吳 澤，杜 娟，謝 潔*，勾 洵，彭 玲，葉 羊，張曉喻*，袁學(xué)剛，袁鈺婷，史迎欣

基于高通量測序和化學(xué)輪廓分析研究黃連在連梔礬溶液發(fā)酵炮制中的作用

吳 澤1，杜 娟2，謝 潔1*，勾 洵1，彭 玲1，葉 羊1，張曉喻1*，袁學(xué)剛3，袁鈺婷1，史迎欣1

1. 四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101 2. 四川師范大學(xué)地理與資源科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101 3. 成都市第六人民醫(yī)院，四川 成都 610058

探究黃連在連梔礬溶液傳統(tǒng)發(fā)酵炮制中的作用。按照連梔礬溶液傳統(tǒng)配方比例，將其拆分為3組配方溶液：連梔礬組（黃連＋梔子＋白礬）、黃連組（黃連＋白礬）和梔子組（梔子＋白礬），采用HPLC分析比較3組溶液發(fā)酵前后的化學(xué)成分變化輪廓，采用Illumina Hiseq高通量測序技術(shù)測定并比較發(fā)酵溶液中微生物的群落特征。傳統(tǒng)配方連梔礬經(jīng)發(fā)酵后環(huán)烯醚萜類成分發(fā)生了較顯著的變化（＜0.05），生物堿類成分未發(fā)生明顯變化，拆分后的黃連組中生物堿類成分和梔子組中環(huán)烯醚萜類成分均沒有發(fā)生明顯變化。分別對各組發(fā)酵溶液進(jìn)行測序，根據(jù)α多樣性分析結(jié)果，3組發(fā)酵液中真菌多樣性為連梔礬組＜梔子組＜黃連組，真菌的豐富度為梔子組＜連梔礬組＜黃連組；細(xì)菌多樣性為連梔礬組＜黃連組＜梔子組，細(xì)菌的豐富度為連梔礬組＜梔子組＜黃連組。根據(jù)β多樣性分析結(jié)果，3組溶液中的真菌和細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)均有明顯差異。根據(jù)微生物相對豐度分析可知，3組的優(yōu)勢真菌均為子囊菌門、擔(dān)子菌門和羅茲菌門，不同組間豐度無明顯差異；真菌優(yōu)勢屬中的孢霉屬的豐度在連梔礬組最高，顯著高于另外2組（＜0.05），梔子組又顯著高于黃連組（＜0.05）；韋斯特殼屬的豐度在連梔礬組中最低，顯著低于黃連組和梔子組（＜0.05），后兩者間豐度無明顯差異。3組的優(yōu)勢細(xì)菌均為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門，其中連梔礬組中變形菌門的豐度極顯著低于黃連組和梔子組（＜0.01），厚壁菌門的豐度在連梔礬組中極顯著高于黃連組和梔子組（＜0.01），放線菌門和擬桿菌門的豐度在3組發(fā)酵溶液的差異較小；細(xì)菌優(yōu)勢菌屬中的乳桿菌屬在連梔礬組中顯著高于黃連組和梔子組（＜0.05），在黃連組中也顯著高于梔子組（＜0.05），伯克氏菌屬豐度在黃連組和梔子組中無顯著差異，都顯著高于連梔礬組中的豐度（＜0.05）。連梔礬溶液配方中的黃連能提高其中梔子的有效成分的發(fā)酵轉(zhuǎn)化，并且是通過對發(fā)酵體系中的優(yōu)勢菌屬的豐度進(jìn)行調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用的。進(jìn)一步佐證了傳統(tǒng)配方制劑的合理性和科學(xué)性。

連梔礬溶液；黃連；高通量測序；化學(xué)輪廓分析；微生物多樣性；發(fā)酵；炮制；群落特征；環(huán)烯醚萜；生物堿；α多樣性分析；β多樣性分析；真菌；細(xì)菌

