2 926、2 726、1 448、1 018、987 cm-1附近；相近峰(±6 cm-1)在2 965、2 867、2 838、1 782、1 511、1 374、1 240、881 cm-1附近。新鮮羌活揮發(fā)油與干姜[11]揮發(fā)油紅外圖譜比較，其共有峰(±1 cm-1)在3 077、2 926、2 726、1 374、881、541 cm-1處；相近峰(±5 cm-1)在2 965、2 867、1 511、1 448、1 374、1 240 cm-1附近。相較于艾葉和干姜揮發(fā)油紅外圖譜，羌活揮發(fā)油的特有峰為3 021、2 798、1 725、1 652、1 552、1 268、1 197、1 153、1 110、1 066、954、804、734、678、636 cm-1。其在1 652和804 cm-1處的峰形明顯，無需借助二階圖譜，在紅外圖譜中便可直接觀察，可作為新鮮羌活揮發(fā)油鑒定及其快速篩選的重要依據(jù)。

2.3 新鮮羌活揮發(fā)油的抑菌活性

2.3.1 新鮮羌活揮發(fā)油的抑菌活性初篩

表3表明，新鮮羌活揮發(fā)油對3種供試菌均有不同程度的抑制效果，其強(qiáng)弱順序為銅綠假單胞桿菌>大腸桿菌>金黃色葡萄球菌。新鮮羌活揮發(fā)油對銅綠假單胞桿菌和大腸桿菌的抑制作用表現(xiàn)為高度敏感，對金黃色葡萄球菌的抑制作用表現(xiàn)為低度敏感。羌活揮發(fā)油的抑菌活性研究尚未見報道。本研究中羌活揮發(fā)油的抑菌結(jié)果與檸檬果皮揮發(fā)油[22]相類似，它們對大腸桿菌的抑制活性都優(yōu)于對金黃色葡萄球菌的抑菌活性，這可能與它們擁有相似的主要成分，D-檸檬烯(42.93%)、γ-松油烯(8.41%)和α-萜品醇(6.39%)有關(guān)。檸檬果皮揮發(fā)油[22]對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC值分別為0.10和12.50 μL/mL，而新鮮羌活揮發(fā)油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC值分別為5.0和40.0 μL/mL，這可能是新鮮羌活揮發(fā)油的主要成分D-檸檬烯(18.83%)含量低于檸檬果皮揮發(fā)油(42.93%)所致。檸檬烯對金黃色葡萄球菌無抑制活性[23-24]，而新鮮羌活揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌有抑制活性，因此，檸檬烯可能不是新鮮羌活揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌起微弱抑制作用的主要活性物質(zhì)。其研究表明，檸檬烯對銅綠假單胞桿菌和大腸桿菌的MIC值分別為10.0和30 μL/mL，高于羌活揮發(fā)油對銅綠假單胞桿菌(2.5 μL/mL)和大腸桿菌(10 μL/mL)的MIC值，這說明除D-檸檬烯外，新鮮羌活揮發(fā)油中的其他萜類物質(zhì)也參與了銅綠假單胞桿菌和大腸桿菌的活性抑制過程[23]。據(jù)報道α-紫穗槐烯(2.45%)、欖香烯(0.19%)和石竹烯(0.05%)等對金黃色葡萄球菌具有顯著的抑制活性[25]，但這些組分在新鮮羌活揮發(fā)油中的含量較低，故羌活揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌具有微弱的抑制活性。綜上所述，新鮮羌活揮發(fā)油的抑菌活性是多種活性成分協(xié)同作用的結(jié)果，并存在一定量效關(guān)系。

表3 新鮮羌活揮發(fā)油的抑菌圈直徑及其MIC和MBCTable 3 Diameter of bacteriostatic circle and its MIC and MBC of the volatile oil from N.incisum

2.3.2 新鮮羌活揮發(fā)油的抑菌機(jī)制的初步探究

以銅綠假單胞桿菌為研究材料，利用掃描電鏡觀察銅綠假單胞桿菌在揮發(fā)油MIC和MBC作用下的微觀外貌形態(tài)，并監(jiān)測不同時間段內(nèi)菌懸上清液中的K+濃度和紫外吸光值。通過圖3-a可以看出未經(jīng)揮發(fā)油作用的銅綠假單胞桿菌無褶皺和菌體凹陷現(xiàn)象，外表光滑，呈桿狀規(guī)則分布。經(jīng)MIC處理后(圖3-b)，菌體出現(xiàn)了部分干癟，同時存在粘結(jié)和細(xì)胞堆疊以及部分坍塌現(xiàn)象。經(jīng)MBC處理后(圖3-c)，菌體變短，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)已被完全破壞，并存在嚴(yán)重的坍塌和原生質(zhì)外泄，菌體的正常代謝嚴(yán)重受阻，甚至死亡。上述現(xiàn)象說明新鮮羌活揮發(fā)油可以損壞銅綠假單胞桿菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)從而抑制其生長。

a-處理4 h后的空白組;b-MIC濃度處理4 h;c-MBC濃度處理4 h圖3 銅綠假單胞桿菌的掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.3 Scanning electron micrograph of Pseudomonas aeruginosa

