2黃贊松2

(1. 右江民族醫(yī)學院研究生學院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西肝膽疾病臨床醫(yī)學研究中心，廣西 百色 533000)

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌，也是世界范圍內最常見的癌癥相關死亡原因之一[1]。肝癌的主要治療方法包括肝移植、手術切除和化療，然而，肝癌易發(fā)生轉移，多數患者確診時已錯過手術治療的時機。即使是分子靶向治療，一線化療藥應答率也很低[1]，而化療具有化療耐藥性[2]，而部分肝癌患者甚至術后亦可能發(fā)生轉移，因此，HCC的治療已成為目前全世界面臨的難題。研究表明上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)與惡性腫瘤的轉移與侵襲密切相關[3]，還有研究表明[4]，miR-204在腫瘤細胞EMT過程中發(fā)揮了重要的作用。因此，探究能夠有效抑制EMT過程的藥物是控制細胞侵襲和轉移的前提?？鄥⑺?(oxymatrine，OM)，是傳統(tǒng)中藥苦參的主要生物活性成分，具有抗炎、抗過敏、抗纖維化、免疫調節(jié)及抗腫瘤等多種藥理活性，我們實驗組前期實驗證明，其在抑制HCC的EMT作用中有明顯作用[5]，然而OM抑制肝癌細胞EMT作用的機制尚未完全明確，因此本文將探究OM抑制肝癌細胞EMT作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人肝癌HepG2細胞由右江民族醫(yī)學院基礎醫(yī)學院廖長秀博士惠贈。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；OM購自鄭州卓峰制藥有限公司(批號：國藥準字H20033744，規(guī)格2ml：0.2g)；CCK8購自美國MCE公司；6孔板、96孔板購于美國Thermo公司，25 cm2細胞培養(yǎng)瓶購于美國Corning公司，上皮轉化因子-β1(TGF-β1)購于美國PEPROTECH公司，總RNA提取試劑盒RNAiso Plus(Code No.9108)、逆轉錄試劑盒miR-X TMII(Code No.RR820A)、氯仿、異丙醇、國產分析純75%的乙醇，其中用0.1%DEPC水配制75%乙醇，將其放入4℃冰箱保存；提取RNA、逆轉錄及擴增過程中所用的槍頭、EP 管等均購自Axygen公司，以防RNA降解使用前均去RNA酶處理。兔抗E-Cadherin、Vimentin、GAPDH購自美國Cell Signal Technology公司，辣根過氧化物酶標記羊抗兔免疫球蛋白G購自Affinity公司；高效RIPA裂解液、蛋白標準品、蛋白marker、BCA法蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、P-ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自雅酶公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天公司。

1.2 人肝癌細胞HepG2 EMT模型建立與實驗分組

1.2.1 HepG2細胞株的培養(yǎng) 人肝癌HepG2細胞株需在含10%胎牛血清的高糖DMEM細胞培養(yǎng)液中，并在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細胞貼壁生長于25 cm2corning培養(yǎng)瓶中，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 人肝癌細胞HepG2 EMT模型建立 收集對數期HepG2細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板(100微升/孔，每孔含2×105個細胞)，根據文獻[6]的方法構建人肝癌細胞EMT模型，在細胞培養(yǎng)板中加入TGF-β1使其終濃度為10 ng/ml，以未用TGF-β1培養(yǎng)的細胞作為對照組，將細胞培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出細胞培養(yǎng)板，在光學顯微鏡下觀察對照組和模型組細胞的形態(tài)變化。

1.2.3 實驗分組 處理實驗分為6個組，空白組、模型組、OM 1 mg/ml組、OM 2 mg/ml組、OM 4 mg/ml組、OM 8 mg/ml組，每組細胞均在6孔板中培養(yǎng)48 h。

