朱雨婕，代安然，李佳銘，吳凡，楊崇婧，陳磊

(江南大學 生物工程學院 糖化學與生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

近年來，以生物積累、生物轉(zhuǎn)化或生物分子為基礎(chǔ)的金屬納米粒子(如Ag、Au、Pd等)生物合成方法，因具有生態(tài)友好、安全高效等優(yōu)點，正受到越來越多的關(guān)注[1]。其中，由蘑菇分泌物合成的納米顆粒具有分散性好、穩(wěn)定性高、保存期長等優(yōu)點，因而在綠色制造、功能食品和醫(yī)藥材料等領(lǐng)域已經(jīng)展現(xiàn)出巨大的潛力[2-3]。到目前為止，相關(guān)學者已在Pleurotussp.，Ganodermasp.，Lentinussp.等多種蘑菇中通過細胞內(nèi)和/或細胞外催化合成的方式，實現(xiàn)了金屬/非金屬納米顆粒的生物合成[4]。研究表明，利用食用菌的無細胞濾液(cell-free filtrate，CFF)進行胞外合成，具有價格低廉、環(huán)境友好、反應(yīng)條件溫和可控以及易于分離等優(yōu)點[5-6]，因而更具應(yīng)用潛力。例如，董麗娜等[7]利用秀珍菇菌絲體的CFF不僅實現(xiàn)了AgNPs的可控合成，并且證實產(chǎn)物具有優(yōu)良的抑菌活性和廣譜抗菌活性。利用蘑菇合成的銀納米顆粒(silver nanoparticles,AgNPs)在抗菌劑、廢水處理和催化劑等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，相關(guān)產(chǎn)品的需求量越來越大[4,8]。

金針菇(Flammulinavelutipes)富含蛋白質(zhì)、多糖、類黃酮和多酚等生物分子，不僅具有較高的營養(yǎng)價值[9]，在金屬/非金屬元素的生物轉(zhuǎn)化方面也表現(xiàn)出極好的潛力，如利用金針菇合成生物三聚體-金納米顆粒(AuNPs)，并作為一種多相催化劑用于減少有機污染物[10]；利用金針菇自身的解毒機制實現(xiàn)SeNPs的胞內(nèi)合成[11]。然而，利用金針菇進行納米顆粒的胞外合成則鮮有報道，以金針菇發(fā)酵產(chǎn)物進行納米銀顆粒的合成也有待研究。

本研究利用金針菇的無細胞濾液(cell-free filtrate ofFlammulinavelutipes,FV-CFF)進行AgNPs的生物合成，進而通過反應(yīng)動力學生成曲線探討凍融和pH等因素對FV-CFF合成AgNPs的影響。最后，結(jié)合產(chǎn)物粒徑和紫外可見(UV-Vis)吸收光譜的分析結(jié)果，討論FV-CFF的成分及凍融和pH等不同處理條件對其還原力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇(Flammulinavelutipes)CICC 50051，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC)；AgNO3、CH3COOH、NaOH、3,5-二硝基水楊酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3等，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；BCA法蛋白濃度測定試劑盒(增強版)，碧云天生物技術(shù)有限公司；納米銀(AgNPs)標準溶液，張家港耐爾納米科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H2-2型電熱恒溫振蕩水浴箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Enspire 2300型酶標儀，美國PerkinElmer 公司；FAl004型電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；全溫搖床柜HYG-A，太倉市實驗設(shè)備廠；納米激光粒度及zeta電位分析儀ZEN3700，馬爾文儀器有限公司；透射電子顯微鏡(TEM，H-7650)，日本日立株式會社。

1.3 實驗方法

1.3.1 金針菇菌絲體生長曲線的測定

金針菇種子液配方(g/L)：葡萄糖20，酵母20，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，VB10.5，裝液量為200 mL/500 mL搖瓶。高壓滅菌后，接入10片1 cm×1 cm金針菇PDA平板切片，于25 ℃，160 r/min搖床培養(yǎng)7 d后，按體積分數(shù)5%接種于發(fā)酵液中(配方與種子液一致)，于160 r/min搖床中25 ℃培養(yǎng)。每天收集發(fā)酵產(chǎn)物，洗滌并烘干菌體至恒重，測定生長曲線，并用DNS法測定發(fā)酵液中的殘?zhí)呛?n=3)。

