趙明德

(青海民族大學(xué) 生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院,青海 西寧 810007)

胡蘿卜(學(xué)名：DaucuscarotaL.var.sativa Hoffm.)，又稱紅蘿卜或甘荀，為野胡蘿卜(學(xué)名：DaucuscarotaL.var.carota)的變種，本變種與原變種區(qū)別在于根肉質(zhì)、長圓錐形、粗肥、呈紅色或黃色.胡蘿卜每100g鮮重含1.67～12.1mg胡蘿卜素，含量高于番茄的5～7倍，在以胡蘿卜為原料得到的產(chǎn)品中約含有60%的類胡蘿卜素，其中β-胡蘿卜素為89.9%[1].我國北疆胡蘿卜中類胡蘿卜素含量高達(dá)10～45mg/100g[2].另外我國自行培育的93-8胡蘿卜品種β-胡蘿卜素達(dá)15～18mg/100g[3]，均有很高的開發(fā)價(jià)值.高等植物如胡蘿卜、番茄、紫(白)蘇、沙棘、火棘、西瓜、玉米等植物中也富含類胡蘿卜素[4-7].類胡蘿卜素還能通過微生物發(fā)酵獲得[5-11].目前，中科院武漢病毒所、江蘇微生物研究所、上海工業(yè)微生物所和上?；ぱ芯吭旱陌l(fā)酵法生產(chǎn)β-胡蘿卜素的技術(shù)已經(jīng)成熟，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[12].類胡蘿卜素是食品、醫(yī)藥、飼料行業(yè)常用的一類色素，其中β-胡蘿卜素、玉米黃素、辣椒紅、辣椒黃、梔子黃等已被國家批準(zhǔn)為食品添加劑[13-15].目前，大部分企業(yè)使用的β-胡蘿卜素多數(shù)是化學(xué)合成產(chǎn)品[16].但隨著醫(yī)學(xué)毒理學(xué)和生物學(xué)試驗(yàn)工作的不斷深入，人工合成的色素日益暴露出它的安全隱患，而天然類胡蘿卜素安全性高，有的還具有營養(yǎng)保健價(jià)值[17-18]，故對(duì)天然類胡蘿卜色素的需求量將日益增加.

類胡蘿卜素具有很強(qiáng)的抗氧化性和消除氧自由基的能力，并且能誘導(dǎo)細(xì)胞間的連接通訊，調(diào)控腫瘤增殖等，具有抗癌、抑癌的作用[19]，同時(shí)類胡蘿卜素還可提高動(dòng)物繁殖能力，是一種生理抗氧化劑，可保護(hù)卵泡和子宮細(xì)胞免受氧化反應(yīng)的破壞，有助于卵巢內(nèi)類固醇的合成，改善子宮內(nèi)環(huán)境，Brief和Chew[20]母豬注射β-胡蘿卜素可使其受胎率提高12.5%，活仔數(shù)增加12.3%.植物角度研究表明，類胡蘿卜素也是植物生存所必不可少的成分，它可以保護(hù)葉綠素免受強(qiáng)光導(dǎo)致的光氧化破壞，同時(shí)又是光合天線和反應(yīng)中心不可缺少的結(jié)構(gòu)成分，有些類胡蘿卜素還是ABA合成的前體[21,22].從胡蘿卜中提取類胡蘿素相關(guān)研究很多，主要研究了有機(jī)溶劑提取胡蘿卜中類胡蘿卜素時(shí)，有機(jī)溶劑的選擇和最優(yōu)條件，還有超聲波、微波和酶解等作為輔助處理時(shí)單個(gè)處理?xiàng)l件的最佳工藝條件.還沒有對(duì)各種處理方法之間優(yōu)劣比較，處理方法對(duì)提取類胡蘿素產(chǎn)生差異的原因等的研究.本文取用青海大通的胡蘿卜為實(shí)驗(yàn)材料，主要采用不同處理方法提取胡蘿卜中的類胡蘿卜素，并對(duì)不同的處理方法進(jìn)行優(yōu)缺點(diǎn)相關(guān)性分析，并采用柱層析色譜進(jìn)行分離純化，其工藝投資小，可為胡蘿卜的深加工提供有力參考.

1 材料與方法

1.1 材料

材料：取新鮮黃色胡蘿卜(產(chǎn)地青海大通)洗凈用恒溫鼓風(fēng)干燥箱干燥至恒重，粉碎過40目篩.

試劑：類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品(上海純優(yōu)生物科技有限公司)、丙酮(分析純)、石油醚(分析純)、無水乙醇(分析純)、中性氧化鋁(分析純).

