劉超凡，張國君，徐剛標

（1.中南林業(yè)科技大學 林學院，湖南 長沙 410004；2.湖南省泰格林紙集團有限公司，湖南 岳陽 414000）

楊樹Populus具有適應性廣、生長快、輪伐期短、產(chǎn)量高、易于更新的特點，是世界中緯度平原地區(qū)栽培面積最大、產(chǎn)量最高的速生用材樹種之一[1-2]。由于天然條件下楊樹種間極易產(chǎn)生自然雜種，以及各地頻繁交流種質(zhì)材料，極易引起其種質(zhì)混雜[3]。植物種質(zhì)準確鑒定，是保證其純度的重要基礎(chǔ)，也是楊樹新品種知識產(chǎn)權(quán)保護、種質(zhì)保存和利用的重要前提條件[4]。

早期的楊樹種質(zhì)資源遺傳評價與鑒定，主要是利用其生物學特性、形態(tài)特征、適應性與抗性等方面的差異。由于楊樹無性系種質(zhì)間的生物學特性差異極小，形態(tài)特征極易受季節(jié)和環(huán)境因子影響，因此采用傳統(tǒng)方法鑒定楊樹無性系種質(zhì)材料和新品種知識產(chǎn)權(quán)的保護具有一定的難度[4]。近30年來，隨著現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，各種分子標記技術(shù)已廣泛應用于楊樹種質(zhì)鑒定與資源評價研究[5-13]。特別是近年來基于熒光測序技術(shù)建立的TP-M13-SSR（Simple sequence repeat with tailed primer M13）檢測技術(shù)，具有通量高、分辨率高和分子數(shù)據(jù)自動統(tǒng)計、成本低廉等優(yōu)點[14]，已經(jīng)廣泛應用于農(nóng)作物、果樹及林木種質(zhì)鑒別與指紋圖譜數(shù)據(jù)庫構(gòu)建[15-20]。

本研究以泰格林紙集團有限責任公司在湖南省岳陽市建立的國家楊樹種質(zhì)資源庫中部分譜系清楚的楊樹無性系種質(zhì)為研究材料，利用TP-M13-SSR 技術(shù)構(gòu)建楊樹無性系種質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，旨在快速鑒別林業(yè)生產(chǎn)上楊樹優(yōu)良無性系的真?zhèn)危瑸闂顦湫缕贩N的知識產(chǎn)權(quán)保護提供依據(jù)，并為楊樹雜交育種工作的親本選擇提供遺傳學背景。

1 材料與方法

1.1 材 料

分別于2018年4月和2019年4月，從泰格林紙集團有限責任公司在湖南省岳陽市建立的國家楊樹種質(zhì)資源庫中采集譜系清楚的141 份楊樹無性系種質(zhì)材料。將野外采集的新鮮幼嫩葉片，裝入盛有硅膠的自封塑料袋中，帶回實驗室充分干燥后，置于4℃冰柜中保存。

1.2 方 法

1.2.1 DNA 提取

采用改良CTAB 法提取楊樹基因組DNA[4]。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的完整性，核酸蛋白分析儀檢測DNA 的濃度和質(zhì)量。檢測合格的DNA 稀釋至濃度為50 ng·μL-1，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR 引物篩選

從已報道的楊樹SSR 引物[4,13]序列中，選取擴增產(chǎn)物片段長度在100～300 bp 之間的引物86對，用8 份遺傳背景差異較大的無性系材料進行篩選，從中選出多態(tài)性高、條帶清晰且穩(wěn)定性好的14 對SSR 引物。

