陳沈梁,張越愷,李晨欣,沈詩瑩,吳玲彩,趙偉睿,胡 升,梅樂和,2

(1.浙大寧波理工學院 生物與化學工程學院,浙江 寧波 315100;2.浙江大學 化學工程與生物工程學院,浙江 杭州 310027)

高尿酸血癥(Hyperuricemia,HUA)是因嘌呤代謝或排泄失常而導致血尿酸含量顯著超過正常范圍的慢性臨床綜合征[1]。HUA不僅是痛風病癥發(fā)生的生化基礎,而且也與糖尿病、心腦血管疾病及尿酸鹽腎病等慢性腎病的發(fā)生密切相關,嚴重威脅人類健康[2]。流行病學研究表明:隨著我國人民物質生活水平的提高以及生活方式的改變,我國HUA發(fā)病率劇增,且呈年輕化趨勢[3]。目前,HUA的防治主要采用藥物控制和限制人體嘌呤物質的攝入量。HUA治療藥物雖然有效但副作用大,長期使用會造成嚴重的不良反應。對于飲食限制來說,由于高嘌呤食物眾多,嚴格限制飲食很難做到營養(yǎng)素攝入平衡[4]。此外,由于鮮味物質也屬于嘌呤類物質[5],因此高尿酸血癥患者也必須限制雞精等鮮味劑的攝入,這些無疑會使患者的生活質量受到極大影響,患者往往難以堅持。因此,尋找和開發(fā)新型高效、副作用低或無副作用的HUA治療與預防方法具有重要現(xiàn)實意義。

隨著對乳酸菌益生作用的關注,日本科學家發(fā)現(xiàn)具有高效嘌呤核苷分解能力的乳酸菌可以在腸道有效吸收并降解食物中的嘌呤核苷,從而降低人體對食物中嘌呤核苷的吸收量,起到控制嘌呤核苷攝入、降低血尿酸含量的目的[6]。應用乳酸菌對HUA進行防治可以避免或減輕傳統(tǒng)的嚴格飲食限制對患者生活質量的影響[7]。目前,日本明治株式會社[8]、大冢制藥株式會社[8]已相繼篩選到多株具有高效嘌呤核苷降解能力的乳酸菌,并利用動物實驗驗證其有效性,其中明治株式會社LactobacillusgasseriPA-3產品已進入商業(yè)化應用,而我國在該領域研究尚在起步階段[9]。本研究以傳統(tǒng)發(fā)酵食品泡菜為原料,對其中具有高效嘌呤核苷降解能力的乳酸菌進行篩選和鑒定,并對其抗生素敏感性、酸性耐受能力、膽鹽耐受能力以及人工消化液耐受能力等生物學特性進行考察[10],以期為研發(fā)我國自主知識產權的HUA輔助治療生物菌劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和主要試劑

寧波市售泡菜;MRS肉湯、藥物藥敏紙片,杭州微生物試劑有限公司;乳酸菌微量生化鑒定條,青島海博生物技術有限公司;溶菌酶、肌苷、鳥苷,生工生物工程(上海)股份有限公司;胃蛋白酶(USP級,1∶3 000)、胰蛋白酶(BR,1∶250)、牛膽粉(40%膽酸),上海源葉生物科技有限公司;細菌基因組提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司;快速高保真DNA聚合酶,北京全式金生物技術有限公司。

1.2 嘌呤核苷降解菌的篩選

篩選方法參考Tsuboi等[7,11]的方法進行,略有改動。利用MRS固體平板分離得到泡菜中的單菌落,將獲得的單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中,于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后,獲得種子培養(yǎng)基。離心收集適量菌體,經(jīng)0.9% NaCl徹底重懸清洗后,向其中加入750 μL反應液(含有1.26 mmol/L肌苷、1.26 mmol/L鳥苷的0.1 mol/L K3PO4溶液(pH 7.0)),于金屬浴37 ℃,800 r/min反應1 h。反應結束后,100 ℃處理5 min終止反應。離心取上清,測定剩余肌苷、鳥苷降解率[10]。肌苷、鳥苷降解率計算公式為

1.3 肌苷、鳥苷的HPLC檢測方法

采用高效液相色譜法(HPLC)[12]測定肌苷和鳥苷的降解率。色譜條件:反相色譜柱,Hypersil ODS2 C18(4.6 mm×250 mm);流動相V(0.01 mol/L KH2PO4)∶V(色譜甲醇)=95∶5;流速1 mL/min,測定波長260 nm,柱溫30 ℃。