發(fā)酵是傳統(tǒng)中藥炮制中一種常用和重要的手段，在我國具有悠久的歷史。中藥的發(fā)酵炮制過程實(shí)際上是一個生物轉(zhuǎn)化的過程，通過微生物代謝對中藥活性成分的作用實(shí)現(xiàn)“減毒增效”[1]。連梔礬溶液是我國著名中醫(yī)肛腸病學(xué)專家黃濟(jì)川先生的臨床效驗(yàn)方，至今已有近百年的臨床應(yīng)用歷史，為成都肛腸專科醫(yī)院的醫(yī)院效驗(yàn)制劑（川藥制字Z20080191）[2]。該制劑由2味植物中藥材黃連、梔子和礦物質(zhì)藥材白礬組成，制作工藝非常獨(dú)特，將黃連、梔子和白礬按組方加水經(jīng)100 ℃煎煮后，濾過藥液加蓋靜置于陰暗潮濕處發(fā)酵，待其表面出現(xiàn)豹紋式青灰色微生物，藥液呈澄清的橙紅色或黃棕色時裝瓶使用。從現(xiàn)代生物技術(shù)的角度來看，連梔礬溶液的制作屬于多菌種液態(tài)自然發(fā)酵。

課題組前期利用高通量測序技術(shù)測定分析連梔礬溶液發(fā)酵炮制過程中的微生物多樣性和豐富度，結(jié)果表明炮制過程中所涉及的微生物種類繁多，真菌和細(xì)菌共同參與發(fā)酵，真菌的豐富度和多樣性整體變化趨勢隨發(fā)酵時間的增加逐漸增加，細(xì)菌的豐富度和多樣性整體變化趨勢隨發(fā)酵時間的增加逐漸降低[3-4]。同時對連梔礬溶液發(fā)酵過程的化學(xué)變化輪廓分析發(fā)現(xiàn)，不同時間發(fā)酵液的HPLC指紋圖譜在色譜峰數(shù)量及峰面積方面均有較大的差異，對發(fā)酵液中梔子和黃連的主要功效成分進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，梔子中的環(huán)烯醚萜類成分是主要被轉(zhuǎn)化的底物，而黃連中生物堿類化學(xué)成分在整個發(fā)酵過程沒有發(fā)生較明顯的轉(zhuǎn)化[4-6]。

黃連是我國使用歷史悠久的中藥，具有天然的廣譜抗菌性，同時也可促進(jìn)益生菌的生長，具有豐富的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)。黃連的抗菌譜較廣，對革蘭陽性菌（如肺炎雙球菌[7-8]、金黃色葡萄球菌[9-11]等）、革蘭陰性菌（如綠膿桿菌[12-13]、大腸埃希菌[14-15]、耐藥鮑曼不動桿菌[16-17]等）以及真菌（如白色念球菌[18-19]、假絲酵母菌[20-21]等）均具有顯著的抑制作用。在黃連與腸道菌群的相互作用的研究中發(fā)現(xiàn)，黃連提取物可明顯促進(jìn)益生菌（乳酸菌、雙歧桿菌）的生長，黃連解毒湯低劑量使用時或許有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的作用[22]。周俊怡等[23]采用Illumina高通量測序技術(shù)對黃連解毒湯組和空白對照組大鼠腸道的菌群進(jìn)行定量檢測，結(jié)果顯示在臨床劑量下，連續(xù)服用黃連解毒湯7 d能夠引起健康大鼠部分腸道菌群比例明顯變化。因此，黃連在調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)中可能發(fā)揮重要作用。那么黃連在連梔礬溶液發(fā)酵炮制中發(fā)揮的作用到底是什么，是否對微生物具有篩選作用，如何影響發(fā)酵炮制中微生物的多樣性、豐富性，進(jìn)而影響成分的生物轉(zhuǎn)化？目前還沒有相關(guān)研究文獻(xiàn)進(jìn)行論證。

本研究擬將連梔礬溶液配方進(jìn)行拆分，利用HPLC法分析比較不同組方發(fā)酵溶液的化學(xué)輪廓，采用高通量測序技術(shù)研究比較不同組方發(fā)酵溶液中微生物的組成及豐度情況，以探究黃連在發(fā)酵中的作用，有助于了解黃連在整個發(fā)酵炮制中發(fā)揮的重要作用，同時也有助于對連梔礬溶液發(fā)酵機(jī)制的深入認(rèn)識，為揭示連梔礬溶液的發(fā)酵機(jī)制提供研究基礎(chǔ)，為連梔礬溶液現(xiàn)代化科學(xué)發(fā)酵提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