1.3 實驗檢測

1.3.1 CCK8檢測各組OM對已發(fā)生EMT作用的HepG2細胞的增殖抑制情況 取對數生長期細胞，胰酶消化成單細胞懸液，調整至合適的細胞密度，接種至96孔板，使每孔含1×104個細胞，實驗分為：空白組、模型組、OM 1 mg/ml組、OM 2 mg/ml組、OM 4 mg/ml組，OM 8 mg/ml組。次日，在模型組、OM 1 mg/ml組、OM 2 mg/ml組、OM 4 mg/ml組、OM 8 mg/ml組中各加入濃度為10 ng/ml的TGF-β1，對照組加等量培養(yǎng)基，作用24 h。第3天，OM 1 mg/ml組、OM 2 mg/ml組、OM 4 mg/ml組，OM 8 mg/ml組各加入含OM濃度為1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml的完全培養(yǎng)基，作用12 h、24 h、48 h、72 h后，于450 nm波長檢測各組吸光度值(A值)，實驗重復3次取均值。抑制率計算公式：抑制率=[1-(實驗組A值-空白對照組A值)/(陰性對照組A值-空白對照組A值)]×100%。

1.3.2 實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 檢測HepG2細胞中miR-204表達水平 將對數期HepG2細胞接種于6孔板中，除空白組外，OM 1 mg/ml組、OM 2 mg/ml組、OM 4 mg/ml組均使用TGF-β1誘導24 h，再使用1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml OM作用48 h。采用RNAiso Plus提取HepG2細胞總RNA，并用紫外分光光度計檢測總RNA濃度；隨后采用Takara公司5×PrimeScript RT Master Mix反轉錄試劑盒進行反轉錄獲得總cDNA，以Takara公司2×SYBR Premix Ex Taq II試劑盒實時定量PCR檢測上述不同組細胞樣本中miR-204，miR-204引物由上海寶生物公司合成，引物序列為：TCCCTTTGTCATCCTATGCCTAA。反應體系：ddH2O 9.5 μl，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ12.5 μl，上下游引物各0.5 μl，cDNA模板2 μl。PCR反應條件為：95℃ 30 s， 95℃ 5 s，60℃ 30 s，共擴增40個循環(huán)。溶解曲線分析：95℃ 5 s，60℃ 60 s，95℃ 30 s。U6作為miRNA表達的內參照，使用2-△△法分析結果。實驗重復3次取均值。

1.3.3 劃痕實驗檢測HepG2細胞遷移能力 將對數期HepG2細胞接種于6孔板中，除空白組外，OM 1 mg/ml組、OM 2 mg/ml組、OM 4 mg/ml組均使用TGF-β1誘導24 h，再使用1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml OM作用48 h。將各組HepG2細胞，制備單細胞懸液并調整細胞數目(1×106/ml)，接種至96孔板，細胞培養(yǎng)板每孔加入1 ml單細胞懸液，培養(yǎng)24 h，細胞密度達80%時，用滅菌過的10μl槍頭劃線，用PBS洗去劃痕中的細胞，加入空白培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，計算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率計算：愈合率=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。實驗重復3次取均值。

1.3.4 Western Blot檢測HepG2細胞中鈣黏附蛋白-E(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表達情況 將對數期HepG2細胞接種于6孔板中，除空白組外，OM 1 mg/ml組、OM 2 mg/ml組、OM 4 mg/ml組均使用TGF-β1誘導24 h，再使用1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml OM作用48 h。經OM作用48 h后，提取各組總蛋白，BCA法檢測各組總蛋白濃度，100℃加熱變性，取30 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳反應，濕轉法將蛋白質轉移至PVDF膜，轉膜時間根據各蛋白分子量設定，60～150 min不等，加入無蛋白快速封閉液于室溫封閉10 min，洗膜3次，每次5 min，然后分別加入相應的一抗，4℃孵育過夜，TBST洗去膜上未結合的一抗，10分/次，洗3次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G，室溫孵育2 h，TBST 洗去未結合的二抗，10分/次，共洗3次，之后加入ECL發(fā)光液進行曝光顯影，使用Image J軟件分析各條帶灰度值，計算各蛋白表達量(目的蛋白條帶吸光度值/內參照條帶吸光度值)。實驗重復3次取均值。