1.4 菌株的鑒定

采用生化反應和16S rDNA序列比對兩種方法進行菌種鑒定。糖發(fā)酵反應按乳酸菌微量生化鑒定條說明書進行。16S rRNA同源比對鑒定:提取乳酸菌的基因組,利用16S rRNA通用引物(16sF:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG,16sR:GGCTACCTTGTTACGACTT)通過PCR反應擴增菌種的16S rDNA基因片段。PCR擴增程序為:95 ℃,5 min;(95 ℃,1 min;50 ℃,30 s;72 ℃,60 s)×32;72 ℃,5 min;冷卻至4 ℃保存。PCR產物經(jīng)驗證后送于生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序結果于GenBank中進行BLAST比對分析[13],并利用MEGA軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.5 抗生素敏感性試驗

利用紙片瓊脂擴散法[14-15],測定菌種對不同抗生素的敏感程度。將藥物敏感紙片均勻分布在含有一定量種子培養(yǎng)基的MRS固體平板上,37 ℃培養(yǎng)48 h,測量抑菌圈直徑。

1.6 菌株對酸耐受性、膽鹽耐受性的測定

1.6.1 酸耐受性測定

將種子培養(yǎng)基置于pH分別為6.2(對照),2,3,4的MRS液體培養(yǎng)基并混勻,37 ℃下處理0,1,2,4 h后進行平板計數(shù)[16-17]。

1.6.2 膽鹽耐受性測定

以2%的接種量將種子培養(yǎng)基分別接種到牛膽粉質量分數(shù)為0(對照)和0.3%的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃下靜置培養(yǎng),分別在0,4,12,24 h涂布,測定活菌數(shù)[14]。

1.7 菌株人工消化液耐受性及飽腹人工消化液下嘌呤降解情況

分別考察菌株在空腹、飽腹狀態(tài)下的人工消化液的耐受能力。人工胃液:3.33%胃蛋白酶;人工腸液(g/L):NaHCO312.5,胰酶0.9,膽鹽3.0,pH 6.8;營養(yǎng)液(g/L):阿拉伯半乳糖1,膠質2,木聚糖1,土豆淀粉3,蛋白胨1,酵母粉3,黏蛋白4,L-半胱氨酸0.5,葡萄糖0.4。空腹狀態(tài):人工胃液(HCl調整pH=2)和人工腸液。飽腹狀態(tài):用營養(yǎng)液配制的人工胃液(pH=3)和人工腸液。耐受性的測定:將種子培養(yǎng)基重懸于人工胃液中,37 ℃,800 r/min處理2 h,離心收集菌體,重懸于的人工腸液中,37 ℃,800 r/min處理4 h;從重懸于人工胃液開始,每隔2 h進行平板菌落計數(shù)。

測定菌株在模擬飽腹人工腸液環(huán)境下嘌呤降解能力。離心收集適量菌體,用0.9% NaCl充分清洗,將菌體分別重懸于750 μL肌苷和鳥苷濃度都為1.26 mmol/L的飽腹人工腸液,37 ℃,800 r/min反應1 h后測定嘌呤核苷降解率。

2 結果與分析

2.1 高效降解嘌呤核苷乳酸菌的篩選

從寧波市售泡菜中分離得到56株乳酸菌,采用高效液相色譜法測定其嘌呤核苷降解能力,結果如表1所示,所有菌株雖然都有一定程度的嘌呤核苷降解能力,但降解能力差異較大,其中4號和5號菌株對肌苷、鳥苷的降解能力最高,超過了95%,與日本研究者Kaneko等[18]篩選獲得的HUA輔助治療菌株降解能力(核苷嘌呤降解效果均接近100%)相似。此外,所有菌株自身對肌苷、鳥苷的降解能力趨于一致,這與Kaneko等[18]的研究結果也相一致。

表1 篩選菌株嘌呤降解率記錄表

2.2 菌株的鑒定

對4號和5號菌株進行菌種鑒定,菌株糖利用結果如表2所示,與《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第八版)進行比對,發(fā)現(xiàn)4,5號菌株的糖利用特性完全一致,且與短乳桿菌(Laclobacillusbrevis)基本符合。采用PCR技術擴增4號和5號菌株的16S rRNA,并進行序列測定,測序結果如圖1所示。將測序結果在NCBI中進行BLAST分析,發(fā)現(xiàn)兩菌株的16S rRNA序列比對完全一致,且都與Lactobacillusbrevisb4的同源性為99%。結合糖利用結果,確定4號菌和5號菌為同一來源菌株,選取4號菌株進行后續(xù)研究。從NCBI數(shù)據(jù)庫收集不同種屬菌株的16S rRNA序列,用MEGA軟件,進行進化遺傳、系統(tǒng)發(fā)育分析(圖2),可知4號菌株與L.brevis位于同一個簇群。因此,確定4號菌株屬于短乳桿菌。