黃連藥材飲片（批號1811003051，產(chǎn)地四川）、梔子藥材飲片（批號1811000971，產(chǎn)地江西）、白礬（批號1701070，產(chǎn)地四川）均購于成都康美藥業(yè)生產(chǎn)有限公司，經(jīng)該公司主管中藥師黃華軍鑒定，均符合《中國藥典》2020年版一部相關(guān)項(xiàng)下要求。黃連為毛茛科黃連屬植物黃連Franch.的干燥根莖，梔子為茜草科梔子屬植物梔子Ellis的干燥成熟果實(shí)。色譜純鹽酸、磷酸、甲醇和乙腈均購于成都碩博研創(chuàng)科技有限公司；核酸染料EB（E607322）、瓊脂糖（Agarose A600234），生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR酶（KOD-401B：Toyobo KOD-Plus-Neo DNA Polymerase）；DNA marker（Takara公司，DL2000）；TE緩沖液；真菌引物ITS3_KYO2（5’-GATGAAG- AACGYAGYRAA-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTT- ATTGATATGC-3’），細(xì)菌引物515F（5’-GTGCCA- GCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTAC- HVGGGTWTCTAAT-3’）；DNA提取試劑盒（MO BIO PowerSoil DNA Isolation Kit）；膠回收試劑盒，Omega公司；測序建庫試劑盒（TruSeq DNA PCR- Free Sample Prep Kit）；上機(jī)測序試劑盒（Hiseq Rapid SBS Kit v2）。

1.2 儀器與設(shè)備

Nano Drop MP2000C紫外分光光度計(jì)，Thermo Fisher公司；VersaDoc'5000凝膠成像儀，Bio-Rad公司；5424R離心機(jī)，Eppendorf公司；PowerPac Basic1645050電泳儀，Bio-Rad公司；Qubit 2.0熒光定量儀，Invitrogen公司；Firefly NIMBUS?96凝膠萃取儀，OMEGA-Biotek公司；Applied Biosystems GeneAmp 9700 PCR儀，ABI公司；Hiseq 2500測序儀，Illumina公司；1200型高效液相色譜分析儀，Agilent公司。

2 方法

2.1 發(fā)酵液制備與樣品采集

連梔礬溶液包括黃連、梔子和白礬3種中藥材，本實(shí)驗(yàn)按照傳統(tǒng)配方比例，根據(jù)生藥質(zhì)量濃度一致性原則，將連梔礬溶液分拆為連梔礬組（黃連＋梔子＋白礬）、黃連組（黃連＋白礬）、梔子組（梔子＋白礬）。按比例稱取中藥材進(jìn)行煎煮，收集濾液于有蓋發(fā)酵桶中，靜置于成都肛腸專科醫(yī)院制劑室，自然發(fā)酵。每天采集發(fā)酵溶液樣品并利用HPLC法測定發(fā)酵液中化學(xué)成分變化，以發(fā)酵液面出現(xiàn)豹紋式青灰色微生物，藥液呈澄清的橙紅色或黃棕色，溶液中梔子苷轉(zhuǎn)化率≥95%時作為發(fā)酵的終點(diǎn)[24]，到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)時共需發(fā)酵18 d，收集發(fā)酵終點(diǎn)時的發(fā)酵溶液進(jìn)行高通量測序。樣品采集時用無菌吸管在距離液面5 cm，發(fā)酵桶壁2 cm的平面的3個點(diǎn)等量進(jìn)行取樣（圖1），然后混合為1個樣本。

圖1 取樣示意圖

2.2 色譜條件

色譜柱為Eclipse Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相為0.1%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脫：0～8 min，5%～15%乙腈；8～15 min，15%～18%乙腈；15～20 min，18%～20%乙腈；20～30 min，20%～25%乙腈；30～45 min，25%乙腈；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長238 nm；進(jìn)樣量10 μL[24]。

2.3 供試品溶液制備

取100 μL發(fā)酵液于10 mL棕色量瓶中，加入9 mL甲醇鹽酸溶液［甲醇-鹽酸（100∶1）］，超聲處理15 min，室溫放置冷卻后用甲醇鹽酸溶液定容，然后將溶液經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜濾過后裝于進(jìn)樣瓶中，按“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析[24]。