1.2.3 PCR 擴增體系

在選取的SSR 引物5′端，加上M13（TGTAAAACGACGGCCAGT）接頭，構(gòu)建TPM13-SSR 引物，M13 引物采用3 種熒光（ROX、HRX 和FAM）標記。SSR 引物及M13 熒光標記由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。TPM13-SSRPCR 反應體系及擴增程序參考文獻[4]。采用毛細管自動熒光電泳系統(tǒng)ABI3730XL 對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測、分型。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用GeneMarker V1.91 軟件進行基因分型，Cervus 3.0.7 軟件估算多態(tài)信息含量（PIC）和各SSR 位點無效等位基因（Null alleles）頻率（pN），POPGENE 3.2 軟件統(tǒng)計、估算各SSR 位點上的等位基因數(shù)目（Number of allele，Na）、Shannon 信息指數(shù)（Shannon information index，I）和觀測雜合 度（Observed heterozygosity，HO），NTSYSpc 2.1 軟件估算成對無性系間的遺傳相似系數(shù)（GS，Genetic similarity），選取非加權(quán)類平均法（Unweighted pair group method arithmetic averages,UPGMA）選項，進行遺傳聚類分析。

1.2.5 指紋數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

每份無性系材料的指紋圖譜身份證由1 組數(shù)字組成。每對引物擴增出的條帶，按條帶分子量大小，對相應的條帶進行編號（分子量越大，數(shù)字越小。如分子量最大，編為01；次之，編為02，以此類推）。純合體為1 條帶，由相同數(shù)字組成；雜合體為2 條帶，由對應條帶的2 個不同數(shù)字組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 引物的多態(tài)性分析

利用篩選出的14 對引物（表1），采用TPM13-SSR 技術(shù)對141 份楊樹無性系種質(zhì)的基因組DNA 進行PCR 擴增檢測，共檢測到多態(tài)性條帶91條，多態(tài)位點百分比為92.86%。每個位點上的等位基因數(shù)目變異幅度為2～12，平均每個SSR 位點上的等位基因數(shù)目為6.5。其中，GCPM1599 位點上的等位基因數(shù)最多（12），ORPM158、ORPM180 和ORPM214 位點上的等位基因數(shù)目最少（2）。

表1 SSR 引物信息?Table 1 Information of SSR primers

14 對SSR 引物分型的結(jié)果表明，南林70 和南林S366 無性系的基因型相同。引物ORPM317在湘林系列無性系中只檢測到1 個條帶，在其他供試無性系種質(zhì)材料中僅檢測到2 個條帶。采用Cervus 3.0.7 估算各位SSR 位點無效等位基因頻率的結(jié)果表明，引物ORPM317 無效等位基因頻率大于0.2，該引物位點可視為無效等位基因位點[22]。去除引物ORPM317，13 對引物位點上的等位基因數(shù)目變動幅度為2～12，平均值為6.8；Shannon’s信息指數(shù)變化范圍為0.13～1.91，平均值為0.97；多態(tài)信息含量為0.19～0.81，平均值為0.56，觀測雜合度為0.06～0.76，平均值為0.40。圖1為ABI3730XL 毛細管電泳系統(tǒng)檢測引物ORPM409在8 份楊樹無性系中的擴增圖譜。這表明本研究篩選的13 對引物位點多態(tài)性較高。

2.2 指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

構(gòu)建種質(zhì)DNA 指紋數(shù)據(jù)庫，常用的方法是分子標記引物組合法。在滿足能分辨種質(zhì)基因型的前提下，盡可能選擇數(shù)量較少的分子標記引物構(gòu)建指紋圖譜[21]。為此，本研究首先進行成對SSR引物組合，評價成對引物的組合對供試楊樹無性系種質(zhì)材料的分辨率。再以成對SSR 引物分辨率最高的組合為基礎(chǔ)，逐步增加引物組合的數(shù)量，直到能將所有供試的楊樹無性系種質(zhì)材料全部區(qū)分開來。