表2 菌株糖類利用特性表

圖1 strain 4的16S rDNA測序結果

圖2 菌體16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株的抗生素敏感性

鑒定乳酸菌的藥敏譜,是乳酸菌安全性評估與使用的必要部分[19]。從表3可知:4號菌株對哌拉西林、大環(huán)內酯類抗生素如紅霉素和頭孢哌酮抗生素的敏感程度較高,尤其對哌拉西林最為敏感;而在含有苯唑西林紙片的培養(yǎng)基上無抑菌圈,在含有青霉素的培養(yǎng)基上抑菌圈的直徑較小,可知菌株對苯唑西林、青霉素的敏感程度較低或不敏感。

表3 4號菌株抗生素敏感性結果表

2.4 菌體的酸、膽鹽耐受性

良好的酸耐受性、膽鹽耐受性是乳酸菌能夠在人體內發(fā)揮生理功能的前提,因此有必要對篩選菌株的酸耐受性、膽鹽耐受性進行考察。4號菌株在不同的酸性條件下的存活狀況如圖3所示,pH=2的酸性環(huán)境對該菌的存活率影響較大,但在pH為3,4的條件下,該菌的存活數(shù)在4 h內始終保持108cfu/mL以上。人體胃酸pH值在空腹或食用酸性食物時,一般為1.5～2,而食用堿性食物時,pH可達4～5,一般通常情況下pH=3[20-21]。以上結果,說明4號菌株具備了耐受人體通常情況下胃酸環(huán)境的能力。

人體正常膽汁的質量分數(shù)為0.3%。4號菌株在膽鹽質量分數(shù)為0.3%的MRS培養(yǎng)基、37 ℃條件下處理4,12,24 h后,活菌數(shù)仍可達到108cfu/mL及以上且保持相對穩(wěn)定,實驗結果如圖4所示,說明該菌具備耐受人體正常膽汁濃度的能力。

圖4 4號菌株耐膽鹽實驗結果

2.6 菌株人工消化液耐受性及飽腹人工消化液下嘌呤降解情況

乳酸菌能順利到達腸道并在腸道中存活是其發(fā)揮益生功能的關鍵,通過模擬人體的消化道環(huán)境,可以反映菌種在經(jīng)過人體胃腸道消化后的存活狀況,實驗結果如圖5所示。結果表明:在空腹狀態(tài)下,4號菌株經(jīng)過胃后,由于受到較低pH的脅迫,活菌數(shù)下降明顯;而在飽腹狀態(tài)下,經(jīng)人工胃液和人工腸液的消化后,活菌數(shù)基本不受影響,表明該菌種經(jīng)人體飽腹狀態(tài)胃腸道消化后,依然能保持較好的存活能力。因此,4號菌可在飯后服用,以便其能更好地發(fā)揮生理功能。實驗證明:該菌種在飽腹人工腸液條件下嘌呤核苷基本降解完全,降解率均達96%以上,具備在人體腸道飽腹狀態(tài)下降解食物中嘌呤核苷的能力。

圖5 4號菌株人工消化液耐受實驗結果

3 結 論

應用具有高效嘌呤核苷降解能力的乳酸菌對高尿酸血癥(HUA)進行輔助治療和預防,可以在一定程度上或完全解除HUA患者在飲食上的嚴格限制,提高其生活質量。本研究從泡菜樣品中篩選得到的一株具有高效降解嘌呤核苷能力的菌株,經(jīng)糖酵解實驗和16S rRNA序列比對,確定4號菌株為短乳桿菌,該菌株對嘌呤核苷降解能力與日本科學家報道的最高活性菌株的降解能力基本一致;該菌對哌拉西林、紅霉素和頭孢哌酮等抗生素有高敏感性,且具有良好的耐酸、耐膽鹽和耐受飽腹人工胃腸液的能力,而且在飽腹的人工腸液中其嘌呤核苷降解能力不受影響。因此,該菌是開發(fā)用于輔助治療和預防HUA微生態(tài)菌劑的備選優(yōu)良菌株。

致謝:在此特別鳴謝徐晨航、鄒培波參與實驗。