2.4 微生物組總DNA提取

按照MO BIO PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒說明書進(jìn)行基因組DNA的提取，通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA分子的質(zhì)量，利用紫外分光光度計(jì)對DNA分子質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測，并稀釋至10 ng/μL。

2.5 PCR擴(kuò)增、文庫構(gòu)建及測序

以稀釋后的基因組DNA為模板，用帶有Barcode的特異引物進(jìn)行擴(kuò)增。真菌PCR擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?8S rDNA基因中的ITS2區(qū)段，引物為ITS3_ KYO2（5’-GATGAAGAACGYAGYRAA-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）；細(xì)菌PCR的擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?6S rRNA基因中的V4區(qū)，引物為515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。PCR擴(kuò)增后與1/6體積的6XLoading Buffer混合，使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，再使用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）回收目的條帶，然后用Qubit@2.0 Fluorometer（Thermo Scientific）定量，最后等物質(zhì)的量混合。文庫構(gòu)建使用Illumina公司的TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit試劑盒進(jìn)行，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過定量和文庫檢測合格后，使用Hiseq 2500平臺PE250模式測序。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)、分析、繪圖使用Office Excel 2019、IBM SPSS Statistics 24、Origin 2020和中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版軟件進(jìn)行；測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析使用OmicStudio工具（https://www.omicstudio.cn/）進(jìn)行。

3 結(jié)果與分析

3.1 發(fā)酵溶液中化學(xué)成分變化輪廓分析

對3個組發(fā)酵前后的溶液（0、18 d）進(jìn)行HPLC分析得到指紋圖譜，根據(jù)峰面積歸一化法，統(tǒng)計(jì)占比達(dá)到2%以上的色譜峰，結(jié)合葉羊等[24]對連梔礬溶液中化學(xué)成分的指認(rèn)方法，結(jié)果確定了發(fā)酵液中的主要化學(xué)成分，并對主要化學(xué)成分發(fā)酵前后的色譜峰峰面積變化進(jìn)行單因素方差分析。不同組方發(fā)酵溶液發(fā)酵前后的主要化學(xué)成分的色譜峰峰面積見表1。同時，繪制了HPLC指紋圖譜（圖2-A和B）及主要化學(xué)成分的峰面積的熱圖（圖2-C）以直觀展示不同組方發(fā)酵液化學(xué)成分在發(fā)酵前后的變化情況。分析可知，連梔礬組（黃連、梔子、白礬）溶液中化學(xué)成分經(jīng)發(fā)酵后整體變化顯著（＜0.05），與之前研究一致，黃連所含有的非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿（序號6～9、12和13）等生物堿類成分的含量無明顯變化，梔子所含主要的環(huán)烯醚萜類成分變化顯著（＜0.05），發(fā)酵前主要成分京尼平龍膽雙糖苷（序號1）和梔子苷（序號3）隨著發(fā)酵的進(jìn)行轉(zhuǎn)化為京尼平（序號5），以及新的環(huán)烯醚萜類物質(zhì)即化合物1、3和4（序號2、10、11）。黃連組（黃連、白礬）發(fā)酵溶液中生物堿類化學(xué)成分在發(fā)酵后含量未發(fā)生明顯變化，梔子組（梔子、白礬）發(fā)酵溶液中環(huán)烯醚萜類化學(xué)成分在發(fā)酵后含量也未發(fā)生明顯變化，這與連梔礬組溶液中的變化情況不一致。由此可知，黃連的加入提高了溶液中梔子中主要化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化，這種轉(zhuǎn)化是微生物作用的結(jié)果，說明黃連在發(fā)酵過程中可能對微生物菌群有調(diào)節(jié)作用。