選取高于所有引物Shannon’s 信息指數(shù)平均值的7 對引物ORPM214、ORPM330、ORPM409、GCPM1295、GCPM1599、GCPM1663 和PMGC2765 進行成對組合，發(fā)現(xiàn)引物GCPM1599和GCPM1295 組合，分辨率最高，能夠鑒別53份楊樹無性系種質(zhì)材料，分辨率為37.85%；在此組合基礎(chǔ)上，增加引物組合數(shù)量到3 個，發(fā)現(xiàn)GCPM1599、GCPM1295 和PMGC2765 組合在3 個引物組合中分辨率最高，能夠鑒別113 份楊樹無性系種質(zhì)材料，分辨率為80.71%；引物組合數(shù)量增加至4 個（GCPM1599、GCPM1295、PMGC2765 和ORPM330），可鑒別133 份楊樹無性系種質(zhì)材料，分辨率為95.00%；5 對引物GCPM1599、GCPM1295、PMGC2765、ORPM330 和ORPM409 組合，能鑒別137 份 楊樹無性系種質(zhì)材料，分辨率為達97.85%；6 對引物GCPM1599、GCPM1295、PMGC2765、ORPM330、ORPM409 和ORPM214 組合，可鑒別140 份楊樹無性系（NL70 與NLS366 為同一基因型），分辨率為100%。6 對引物構(gòu)建屬于每份楊樹無性系種質(zhì)材料的唯一的指紋圖譜代碼（表2）。

圖1 引物ORPM409 在8 份楊樹無性系中的擴增圖譜Fig.1 Polymorphic finger prints detected by ORPM-409 for 8 Populus clones

表2 141 份楊樹無性系種質(zhì)的指紋圖譜Table 2 Fingerprint map of partal materials of 141 Populus clones

表2 141 份楊樹無性系種質(zhì)的指紋圖譜Table 2 Fingerprint map of partal materials of 141 Populus clones

2.3 聚類分析

將13 對SSR 引物對每份楊樹無性系種質(zhì)材料擴增的條帶轉(zhuǎn)換成0，1 矩陣，采用NTSYS-pc 2.1軟件，基于UPGMA 法進行遺傳聚類分析，其結(jié)果見圖2。

由圖2可知，參試的141 份楊樹無性系種質(zhì)材料可劃分為3 大類群。

類群I 為南林（NL）系列無性系材料。南林系列楊樹無性系是從美洲黑楊I(lǐng)-69 和歐美楊I(lǐng)-45雜交子代中選育出來的，親緣關(guān)系很近。遺傳聚類結(jié)果符合楊樹無性系種質(zhì)的譜系關(guān)系。

類群II包括中林108（ZL108）、中潛1號（ZQ1）、中潛3-2（ZQ3-2）、浙7（Z7）、中駐2 號（ZZ2）、中駐4 號、中柱6 號（ZZ6）、中柱7 號（ZZ7）、中駐8 號（ZZ8）、中柱9 號（ZZ9）、中皖1 號（ZW1）、中皖2 號（ZW2）、丹紅楊（DHY）、A65/27、南抗3（NK3）、南抗4（NK4）、I69。中潛系列、中駐系列、中皖系列都是從I69 楊為母本，I63 楊為父本的雜交組合中選育出來的優(yōu)良無性系，本研究的遺傳聚類結(jié)果與其譜系關(guān)系完全一致；類群II 中，丹紅楊的親本為50 號楊與36號楊，推測其親本可能與I69 楊、I63 楊親緣關(guān)系較近。A65/27 父本是智利黑楊，母本為南方型美洲黑楊，與類群II 中其它楊樹無性系聚在一起，這與其種質(zhì)的譜系關(guān)系不一致。這可能是湖南省泰格林紙集團有限責任公司在楊樹國家種質(zhì)資源庫無性系材料收集、保存過程中，編號錯誤造成的種質(zhì)混淆。

類群III 為湘林（XL）系列無性系材料。湘林系列無性系是從美國引進的優(yōu)良楊樹無性系為親本，通過人工有性雜交與無性系選育出來的。52 份無性系種質(zhì)材料中，19 份無性系（XL305～XL427）是從湘林59 半同胞家系中選擇出來的無性系，13 份（XL71～XL106）是從湘林86 半同胞家系中選擇出的無性系。遺傳聚類的結(jié)果與其譜系關(guān)系基本一致。