圖4-a為MIC和MBC處理后的菌懸上清液中的鉀離子濃度曲線。MIC組和MBC組K+質(zhì)量濃度隨時間的增加上升顯著，最終質(zhì)量濃度分別為MIC組0.98 mg/L，MBC組1.49 mg/L，對照組0.29 mg/L。經(jīng)揮發(fā)油MIC和MBC處理下的菌懸液上清液，在260 nm處的紫外吸光值可以作為評價細(xì)胞內(nèi)溶物釋放量的指標(biāo)。圖4-b為菌懸上清液的吸光值曲線。MIC組和MBC組的吸光值均顯著上升，MIC組0.42，MBC組最終吸光值為0.73，對照組0.05。上述現(xiàn)象說明，經(jīng)揮發(fā)油MIC作用下的銅綠假單胞桿菌的膜結(jié)構(gòu)部分受損，K+外泄和細(xì)胞內(nèi)溶物釋放增強(qiáng)；經(jīng)揮發(fā)油MBC作用下的膜結(jié)構(gòu)已被完全破壞，K+外泄和細(xì)胞內(nèi)溶物的釋放不受膜結(jié)構(gòu)限制。上述結(jié)論佐證了掃描電鏡的觀察結(jié)果，劉雪等[23]觀察到銅綠假單胞桿菌經(jīng)檸檬烯作用后破壞了細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)及其完整性，與本實驗結(jié)果相類似。同時3-蒈烯被證明可以抑制銅綠假單胞桿菌的生長[26]，故檸檬烯和3-蒈烯可能是新鮮羌活揮發(fā)油對銅綠假單胞桿菌起抑制作用的主要活性物質(zhì)。至于其他組分的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

a-K+質(zhì)量濃度;b-吸光值圖4 不同濃度揮發(fā)油處理對菌懸液上清液中的K+質(zhì)量濃度和紫外吸光值的影響Fig.4 Effects of different concentrations of volatile oil on the concentration of K+ and UV absorbance value in the supernate of bacterial suspension

2.4 新鮮羌活揮發(fā)油對DPPH自由基和·OH的清除活性

圖5-a為新鮮羌活揮發(fā)油對DPPH自由基的清除活性，質(zhì)量濃度在5～80 mg/mL時揮發(fā)油對DPPH自由基的清除率為30.10%～95.89%,IC50為15.27 mg/mL。圖5-b為新鮮羌活揮發(fā)油對·OH的清除活性，在質(zhì)量濃度為1～10 mg/mL時，對·OH的清除率達(dá)到8.34%～91.04%，IC50為4.07 mg/mL。新鮮羌活揮發(fā)油對DPPH自由基和·OH均有顯著的清除效果，這可能是由于新鮮羌活揮發(fā)油具有較高含量的萜烯類物質(zhì)(D-檸檬烯和γ-松油烯)[27-28]。新鮮羌活揮發(fā)油對DPPH自由基的清除率(IC50為15.29 mg/mL)顯著低于羌活種子揮發(fā)油對DPPH的清除率(IC50為1.90 mg/mL)[14]，這可能與羌活種子揮發(fā)油具有較高含量的蒎烯(α-蒎烯含量為31.37%，β-蒎烯含量為8.93%)有關(guān)，其他組分對自由基的清除作用仍需進(jìn)一步研究。

a-DPPH自由基;b-·OH圖5 揮發(fā)油對DPPH和·OH自由基的清除活性Fig.5 Scavenging activity of volatile oil on DPPH free radical and ·OH

3 結(jié)論與討論

利用GC-MS進(jìn)行分析，新鮮羌活揮發(fā)油中共分離出103種組分，鑒定出91種化學(xué)成分，占總含量的98.49%，共有18種組分的相對含量在1%以上，主要為D-檸檬烯(18.83%)、γ-松油烯 (13.91%)、芹菜腦(13.16%)等，其富含烯烴類和醇類物質(zhì)。其中檸檬烯具有廣譜的抑菌活性[23]；γ-松油烯對革蘭氏陰性菌具有一定程度的抑制活性[29]；芹菜腦被報道具有鎮(zhèn)定安神的效果[30]；α-蒎烯具有抑制HepG2細(xì)胞增殖的作用[31]；胡蘿卜次醇對網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用[32];芳樟醇具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎、鎮(zhèn)靜安眠等功效，并具有芳香味，可應(yīng)用于復(fù)配香料的生產(chǎn)[33]；萜品醇具有廣譜的抑菌活性[22]。應(yīng)用FT-IR，新鮮羌活揮發(fā)油共鑒定出34個指紋特征吸收峰，佐證了新鮮羌活揮發(fā)油中烯醇類、醛酯類以及酮類等物質(zhì)的存在；其紅外圖譜在1 652和804 cm-1處的特征峰，峰形明顯，可作為快速篩選羌活揮發(fā)油的重要依據(jù)。

抗氧化實驗表明新鮮羌活揮發(fā)油具有顯著的清除DPPH自由基和·OH的能力，這主要是因為羌活揮發(fā)油中含有烯烴類物質(zhì)和醇類物質(zhì)，這些物質(zhì)可以阻斷氧化反應(yīng)過程中反應(yīng)鏈之前的非鏈過程，清除啟動鏈產(chǎn)生的·OH，同時γ-松油烯、萜品烯和蒎烯等可阻斷氧化反應(yīng)的自由基鏈，并形成穩(wěn)定的自由基，從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力[22]。抑菌實驗表明新鮮羌活揮發(fā)油對于銅綠假單胞桿菌和大腸桿菌具有良好的抑制活性，對金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱。本研究為新鮮羌活揮發(fā)油作為一種天然抑菌劑應(yīng)用到食品及醫(yī)療行業(yè)提供了理論依據(jù)。

綜上，新鮮羌活揮發(fā)油擁有良好的抗氧化和抑菌活性并包含多種功效性組分，可作為一種多功效型食品添加劑應(yīng)用到食品行業(yè)。