表1 不同組方溶液發(fā)酵前后主要化學(xué)成分色譜峰面積變化情況

表格中峰面積的單位均為mAU

The unit of peak area in the table is mAU

圖2 不同組方溶液發(fā)酵前、后的HPLC指紋圖譜及發(fā)酵前后主要化學(xué)成分(1～13)色譜峰面積熱圖

3.2 測序結(jié)果及質(zhì)量分析

不同組方發(fā)酵液樣品測序序列統(tǒng)計(jì)（表2）發(fā)現(xiàn)，3種發(fā)酵液中共測得真菌有效序列334 026條，其中高質(zhì)量序列有312 606條，占序列總數(shù)的93.59%；細(xì)菌有效序列325 218條，其中高質(zhì)量序列有292 326條，占序列總數(shù)的89.89%。真菌序列條數(shù)在連梔礬組溶液中的最多，黃連組中的數(shù)量與連梔礬組相當(dāng)，梔子組中最少；細(xì)菌序列條數(shù)在黃連組溶液中最多，連梔礬組和梔子組中的數(shù)量基本一致。值表示測序堿基的質(zhì)量值，其中30代表正確的堿基識別率達(dá)到99.9%時的值，在本次測序樣本的30的比例均到達(dá)93%以上，說明本次測序整體質(zhì)量水平較高。

表2 樣品序列統(tǒng)計(jì)

3.3 OTU（operational taxonomic units）劃分和分類地位鑒定

以97%的相似度對獲得的序列進(jìn)行歸并和OTU劃分，得到每個樣品的OTU數(shù)量，以此可以表示樣品中物種的豐度[25]。結(jié)果表明，在各分類水平，真菌OTU的數(shù)量在黃連組和梔子組溶液中沒有較大差異，而且都多于連梔礬組溶液；細(xì)菌OTU的數(shù)量在連梔礬組和梔子組溶液中沒有明顯差異，都少于黃連組溶液（表3）。利用Venn圖分析多組樣本中OTU的情況可知（圖3），連梔礬組、黃連組和梔子組溶液樣本中共劃分為2878個真菌OTUs，其中共有OTU達(dá)到418個，占總數(shù)量的43.57%；特有OTU數(shù)分別是161、129、241個，占其樣本總數(shù)的20.99%、12.38%、24.64%。連梔礬組、黃連組和梔子組溶液樣本中共劃分為1594個細(xì)菌OTUs，其中共有OTU有318個，占總數(shù)量的59.85%；特有OTU數(shù)分別是75、97、112個，占其樣本總數(shù)的14.65%、17.05%和21.83%。

表3 OTU劃分和分類地位鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)

圖3 樣品韋恩圖

3.4 α多樣性分析

3.4.1 稀釋曲線 為了探索樣本物種豐富度隨測序深度的變化趨勢，一般進(jìn)行稀釋曲線的制作。方法是從樣本中隨機(jī)抽取一定量的序列，并統(tǒng)計(jì)它們所代表的物種數(shù)目，以抽取的一系列序列數(shù)和相應(yīng)的物種數(shù)來構(gòu)建曲線。當(dāng)曲線趨于平緩時可認(rèn)為測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種，增大數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量的低豐度物種。由圖4可知，所有的發(fā)酵溶液樣本隨著測序深度的增加，曲線不斷趨于平緩，說明測序數(shù)量此時已經(jīng)足夠大，能夠覆蓋樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。

3.4.2 α多樣性指數(shù) 在群落生態(tài)學(xué)的研究中，α多樣性常用來表征樣本的物種豐富程度及多樣性，其中Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)可以反映群落物種的豐富度，Shannon指數(shù)、Inv Simpson指數(shù)可以反映群落的多樣性，它們的數(shù)值越大，菌群豐富度和多樣性越高。

圖4 稀釋曲線

不同發(fā)酵溶液樣本的α多樣性指數(shù)計(jì)算結(jié)果如表4所示，真菌群落的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)都是在黃連組中最大，其次為連梔礬組，在梔子組中的最小，說明真菌群落的豐富度大小依次為黃連組＞連梔礬組＞梔子組；Shannon指數(shù)和Inv Simpson在黃連組中最大，在連梔礬組中最小，說明真菌群落的多樣性大小依次為黃連組＞梔子組＞連梔礬組。細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)也都是在黃連組最大，在連梔礬組和梔子組中的幾乎無差異，說明細(xì)菌群落的豐富度大小依次為黃連組＞梔子組＞連梔礬組；Shannon指數(shù)和Inv Simpson在梔子組中最大，在連梔礬組中最小，說明細(xì)菌群落的多樣性大小依次為梔子組＞黃連組＞連梔礬組。在各發(fā)酵液中真菌群落的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)都顯著高于細(xì)菌群落（＜0.05），說明發(fā)酵過程中的真菌具有比細(xì)菌更高的豐富度和多樣性。