儀器及設(shè)備：722型可見分光光度計(jì)(上海)、電子天平FA1604N(上海箐海儀器有限公司)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(102型天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠)、SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵(深圳)、手提式組織粉碎機(jī)(上海)、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(上海)、格蘭仕微波爐.

1.2 方法

1.2.1 類胡蘿卜素的提取

取干燥的10g胡蘿卜粉置于250mL錐形瓶中，加入石油醚和無水乙醇混合液，萃取得到的混合液用抽濾瓶抽濾，用石油醚洗滌3次，將所得濾液置于250mL分液漏斗中靜置分層，加入20mL蒸餾水混勻靜置分層，反復(fù)多次至下層無色，得到類胡蘿卜素粗提液.

1.2.2 色譜柱的制備

在柱的最底層放入少量棉花，將石油醚—中性氧化鋁懸浮液加入到10mm*160mm的層析柱中，邊加邊拍打柱體使氧化鋁均勻沉積于柱內(nèi)并保證上表面平整，加到10cm左右時(shí)在其上部鋪一張圓形小濾紙，并將色譜柱固定在鐵架臺(tái)上.

1.2.3 類胡蘿卜素含量測定方法和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取一定量的胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品用石油醚稀釋，在波長200～800nm范圍內(nèi)，用TU-1901紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行波譜掃描，測定胡蘿卜素的最大吸收波長，作為胡蘿卜素測定波長.結(jié)果顯示，在波長450nm處有最大吸收峰.再精確稱取胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品5mg，用石油醚稀釋定容到50mL容量瓶中，分別準(zhǔn)確移取1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00mL定容至10mL在波長450nm處測定吸光度得表1，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=0.0101X+0.013，相關(guān)系數(shù)為0.999.

圖1 β-胡蘿卜素吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素研究

2.1.1 不同料液比提取效果比較

稱取5份相同質(zhì)量干燥的胡蘿卜粉(10g)，在其他條件相同的情況下，分別用料液比不同(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)的無水乙醇和石油醚混合液(1∶1)進(jìn)行提取，得到的混合液稀釋到500mL，用紫外分光光度計(jì)在波長450nm處測定各個(gè)吸光度.根據(jù)吸光度值的大小可以求出得率如圖2所示，在料液比1∶10之后類胡蘿卜素的得率變化很小，從降低提取成本考慮，1∶10的料液比是最佳的提取條件.

圖2 料液比對(duì)類胡蘿卜素提取的影響

2.1.2 不同浸提時(shí)間提取效果比較

稱取5份相同質(zhì)量的胡蘿卜粉(10g)，在其他條件相同的情況下，分別用無水乙醇和石油醚混合液(100mL)進(jìn)行提取，提取時(shí)間分別為30min、60min、90min、120min、150min，得到的混合液稀釋到500mL，用紫外分光光度計(jì)在波長450nm處測定各個(gè)吸光度.根據(jù)吸光度值求出得率如圖3.在90min時(shí)達(dá)到最大提取量，90min后由于有機(jī)溶劑的揮發(fā)，時(shí)間過長有機(jī)溶劑使類胡蘿卜素降解等因素使得率下降.由此可得90min提取時(shí)間是有機(jī)溶劑浸提法最佳的提取時(shí)間.

圖3 浸提時(shí)間對(duì)類胡蘿卜素提取的影響

2.1.3 不同浸提溫度對(duì)提取效果的影響

圖4 浸提溫度對(duì)類胡蘿卜素提取的影響

稱取5份質(zhì)量相同的干燥胡蘿卜粉(10g)，在其他條件相同的情況下，加入石油醚和乙醇的混合溶液料液比1∶10，在恒溫水浴鍋中分別放置在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃下浸提，提取得到的混合溶液稀釋到500mL，用紫外分光光度計(jì)在波長450nm處測各個(gè)吸光度.根據(jù)吸光度值求出得率如圖4所示，隨著溫度增高分子運(yùn)動(dòng)劇烈，目標(biāo)產(chǎn)物擴(kuò)散速率越大，溶解度增大，提取率增加，在30～40℃下類胡蘿卜的得率最高，當(dāng)溫度高于40℃石油醚揮發(fā)過快同時(shí)溫度升高色素降解使得率下降.

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及主效應(yīng)分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇提取料液比(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)(見表2)，固定提取溶劑石油醚與乙醇混合液和原料粉碎細(xì)度(40目)，試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)處理結(jié)果如表3所示.