2 結果

2.1 人肝癌HepG2細胞EMT模型建立 從圖1可以看出，對照組人肝癌細胞HepG2多為抱團生長，細胞排列緊密，經TGF-β1 誘導后其形態(tài)發(fā)生變化； 模型組人肝癌細胞HepG2呈現(xiàn)梭形和紡錘形，且細胞間隙變大、排列松散。表明人肝癌細胞HepG2 EMT模型構建成功。

注：A：對照組；B：模型組。

2.2 CCK8實驗檢測OM對已發(fā)生EMT作用的人肝癌細胞HepG2的影響 圖2結果顯示，OM對已發(fā)生EMT作用的HepG2細胞增殖呈抑制作用，OM濃度分別為1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml，隨著OM濃度的增加，其對已發(fā)生EMT作用的人肝癌細胞HepG2的增殖抑制率增加，且組間抑制率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。由于OM濃度為8 mg/ml時肝癌細胞存活較少，無法進行后續(xù)實驗，故后面的實驗將去掉OM 8 mg/ml組。

圖2 OM對已發(fā)生EMT作用的人肝癌細胞HepG2抑制率的比較 (n=3)

2.3 qRT-PCR檢測人肝癌細胞 HepG2中miR-204表達水平 圖3結果顯示，模型組和OM組HepG2細胞中miR-204表達水平高于空白組(P<0.05)；與模型組相比，OM 1 mg/ml組、OM 2 mg/ml組、OM 4mg/ml組HepG2細胞中miR-204表達水平增高(P<0.05)。

注：與空白組比較，a：P<0.05；與模型組比較，b：P<0.05。

2.4 劃痕實驗檢測人肝癌細胞HepG2遷移情況 圖4結果顯示，模型組HepG2細胞遷移能力高于空白組(P<0.05)；與模型組相比，OM 4 mg/ml組HepG2細胞遷移能力降低(P<0.05)。

注：A：對照組；B：模型組；C：OM 1mg/ml組；D：OM 2mg/ml組；E：OM 4mg/ml組。

2.5 Western Blot 檢測HepG2細胞中E-cadherin、Vimentin表達情況 圖5結果顯示，模型組HepG2細胞中E-cadherin 表達水平低于空白組(P<0.05)，而Vimentin表達水平升高(P<0.05)；OM 1 mg/ml組、OM 2 mg/ml組、OM 4 mg/ml組HepG2細胞中E-cadherin 表達水平高于模型組(P<0.05)，而Vimentin表達水平降低(P<0.05)。

2.6 OM作用48 h后，HepG2細胞中miR-204的表達量與其增殖抑制率的相關性 經Spearman分析顯示，OM作用48 h后，HepG2細胞中miR-204的表達量與其增殖抑制率呈正相關(r=0.965，P<0.05)。

2.7 OM作用48 h后，HepG2細胞中miR-204的表達量與E-cadherin、Vimentin表達量的相關性 經Spearman分析顯示，OM作用48h后，HepG2細胞中miR-204的表達量與其E-cadherin的表達呈正相關(r=0.767，P<0.05)，miR-204的表達量與其Vimentin的表達呈負相關(r=-0.765，P<0.05)。

圖5 HepG2細胞中 E-cadherin、Vimentin相對表達量 (n=3)

3 討論

我們的實驗發(fā)現(xiàn)在建立EMT模型的基礎上，使用不同濃度的OM處理HepG2 EMT模型，OM可抑制HepG2 EMT模型的增殖并可以減弱已發(fā)生EMT的HepG2細胞的的遷移能力；進一步的實驗發(fā)現(xiàn)OM可以上調HepG2細胞中miR-204表達水平、提高HepG2細胞中E-cadherin 表達水平和下調Vimentin表達水平。