1.3.2 無細胞濾液FV-CFF制備

將金針菇菌絲體發(fā)酵7 d后無菌過濾，收集菌絲體，并用無菌水洗滌3～5次，轉(zhuǎn)移到無菌去離子水(200 mL)中繼續(xù)培養(yǎng)3 d。抽濾，去除菌絲體，即得無細胞濾液FV-CFF，保存于4 ℃冰箱中，待用。

1.3.3 FV-CFF合成納米顆粒

配制濃度為6 mmol/L的AgNO3溶液，并按照FV-CFF∶AgNO3溶液以2.0∶0.6體積比混合，并以超純水補足至4.0 mL，混合均勻，于100 ℃加熱反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，掃描415 nm處的吸光度值，以所購買的納米銀標準溶液做標準曲線，測定AgNPs的產(chǎn)率。

1.3.4 AgNPs的合成及影響因素

1.3.4.1 FV-CFF及AgNO3添加比例對AgNPs合成的影響

將FV-CFF與AgNO3溶液(6 mmol/L)以1∶3～12∶3的體積比混合(對應(yīng)發(fā)酵液比例5%～60%)，并以超純水補足至4.0 mL，100 ℃水浴加熱30 min，反應(yīng)結(jié)束后迅速冰浴冷卻至室溫，測定OD415，并計算AgNPs產(chǎn)量。固定FV-CFF添加量為2.0 mL，測定AgNO3添加濃度對AgNPs生成的影響。

1.3.4.2 pH對FV-CFF合成 AgNPs的影響

經(jīng)測定，初始FV-CFF的pH為7.22，分別用微量醋酸溶液和NaOH 溶液(均為100 g/L)將FV-CFF調(diào)節(jié) pH 到 3、5、7、9、11，按1.3.3小節(jié)中所述條件進行反應(yīng)，測定不同pH下FV-CFF合成納米銀的效果。

1.3.4.3 凍融對FV-CFF合成AgNPs的影響

根據(jù)確定的FV-CFF添加量及AgNO3濃度，測定50～100 ℃下FV-CFF凍融前后(凍融后離心除去不溶物)合成AgNPs的動力學生成曲線。

1.3.4.4 凍融前后的FV-CFF在pH 11時合成AgNPs效果

選擇AgNO3終濃度為0.6 mmol/L(即0.4 mL)，F(xiàn)V-CFF(pH 11)添加比例為15%(即0.6 mL)，并以超純水補足4.0 mL，測定FV-CFF凍融前后(pH 11)合成AgNPs的動力學生成曲線。

1.3.5 檢測與分析方法

1.3.5.1 凍融前后FV-CFF中的主要成分及還原力測定

凍融前后FV-CFF中總蛋白、總糖和還原糖含量的測定分別采用BCA法[12]、苯酚-硫酸法[13]和DNS法，可溶性固形物含量的測定采用農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 2 637—2014[14]中的折射儀法。

凍融及pH對FV-CFF總還原力的影響采用鐵氰化鉀法評價[15]。取0.2 mL不同樣品，分別加入1 mL pH 6.6的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L)和1 mL鐵氰化鉀溶液(1 g/mL)混合均勻，50 ℃加熱反應(yīng)20 min，再加10%三氯乙酸0.2 mL終止反應(yīng)，以4 000 r/min離心10 min。吸取0.2 mL上清液加去離子水稀釋1倍，加0.04 mL 1% FeCl3溶液，常溫靜置反應(yīng)10 min，測定700 nm波長處的吸光度。吸光度值的大小代表鐵離子還原力的大小，以20 mg/L的Vc溶液作為陽性對照。

1.3.5.2 AgNPs的表征

分別取凍融前后及不同pH下的樣品與AgNO3在100 ℃反應(yīng)30 min，吸取生成的產(chǎn)物溶液，分別掃描300～700 nm范圍內(nèi)的紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜；將樣品在銅網(wǎng)碳膜上制樣，干燥后使用透射電子顯微鏡在80 kV的加速電壓下獲得產(chǎn)物的形貌特征；使用馬爾文納米激光粒度儀測定樣品及產(chǎn)物的粒度分布。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均采用三平行設(shè)計(n=3)，試驗數(shù)據(jù)采用Sigma plot 14.0軟件進行統(tǒng)計分析和作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 金針菇菌絲體的生長曲線