表4 樣品中微生物α多樣性指數(shù)

3.5 β多樣性分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種對數(shù)據(jù)進(jìn)行簡化分析的技術(shù)，這種方法可以有效的找出數(shù)據(jù)中最主要的元素和結(jié)構(gòu)，去除噪音和冗余，將原有的復(fù)雜數(shù)據(jù)降維，揭示隱藏在復(fù)雜數(shù)據(jù)背后的簡單結(jié)構(gòu)[26]。通過分析不同樣本群落組成可以反映樣本間的差異和距離，PCA運(yùn)用方差分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，坐標(biāo)軸取能夠最大反映樣品間差異的2個特征值。樣本物種組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近。圖5所示為發(fā)酵溶液中微生物的PCA圖，真菌和細(xì)菌的主成分分析的第1主成分和第2主成分的貢獻(xiàn)率分別為62.16%、21.2%和62.1%、27.1%，說明在PCA中所選主成分可以充分解釋原始數(shù)據(jù)中的差異。由PCA可知，3組樣品在PCA圖中分布都較分散，距離較遠(yuǎn)，說明3組樣品中真菌和細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)都差異較大。通過基于Bray-Curtis距離的樣本層級聚類分析，得到圖6所示結(jié)果，由圖可知，3組樣品在聚類圖中都分別聚為一類，真菌中連梔礬組與黃連組、梔子組的距離分別為0.12和0.32，黃連組和梔子組的距離為0.21，細(xì)菌中連梔礬組與黃連組、梔子組的距離分別為0.27和0.41，黃連組和梔子組的距離為0.19，說明3組溶液樣品中的真菌和細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)都存在較大的差異，黃連可能對發(fā)酵體系中微生物的群落結(jié)構(gòu)有一定的調(diào)節(jié)作用。

圖5 微生物群落PCA圖

圖6 基于Bray-Curtis距離的樣本層級聚類圖

3.6 各分類水平群落組成分析

3.6.1 門水平群落組成分析 不同組方發(fā)酵液中微生物群落的組成及豐度如圖7所示（圖7-A中Other表示未分類的門；圖7-B中Other表示相對豐度排名10以后的門）。真菌中的子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和羅茲菌門（Rozellomycota）的相對豐度較高，它們在連梔礬組中的豐度分別為78.55%、8.96%、5.67%，在黃連組中的豐度分別為72.25%、14.61%、5.23%，在梔子組中的豐度分別為80.48%、8.29%、3.96%。真菌中的球囊菌門（Glomeromycota，0～0.05%）、被孢霉門（Mortierellomycota，0.02%～0.05%）、毛霉門（Mucoromycota，0～0.01%）和壺菌門（Chytridiomycota，0～0.01%）等在發(fā)酵溶液中的相對豐度都極低（圖7-A）。

細(xì)菌中相對豐度排名前10的門為變形菌門（Proteobacteria，37.56%～81.34%）、厚壁菌門（Firmicutes，2.15%～52.14%）、放線菌門（Actinobacteria，6.64%～10.70%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，2.76%～4.82%）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus，0.34%～0.59%）、Kiritimatiellacota（0.07%～0.09%）、廣古菌門（Euryarchaeota，0.05%～0.07%）、綠彎菌門（Chlorolexi，0.03%～0.07%）、疣微菌門（Verrucomicrobia，0.03%～0.05%）和浮霉菌門（Planctomycetes，0.02%～0.05%）。變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門是發(fā)酵溶液中的優(yōu)勢細(xì)菌門，它們在不同組方中的豐度差異較大。連梔礬組中變形菌門的豐度極顯著低于黃連組和梔子組（＜0.01），分別為37.56%、64.24%、81.34%；厚壁菌門的豐度在連梔礬組中極顯著高于黃連組和梔子組（＜0.01），分別為52.14%、27.43%、2.15%；放線菌門和擬桿菌門的豐度在3組發(fā)酵溶液的差異較小，在連梔礬組、黃連組和梔子組中豐度分別為6.64%、4.36%、10.70%與2.76%、3.13%、4.82%（圖7-B）。