肝癌是最常見的消化道腫瘤，在中國，肝癌在癌癥相關死亡率中排名第二[7]。肝癌易轉移的特性給肝癌的治療帶來巨大的困難。EMT是指上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞轉化為更具遷移和侵襲能力的間質細胞的生物過程。有研究表明，EMT在原發(fā)性腫瘤的侵襲和轉移過程中發(fā)揮了重要的作用[8-9]，且EMT 與肝癌細胞轉移密切相關[10-12]，因而，抑制肝癌細胞的EMT過程對于肝癌的治療和提高患者的生存率具有重要的意義。OM是傳統(tǒng)中藥苦參的主要生物活性成分，具有抗炎、抗過敏、抗纖維化、免疫調節(jié)及抗腫瘤等多種藥理活性。近年來有關中西藥治聯(lián)合療肝癌的研究取得較大進展，OM也成為臨床實驗研究熱點之一。研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿具有抑制腫瘤細胞增殖[13]、誘導腫瘤細胞分化凋亡[14]、抑制腫瘤細胞黏性與浸潤轉移以及增強化療藥的作用[15]。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，OM可抑制人肝HepG2細胞增殖，促進細胞凋亡[14]。在進一步研究中證明，OM可通過削弱人肝癌HepG2細胞的EMT作用，進而逆轉肝癌細胞多藥耐藥[5]，證明OM可以削弱肝癌細胞的EMT作用，但其作用的分子機制尚未完全明確。

本研究采用TGF-β1誘導人肝癌細胞HepG2后，模型組細胞呈現(xiàn)梭形和紡錘形，且細胞間隙變大、排列松散，表明人肝癌細胞EMT模型構建成功；在建立EMT模型的基礎上，使用不同濃度的OM處理HepG2 EMT模型，發(fā)現(xiàn)OM可抑制HepG2 EMT模型的增殖，且呈現(xiàn)劑量效應。除此之外，為了進一步了解OM作用于已發(fā)生EMT的HepG2細胞后，其遷移能力的變化，我們做了劃痕檢測，發(fā)現(xiàn)模型組的細胞遷移能力高于空白組，而OM 1 mg/ml組、OM 2 mg/ml組、OM 4 mg/ml組HepG2細胞遷移能力低于模型組，且遷移能力隨著OM濃度的升高呈降低趨勢，結果表明，OM可以減弱已發(fā)生EMT的HepG2細胞的遷移能力。而為了在分子水平上進一步確認OM組的HepG2細胞是否發(fā)生EMT過程的減弱，本實驗對E-cadherin、Vimentin這兩個上皮間質轉化的標志性蛋白進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)OM組HepG2細胞中E-cadherin 表達水平高于模型組，Vimentin表達水平低于模型組，表明OM能夠逆轉人肝癌細胞HepG2 EMT過程，且其作用與濃度呈正比。

文獻報道[16-21]，miR-204在其他腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著抑癌因子的角色，且其表達的變化可影響腫瘤細胞EMT作用。有研究發(fā)現(xiàn)[22]，miR-204參與肝癌EMT過程，與肝癌的侵襲和遷移密切相關，為明確miR-204在肝癌中與HepG2細胞的增殖以及EMT過程的關系，我們使用qRT-PCR對miR-204進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，OM作用48 h后，HepG2細胞中的miR-204表達量增高，且miR-204的表達量隨OM濃度的增高而增高，且miR-204的表達量與HepG2細胞增殖抑制率呈正相關，miR-204的表達量與HepG2細胞中E-cadherin的表達呈正相關，miR-204的表達量與HepG2細胞中Vimentin的表達呈負相關，隨著miR-204的表達量的增高，HepG2細胞的EMT作用呈削弱趨勢，推測OM可上調HepG2細胞中miR-204的表達，并且OM可通過上調miR-204表達，減弱HepG2細胞的EMT作用，也可通過上調miR-204表達進而抑制HepG2細胞的增殖。

綜上所述，我們的初步研究發(fā)現(xiàn)OM可上調HepG2細胞中miR-204表達，進而抑制TGF-β1誘導的人肝癌細胞HepG2的增殖、遷移及削弱其 EMT 過程，其實驗發(fā)現(xiàn)為OM治療HCC提供了新的實驗依據。