如圖1所示，金針菇菌絲接種后，生物量從第1～6天呈線性上升趨勢，這是由于金針菇菌絲體在種子培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)7 d，因此轉(zhuǎn)接后幾乎沒有滯后期；第6～8天進入快速的對數(shù)增長階段，第8天以后進入平穩(wěn)階段。而金針菇發(fā)酵液中的殘?zhí)呛恳恢痹谙陆?，并在?天降至最低。由圖1可知，金針菇菌絲在轉(zhuǎn)接后第7天時生長最為旺盛，之后隨著碳源消耗殆盡，菌絲的生長進入穩(wěn)定期，因此選擇發(fā)酵至第7天的菌體進行之后的實驗。

圖1 金針菇菌體生長曲線及發(fā)酵液中殘?zhí)堑淖兓疐ig.1 Growth curve of F.velutipes mycelia and the change of residual sugar in fermentation broth

2.2 納米銀顆粒的合成

2.2.1 最大吸收波長及標準曲線

將FV-CFF與AgNO3溶液加熱反應(yīng)后出現(xiàn)明顯的棕褐色(納米銀特征顏色)，且溶液澄清。初步分析，F(xiàn)V-CFF具有一定的還原力，可以將Ag+還原為0價納米銀。此外，溶液中還具有可以起穩(wěn)定作用的大分子成分，因此生成的溶液并無單質(zhì)銀沉淀產(chǎn)生。配制不同濃度的AgNPs標準溶液，掃描最大吸收波長為415 nm，測定415 nm處納米銀標準曲線為y=6.884 9x+0.043 6，R2=0.999 4。

2.2.2 FV-CFF及AgNO3添加比例的確定

如圖2-a所示，在FV-CFF添加比例為5%～50%，合成的AgNPs濃度呈線性增加的趨勢，在FV-CFF添加總比例50%時，AgNPs濃度為0.31 mmol/L；此后AgNPs增加趨勢減緩。因此接下來的實驗中，選用FV-CFF添加總比例為50%。固定FV-CFF添加比例為50%，探討不同AgNO3添加濃度對AgNPs生成的影響，結(jié)果如圖2-b所示，隨反應(yīng)體系中AgNO3濃度升高，AgNPs濃度逐步上升，當反應(yīng)體系中AgNO3濃度達到0.9 mmol/L時，AgNPs產(chǎn)量達到0.30 mmol/L，之后AgNPs產(chǎn)量趨于穩(wěn)定，增長不顯著。因此，在后續(xù)實驗中，選用AgNO3終濃度0.9 mmol/L。

圖2 FV-CFF添加比例對AgNPs合成的影響(a)，AgNO3濃度對合成AgNPs的影響(b)Fig.2 Effect of FV-CFF addition ratio on AgNPs synthesis (a),the effect of AgNO3 concentration on AgNPs synthesis (b)

2.2.3 pH對FV-CFF合成納米銀的影響

如圖3-a所示，pH對FV-CFF合成AgNPs的效果影響顯著，在pH低于5時，合成能力較弱，且隨pH的增高，AgNPs增加幅度較小，而在pH 5～11，AgNPs的合成基本呈線性增加趨勢，在pH 11時達到最高，為0.58 mmol/L。在pH 11.0條件下，于100 ℃加熱，5～10 min內(nèi)AgNPs產(chǎn)量迅速升高，10 min后AgNPs產(chǎn)量增長減緩，20 min時AgNPs產(chǎn)量便已達到最大值，之后趨于穩(wěn)定(圖3-b)，但合成的納米銀溶液有較多黑色沉淀產(chǎn)生。

圖3 pH對FV-CFF合成AgNPs的影響(a)及FV-CFF在pH 11、100 ℃時合成AgNPs的動態(tài)曲線(b)Fig.3 Effect of pH on mycosynthesis of AgNPs by FV-CFF (a),dynamic changes of AgNPs formation in FV-CFF at pH 11,100 ℃ (b)

進一步優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，在pH 11時反應(yīng)體系的最佳添加量為：AgNO3濃度0.6 mmol/L，F(xiàn)V-CFF(pH 11)添加比例15%。

2.2.4 凍融前后FV-CFF合成納米銀的動力學生成曲線

根據(jù)2.2.2小節(jié)中確定的FV-CFF添加量及AgNO3濃度，測定初始pH下(即pH 7.22)AgNPs的動力學生成曲線，實驗結(jié)果如圖4-a所示。為了考察FV-CFF中成分對AgNO3還原效果的影響，將發(fā)酵液進行冷凍，融化后發(fā)現(xiàn)有絮狀物漂浮于液面，離心除去絮狀不溶物，取上清液依照上述實驗條件測定AgNPs的動力學生成曲線，實驗結(jié)果如圖4-b所示。

a-凍融前；b-凍融后圖4 凍融前后FV-CFF生成AgNPs的動力學曲線Fig.4 Kinetic curves of AgNPs produced by initial and thawed FV-CFF