表2 正交因素水平表

由極差分析可知，RC>RB>RA，故影響因素次序?yàn)镃>B>A，即提取溫度的影響最顯著，其次是提取時(shí)間，最后料液比.最佳提取條件組合為A1B3C3，即提取時(shí)間120min、提料液比1∶10、取溫度40℃.

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 不同輔助條件提取類胡蘿卜素分析

2.3.1 超聲波破碎時(shí)間對(duì)提取類胡蘿卜素影響

稱取5份質(zhì)量相同的干燥胡蘿卜粉(10g)，在其他條件相同的情況下，加入石油醚和乙醇的混合溶液料液比1∶10，在超聲波下分別處理10min、15min、20min、25min、30min，提取得到的混合溶液稀釋到500mL，用紫外分光光度計(jì)在波長450nm處測各個(gè)吸光度.根據(jù)吸光度值求出得率如圖5，在超聲處理25min條件下得到最大得率11.13mg/10g，25min之前由于處理還不充分，所以得率較低，25min后由于溫度的變化及溶劑揮發(fā)等因素影響導(dǎo)致得率降低.

圖5 超聲破碎時(shí)間對(duì)類胡蘿卜素提取的影響

2.3.2 微波破碎時(shí)間對(duì)類胡蘿卜素提取影響

稱取5份質(zhì)量相同的干燥胡蘿卜粉(10g)，在其他條件相同的情況下，先加入少量蒸餾水使其充分浸濕，然后在微波功率480W分別處理10s、20s、30s、40s、50s，取出加入石油醚和乙醇的混合溶液料液比1∶10，提取得到的混合溶液稀釋到500mL，用紫外分光光度計(jì)在波長450nm處測得各個(gè)吸光度.根據(jù)吸光度值求出得率如圖6，在30s時(shí)類胡蘿卜素得率最高，30s后由于微波破碎升溫較快，溫度超過60℃使類胡蘿卜素分解，同時(shí)也因?yàn)闇囟冗^高導(dǎo)致微波破碎提取法的類胡蘿卜素得率最低.

圖6 微波破碎時(shí)間對(duì)類胡蘿卜素提取的影響

3 討論

3.1 不同提取方法分析比較

有機(jī)溶劑法提取胡蘿卜素是當(dāng)前主要的天然類胡蘿卜素提取方法，雖然方法簡單但提取率不高.本試驗(yàn)考慮采用微波和超聲波作為輔助條件提高類胡蘿卜素的提取率.在微波輔助提取時(shí)，類胡蘿卜素的得率為8.71mg/10g，類胡蘿卜素的得率反而將低.由于微波作為提取輔助條件時(shí)溫度無法控制，導(dǎo)致處理時(shí)間長，溫度過高使類胡蘿卜素分解得率下降；處理時(shí)間短，作用不夠充分類胡蘿卜素析出的量少，類胡蘿卜素的得率很低，說明微波提取不利于類胡蘿卜素的提取.超聲波作為輔助條件時(shí)類胡蘿卜素得率達(dá)到11.14mg/10g，得率明顯提高，超聲波破碎易于控制溫度，同時(shí)細(xì)胞的破碎率較高，利于細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)析出，作為輔助條件有利于類胡蘿卜素的提取.

3.2 柱色譜分離中洗脫劑的使用

將提取得到的混合液在恒溫水浴鍋60℃下蒸發(fā)，至體積為5mL左右，加入到制備好的色譜柱中，先用石油醚洗脫得到明黃色洗脫液，再用3∶7丙酮與石油醚混合液洗脫得到橘黃色洗脫液，再用1∶1丙酮與石油醚混合液洗脫得到青黃色洗脫液.經(jīng)本試驗(yàn)驗(yàn)證是最理想的洗脫劑使用方法.

4 結(jié)論

有機(jī)溶劑提取法最佳工藝參數(shù)為體積比1∶1石油醚和無水乙醇的混合液作為提取劑，提取時(shí)間120min，提取溫度40℃，料液比1∶10，類胡蘿卜素得率為8.98mg/10g.采用微波破碎和超聲波破碎作預(yù)處理時(shí)，30℃水浴中超聲破碎最佳時(shí)間為25min，得率為11.14mg/10g，微波破碎在功率480W時(shí)最佳時(shí)間30s，得率為8.71mg/10g.經(jīng)驗(yàn)證性試驗(yàn)驗(yàn)證，超聲波輔助提取時(shí)其類胡蘿素得率最高，可以用于實(shí)踐.而微波輔助提取時(shí)其類胡蘿卜素得率較低，不適合應(yīng)用于胡蘿卜的類胡蘿卜素提取工藝.