圖7 門水平微生物群落組成

3.6.2 屬水平群落組成分析 在屬水平分析了發(fā)酵溶液中高豐度物種的群落組成及豐度情況，繪制了豐度排名前10的真菌和細(xì)菌群落組成柱狀圖（圖8）。分析可知，真菌中豐度靠前的10個菌屬如圖8-A所示，其中孢霉屬spp.（14.08%～41.50%）、曲霉屬（4.43%～4.87%）、韋斯特殼屬（2.58%～12.85%）、青霉屬（1.25%～1.93%）、假絲酵母屬（1.87%～2.15%）為真菌中優(yōu)勢菌屬，這與課題組前期研究一致。比較拆方后各組優(yōu)勢真菌屬的豐度差異，發(fā)現(xiàn)曲霉屬、青霉屬和假絲酵母屬的豐度在3組發(fā)酵溶液中無明顯差異，但是孢霉屬的相對豐度在梔子組中顯著高于黃連組溶液（＜0.05），兩者都顯著低于連梔礬組溶液中豐度（＜0.05）；韋斯特殼屬的豐度在連梔礬組中顯著低于黃連組和梔子組（＜0.05），而后兩者豐度無明顯差異，說明黃連能調(diào)節(jié)發(fā)酵體系中真菌的群落豐度。

圖8 屬水平微生物群落組成

細(xì)菌群落中豐度相對靠前的菌屬為乳桿菌屬（0～50.18%）、勞爾氏菌屬（16.41%～27.45%）、醋桿菌屬（1.13%～4.10%）、節(jié)桿菌屬（2.21%～5.25%）、鞘脂單胞菌屬（2.59%～4.29%）、紅球菌屬（1.95%～5.20%）、伯克氏菌屬（2.62%～37.31%）、（3.11%～1.42%）、慢生根瘤菌屬（0.73%～1.95%）和擬桿菌屬（0～0.74%）（圖8-B）。其中乳桿菌屬、勞爾氏菌屬和的伯克氏菌屬豐度較高，是發(fā)酵中的優(yōu)勢細(xì)菌屬。比較各組優(yōu)勢細(xì)菌屬的豐度差異，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬在連梔礬組中顯著高于黃連組和梔子組（＜0.05），在黃連組中也顯著高于梔子組（＜0.05）；勞爾氏菌屬豐度在梔子組中最高，在連梔礬組中最低，3組發(fā)酵溶液中勞爾氏菌屬的豐度沒有明顯的差異；伯克氏菌屬豐度在黃連組和梔子組中無顯著差異，都顯著高于連梔礬組中的豐度（＜0.05），說明黃連也對發(fā)酵體系中細(xì)菌的數(shù)量具有調(diào)節(jié)作用。

3 討論

本研究通過對傳統(tǒng)的連梔礬溶液配方進(jìn)行拆分發(fā)酵，分析比較了不同組方發(fā)酵溶液在發(fā)酵后的化學(xué)成分變化及微生物群落特征。從各組配方組化學(xué)成分發(fā)酵前后的變化及發(fā)酵后各組之間的成分差異，可以明確組方中的梔子是在發(fā)酵過程中被微生物轉(zhuǎn)化的藥材，其主要功效成分環(huán)烯醚萜類化合物，尤其是梔子苷的轉(zhuǎn)化非常明顯，但是僅有梔子和白礬的發(fā)酵組，梔子被微生物轉(zhuǎn)化的程度大大降低，說明加入黃連共同發(fā)酵對梔子的轉(zhuǎn)化有很好的促進(jìn)作用。

從發(fā)酵后各組之間的微生物群落特征的比較后發(fā)現(xiàn)，不管是哪種配方，發(fā)酵炮制系統(tǒng)中真菌的群落豐富度和多樣性都明顯高于細(xì)菌，并且不同組間真菌和細(xì)菌的豐富度和多樣性、及群落結(jié)構(gòu)又呈現(xiàn)出不同的差異性。在發(fā)酵過程中只有配方中的藥材為發(fā)酵溶液中微生物的生長提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)，黃連、梔子都有的傳統(tǒng)配方連梔礬組溶液中的化學(xué)成分相對于另外2個拆方組來說種類和含量均占優(yōu)勢，發(fā)酵時提供給微生物生長的營養(yǎng)物質(zhì)最多，更有利于微生物的生長，但是結(jié)果表現(xiàn)為不管真菌還是細(xì)菌其豐富度和多樣性均不是最高。真菌多樣性最高的是黃連白礬組，細(xì)菌多樣性最高的是梔子白礬組。