由圖4可知，等溫熱處理過程中，凍融前后樣品中AgNPs含量均隨熱處理時間的延長而升高，其升高速率隨熱處理溫度的升高而加快。2組樣品中AgNPs的生成反應(yīng)，表觀上均遵循零級反應(yīng)動力學模型Ct=C0+k·t，根據(jù)動力學曲線擬合方程得出各曲線的參數(shù)如表1所示。

表1 凍融前后FV-CFF(pH 7.22)生成AgNPs的動力學回歸參數(shù)Table 1 Kinetic regression parameters of AgNPs produced by initial and thawed FV-CFF (pH 7.22)

2.2.5 凍融前后FV-CFF在pH 11時合成納米銀的動力學反應(yīng)

為考察pH 11時FV-CFF對AgNPs生成的影響，根據(jù)2.2.3小節(jié)實驗中確定的FV-CFF添加量及AgNO3濃度(即AgNO3濃度0.6 mmol/L，F(xiàn)V-CFF添加比例15%)，取凍融前后的FV-CFF調(diào)pH11后與AgNO3進行反應(yīng)，測定AgNPs的動力學生成曲線。如圖5所示，初始FV-CFF(pH 11)在50～90 ℃范圍內(nèi)合成AgNPs的反應(yīng)均遵循零級動力學模型，即Ct=C0+k·t，而100 ℃時產(chǎn)物呈對數(shù)增長趨勢。凍融除去絮狀不溶物后，AgNPs的生成反應(yīng)動力學則均遵循零級動力學模型。因此2組樣品的動力學曲線僅按照50～90 ℃的數(shù)據(jù)擬合方程，得出各曲線的參數(shù)如表2所示。

a-凍融前；b-凍融后圖5 凍融前后FV-CFF在pH 11生成AgNPs的動力學曲線Fig.5 Kinetic curves of AgNPs produced by initial and thawed FV-CFF at pH 11

表2 凍融前后FV-CFF在pH 11時生成AgNPs的動力學回歸參數(shù)Table 2 Kinetic regression parameters of AgNPs generated by initial and thawed FV-CFF (pH 11.0)

根據(jù)阿累尼烏斯方程k=kf·exp(-Ea/RT)，將上述4種不同反應(yīng)體系以1/Tvs lnk作圖，結(jié)果如圖6和表3所示，其中，C0是AgNPs的初始含量，Ct是AgNPs的含量，單位為mmol/L；T是熱力學溫度，單位為K；R是摩爾氣體常量，8.314472 J/(mol·K)；k為速率常數(shù)，單位為h-1；kf是頻率因子；Ea為活化能。以樣品I為例(表3)，AgNPs生成反應(yīng)的速率常數(shù)與熱處理溫度的對數(shù)關(guān)系式為lnk=-11 902(1/T)+31.362，其對應(yīng)的指數(shù)關(guān)系式為k=e31.362·exp(-11 902/T)=4.17×1013·exp(-98.96/RT)，符合阿累尼烏斯方程k=kf·exp(-Ea/RT)，其表觀頻率常數(shù)kf= 4.17×1013h-1，表觀活化能Ea=98.96 kJ/mol。

圖6 不同處理條件下FV-CFF生成AgNPs的阿累尼烏斯方程曲線圖Fig.6 The Arrhenius equation curve of AgNPs formation using different processed FV-CFF

結(jié)果表明，4個反應(yīng)體系都是零級反應(yīng)(表3)，此時，反應(yīng)物濃度不是影響化學反應(yīng)的決定因素。因此，雖然在pH提高到11時，降低了反應(yīng)物的濃度，但不會影響AgNPs的生成速度。由此可知，造成4個樣品中表觀速率常數(shù)和表觀活化能不同的因素，應(yīng)當與凍融前后除去的成分以及pH的變化有關(guān)。