圖2 141 份楊樹無性系種質(zhì)遺傳聚類圖像Fig.2 The clustering map of 141 Populus clones

3 結(jié)論與討論

湖南省泰格林紙集團有限責任公司國家楊樹種質(zhì)資源庫中收集、保存的楊樹無性系種質(zhì)中，有相當一部分無性系種質(zhì)材料的譜系關(guān)系不清，因此，開展楊樹無性系種質(zhì)鑒定工作迫在眉睫。由于國家楊樹種質(zhì)資源庫中，部分無性系材料是從同一的半同胞家系或全同胞家系中選育出的，種質(zhì)材料之間形態(tài)學特征差異很小，難以從表型方面進行區(qū)分。分子標記技術(shù)不受環(huán)境條件影響，是快速鑒別楊樹種質(zhì)的重要技術(shù)手段[4]。TP-M13-SSR 技術(shù)能夠精準判讀、識別PCR 擴增產(chǎn)物的大小，已成為植物種質(zhì)資源的指紋圖譜構(gòu)建的首選分子標記[16,19-23]，但是，SSR 分子標記中無效等位基因的存在，是其自身不可避免的缺陷，會使研究結(jié)果產(chǎn)生偏差[24-25]。為了保證研究結(jié)果能在林業(yè)生產(chǎn)實踐中準確、快速地鑒定楊樹優(yōu)良無性系，本研究中剔除掉無效等位基因頻率大于0.2 的SSR引物。隨著第三代DNA 高通量測序技術(shù)發(fā)展和測序成本降低，采用SNP 標記技術(shù)有望應用于楊樹無性系種質(zhì)鑒別和指紋圖譜構(gòu)建工作中[26]。

本研究基于TP-M13-SSR 技術(shù)的分子數(shù)據(jù)，進行UPGMA 聚類分析的結(jié)果與參試的楊樹無性系種質(zhì)記錄的譜系關(guān)系基本相符合，這與前人研究結(jié)果一致[4,16,19-21]。本研究中，個別無性系種質(zhì)與其譜系關(guān)系不一致，可能是種質(zhì)收集、保存過程中編號錯誤引起。所有引物都沒有檢測到NL70和NLS366 無性系之間的條帶差異，基因分型的結(jié)果為同一基因型，很有可能NL70 和NLS366 是相同無性系，種植編號時產(chǎn)生的錯誤。南林系列與湘林系列無性系種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)最小，有望通過南林系列與湘林系列無性系種質(zhì)間雜交制種，從中選育出符合林業(yè)生產(chǎn)上需要的優(yōu)良無性系品種。

賈會霞等[4]利用ORPM409、GCPM1599 引物分別檢測到6 個等位基因，但這2 對引物在本研究中檢測到分別為8 和12 等位基因，這可能是參試無性系種質(zhì)材料不同引起的。賈會霞等[4]采用3 對引物，能夠完全辨別所有參試材料的遺傳身份，但本研究需要6 對引物，推測其原因，可能是本研究中部分參試的無性系種質(zhì)材料是從同一家系中選育出來的，遺傳關(guān)系較近。

本研究基于TP-M13-SSR 技術(shù)構(gòu)建了湖南省岳陽楊樹國家種質(zhì)資源庫收集的無性系指紋數(shù)據(jù)庫，研究結(jié)果為深入了解楊樹國家種質(zhì)資源庫收集保存楊樹無性系種質(zhì)材料的遺傳背景提供了參考依據(jù)，有利于提高楊樹無性系資源的利用效率，對楊樹優(yōu)良無性系品種的鑒定、保護，林業(yè)生產(chǎn)上假冒偽劣無性系的識別，以及楊樹特異種質(zhì)創(chuàng)制和新品種選育等方面具有重要的理論指導意義和實際應用價值。