結(jié)合課題組前期對連梔礬溶液發(fā)酵過程中真菌和細(xì)菌的演替特征的測定，發(fā)現(xiàn)真菌的豐富度和多樣性整體變化趨勢隨發(fā)酵時間的增加逐漸增加，而細(xì)菌的變化與真菌剛好相反，說明真菌和細(xì)菌之間存在相互拮抗作用。又因?yàn)辄S連在抑菌方面具有顯著的效果，因此，只有黃連的拆方組可能由于黃連的抑菌成分抑制了細(xì)菌的生長，使得體系中的真菌優(yōu)勢生長，表現(xiàn)為豐富度和多樣性均最高，而僅有梔子的拆方組由于沒有黃連，也就沒有了抑制細(xì)菌生長的抑菌成分，體系中的細(xì)菌生長旺盛，拮抗了真菌的生長，所以表現(xiàn)為細(xì)菌豐富度高而真菌豐富度低。當(dāng)黃連、梔子組合在一起進(jìn)行發(fā)酵時，黃連能發(fā)揮抑菌的作用，調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的真菌生長，使得體系中真菌與細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)均與拆方組有明顯的不同，這可能就是完全配方組中梔子的功效成分轉(zhuǎn)化率最高的原因。

因此，本研究結(jié)果證實(shí)了連梔礬溶液傳統(tǒng)配方中雖然經(jīng)過發(fā)酵黃連的主要功效成分不發(fā)生轉(zhuǎn)化，但是它通過調(diào)節(jié)自然發(fā)酵體系中的微生物群落，使得轉(zhuǎn)化梔子苷等主要功效成分的真菌處于優(yōu)勢生長，保證其轉(zhuǎn)化完全，從而在一定程度上也保證了產(chǎn)品在自然發(fā)酵工藝條件下的質(zhì)量，這也進(jìn)一步佐證了傳統(tǒng)配方制劑的合理性和科學(xué)性。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Based on high-throughput sequencing and chemical profiling to study role ofin concocting of Lianzhifan solution

WU Ze1, DU Juan2, XIE-Jie1, GOU Xun1, PENG Ling1, YE Yang1, ZHANG Xiao-yu1, YUAN Xue-gang3, YUAN Yu-ting1, SHI Ying-xin1

1. College of Life Science, Sichuan Normal University, Chengdu 610101, China 2. College of Geography and Resource Science, Sichuan Normal University, Chengdu 610101, China 3. The Sixth People’s Hospital of Chengdu, Chengdu 610058, China

To investigate the role of Huanglian () in the traditional fermentation processing of Lianzhifan solution.According to the traditional formula ratio of Lianzhifan solution, it was divided into three groups of formula solutions: Lianzhifan group [Huanglian () + Zhizi () + Baifan () (LZF)],group [+(CR)], andgroup [+(GF)]. The chemical composition changes of the three groups of solutions before and after fermentation were analyzed and compared by HPLC. Illumina Hiseq high-throughput sequencing technology was used to determine and compare the community characteristics of microorganisms in the fermentation solution.The iridoid composition of the traditional formula LZF group has undergone significant changes after fermentation (< 0.05), and the alkaloid composition has not changed significantly. The alkaloid composition in CR and the iridoids in GF did not change significantly after fermentation. The fermentation solutions of each group were sequenced. According to the results of α diversity analysis, the fungal diversity in the three fermentation broths was LZF < GF

Lianzhifan solution;; high-throughput sequencing; chemical profile analysis; microbial diversity; fermentation; processing; community characteristics; iridoids; alkaloids; α diversity analysis; β diversity analysis; fungi; bacteria

R283.1

A

0253 - 2670(2021)06 - 1623 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.06.010

2020-11-12

四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2020YJ0372）

吳 澤（1993—），男，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。Tel: 18123346194 E-mail: 906264997@qq.com

謝 潔 Tel: 13880757684 E-mail: xiejaye@163.com

張曉喻 Tel: 13060005523 E-mail: zhangxy2005@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]