樣品I比樣品II活化能低，說明凍融前初始FV-CFF更容易生成AgNPs。初步推斷，凍融后除去的絮狀不溶物中含有對AgNPs生成起重要作用的成分。而通過pH對AgNPs生成的影響發(fā)現(xiàn)，pH 11條件下生成AgNPs的產(chǎn)率最高，但是此時(樣品III)表觀活化能卻最高，為119.82 kJ/mol，說明pH的升高影響了FV-CFF中的還原成分，使其反應(yīng)難度升高，但反應(yīng)效率大大提升。而凍融后的樣品盡管離心除去了絮狀不溶物，但在pH 11(樣品IV)時的表觀活化能卻是最低的，僅為80.21 kJ/mol，說明pH的提高大大增加了FV-CFF中剩余組分的還原力，使反應(yīng)更容易發(fā)生。

表3 不同處理條件下FV-CFF反應(yīng)生成AgNPs的動力學參數(shù)Table 3 Kinetic parameters of AgNPs formation by CFF under different conditions

2.3 FV-CFF的成分分析及還原力測定

2.3.1 凍融前后FV-CFF的成分分析

通過對凍融前后的FV-CFF樣品進行成分分析可知(表4)，初始FV-CFF樣品(即樣品I)中總蛋白、總糖及可溶性固形物含量均高于凍融后除去不溶物的FV-CFF樣品(即樣品II)。樣品II中總蛋白和總糖含量降低明顯，分別減少了22.24%和11.56%，結(jié)合可溶性固形物的含量變化(降低37.74%)可知，凍融后除去的絮狀不溶物主要為蛋白質(zhì)和多糖等大分子組分，這可能是導致樣品II反應(yīng)生成AgNPs活化能升高的主要原因。由表4還可看出，樣品中還原糖含量較低，僅為4 μg/mL左右，且凍融對還原糖含量的影響不顯著。

表4 凍融前后FV-CFF樣品(pH 7.22)的成分分析Table 4 Composition analysis of initial and thawed FV-CFF (pH 7.22)

2.3.2 凍融及pH對FV-CFF還原力的影響

凍融及pH對FV-CFF還原力的影響如圖7所示，樣品I和樣品II的還原力分別為0.075和0.073，說明凍融實驗雖然除去了較多蛋白和多糖等大分子可溶性固形物(表4)，但起還原作用的主要成分并未受到顯著影響，因此凍融前后FV-CFF樣品(pH 7.22)的還原力幾乎沒有變化。但是，pH的升高則顯著提升了FV-CFF樣品的總還原力，在pH 11時樣品III和樣品IV的還原力分別提升至0.20和0.18，說明堿性pH顯著激活了FV-CFF中起還原作用的成分，使其還原力大幅提升。

圖7 不同處理條件下FV-CFF的總還原力Fig.7 Total reducing power of FV-CFF under different conditions注：Vc作為陽性對照，質(zhì)量濃度為20 mg/L

2.4 產(chǎn)物AgNPs的表征

2.4.1 不同條件下生成AgNPs的UV-Vis光譜特征

由圖8可知，凍融實驗雖然會對FV-CFF生成AgNPs的能力產(chǎn)生顯著影響，但不會改變產(chǎn)物的吸收波長，而pH的變化則可明顯降低產(chǎn)物AgNPs的最大吸收波長。pH 11時，AgNPs的最大吸收波長由pH 7.22時的442 nm降低為411 nm，接近標品的UV-Vis吸收。

圖8 不同處理條件下 FV-CFF生成AgNPs的紫外-可見吸收光譜圖Fig.8 The UV-Vis absorption of AgNPs formation under different processed FV-CFF

2.4.2 產(chǎn)物AgNPs的形貌

采用TEM觀測不同條件下FV-CFF與AgNO3反應(yīng)生成AgNPs的形貌特征，結(jié)果如圖9所示。通過ImageJ軟件分析圖中顆粒尺寸可知，樣品I和樣品II反應(yīng)產(chǎn)物的粒徑范圍均在2.2～10.5 nm，平均粒徑分別為5.5和5.4 nm。樣品III反應(yīng)產(chǎn)物的平均粒徑最大，為5.6 nm，但粒徑范圍相對較小，為2.9～9.4 nm；樣品IV反應(yīng)產(chǎn)物的平均粒徑最小，為4.8 nm，但分布范圍最廣(1.5～10.1 nm)。此外，由圖9可知，不同F(xiàn)V-CFF樣品反應(yīng)生成的AgNPs顆粒雖然多數(shù)為球形，但也有部分不規(guī)則的橢球形和多邊形存在。這些納米顆粒多數(shù)以少量聚集的狀態(tài)存在，而且聚集顆粒的邊緣可觀測到明顯的淺灰色暗影，推測是FV-CFF中的大分子成分起到了穩(wěn)定劑的作用，使AgNPs在溶液中以聚集態(tài)存在。

圖9 FV-CFF在不同條件下生成AgNPs的TEM圖Fig.9 TEM images of AgNPs formation under different conditions in FV-CFF

2.4.3 樣品及產(chǎn)物的粒度分布

產(chǎn)物溶液的粒徑分析結(jié)果(表5)與TEM結(jié)果差異較大，這是由于FV-CFF中的大分子成分在溶液狀態(tài)具有良好的分散和水化作用，使檢測結(jié)果偏大。此外，由TEM分析可知，由于FV-CFF中大分子的包裹和穩(wěn)定作用，AgNPs存在顆粒聚集的情況，在溶液狀態(tài)下易被作為一個整體的顆粒測定，因此最終測定的粒徑均大于TEM中觀測到的單個納米顆粒的粒徑。

反應(yīng)前不同F(xiàn)V-CFF溶液的平均粒徑顯著高于相應(yīng)樣品反應(yīng)后的結(jié)果，說明FV-CFF在與AgNO3加熱反應(yīng)的過程中不僅生成了AgNPs，還使原來溶液中較大顆粒的成分緊密地包裹在銀納米顆粒的周圍，起到了穩(wěn)定作用，因此所生成的溶液無聚沉現(xiàn)象。反應(yīng)后所生成的AgNPs溶液的平均粒徑隨pH升高而顯著降低，而凍融實驗則對產(chǎn)物平均粒徑的影響不顯著，說明堿性環(huán)境能降低FV-CFF中大分子成分之間的聚集，使溶液體系中的顆粒尺寸更低，也更為穩(wěn)定。pH 11時FV-CFF反應(yīng)生成AgNPs的Zeta電位值均高于pH 7.22時，顆粒之間存在更強的靜電排斥[7]，表明pH 11時制備的AgNPs具有更好的穩(wěn)定性。此外，反應(yīng)后生成的AgNPs溶液的多分散系數(shù)PDI均大于0.4，說明AgNPs溶液雖然具有良好的穩(wěn)定性，但屬于多分散體系[16]，這與TEM分析結(jié)果(圖9)一致。

表5 FV-CFF在不同處理條件下反應(yīng)前后的粒度分布Table 5 Size distribution of different processed FV-CFF samples and the resulted AgNPs

3 結(jié)論

本研究選用金針菇菌絲體作為研究對象，采用液態(tài)發(fā)酵的方式，探究AgNPs的合成效果及影響因素。結(jié)果顯示，F(xiàn)V-CFF對AgNO3具有明顯的還原效果，可生成棕褐色AgNPs穩(wěn)定溶液。此外，pH對FV-CFF生成AgNPs具有顯著的影響，在pH 5～11范圍內(nèi)，AgNPs的產(chǎn)量基本呈線性增加趨勢。通過等溫動力學實驗發(fā)現(xiàn)，較高的pH對無菌水發(fā)酵液生成AgNPs具有顯著的提高效果，而凍融后除去的絮狀不溶物也對AgNPs的合成具有一定貢獻。本實驗合成AgNPs所用的還原劑及穩(wěn)定劑為金針菇的無細胞濾液(FV-CFF)，主要成分除蛋白質(zhì)和碳水化合物外還含有許多未知組分，可采用可溶性固形物含量進行定量。凍融前后的成分分析及還原力測定結(jié)果顯示，凍融后除去的絮狀不溶物對還原力的影響有限。而pH升高至11時，還原力則大幅提升，使所生成的AgNPs具有較低的紫外可見吸收波長(411 nm)和較小的溶液粒徑(～35 nm)，而凍融實驗對這兩方面的影響較小。本研究合成AgNPs的方式簡單、安全、環(huán)保，且具有反應(yīng)條件溫和、易于實現(xiàn)的優(yōu)勢，對于進一步解析金針菇發(fā)酵產(chǎn)物合成穩(wěn)定AgNPs的機制具有重要的指導作用。然而，金針菇無細胞濾液中成分較為復雜，當前研究雖然發(fā)現(xiàn)其具有良好的AgNPs合成和穩(wěn)定效果，但仍未能確認其中起還原作用的關(guān)鍵物質(zhì)，今后需進一步分析并確認該成分，并解析其還原力受pH影響的機制。