譚昊曲，王勁柏，白薇，彭洪薇，胡錦芳*

（1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科 南昌 330006；2南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西省轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院南昌 330006）

目前，我國每年新增肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）病例約占全球總新增HCC病例的45%，是全球HCC發(fā)病率最高的國家[1]。盡管早期HCC患者根治性肝切除術(shù)或肝移植后，5年生存率可達(dá)80%以上[2]；但HCC早期并沒有明顯癥狀，僅少數(shù)早期患者能通過影像學(xué)檢測(cè)其他疾病時(shí)發(fā)現(xiàn)病變，而絕大多數(shù)HCC患者確診時(shí)已經(jīng)達(dá)到中晚期。對(duì)于中期有手術(shù)機(jī)會(huì)的HCC患者，采取手術(shù)切除聯(lián)合化療、介入、無水酒精灌注和射頻等為輔的綜合治療，但據(jù)流行病學(xué)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，其術(shù)后5年生存率仍不足5%[3]。造成HCC術(shù)后預(yù)后不良的主要因素為復(fù)發(fā)和肝內(nèi)或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，但術(shù)后的化療、介入、無水酒精灌注和射頻等手段的全身毒副作用較大且療效不盡人意，因此，尋找能抑制HCC術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移且毒副作用較低的治療策略刻不容緩。

熊果酸（ursolic acid，UA）是一種五環(huán)三萜類化合物，其對(duì)包含HCC細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞均有抑制增殖作用[4,5]。但以往關(guān)于UA對(duì)HCC細(xì)胞的研究，并未指明其抑制HCC細(xì)胞的劑量是否具有對(duì)正常細(xì)胞的毒性，且其在低毒或無毒劑量下的UA對(duì)HCC的增殖和遷移以及侵襲的影響和機(jī)制并不完全清楚。因此，本研究首先采取不同劑量的UA刺激HCC細(xì)胞并觀察此劑量下UA對(duì)肝正常細(xì)胞的毒性，篩選無毒的UA劑量；繼而選取無毒的UA劑量研究對(duì)HCC細(xì)胞侵襲與遷移的影響，并分析其機(jī)制。

材料與方法

1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；BCA試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、CCK‐8試劑盒和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和端粒酶活性熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；miR‐148a‐3p抑制劑（miR‐148a‐3p inhibitor）、miR‐148a‐3p模擬物（miR‐148a‐3p mimic）、miR陰性對(duì)照（miR‐NC）、孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）shRNA載體（sh‐PXR）、sh‐NC、PXR過表達(dá)載體（pcDNA‐PXR）和空載體（pcDNA）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；RIPA試劑盒、兔抗GAPDH抗體與HRP或DyLight 488標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程公司；兔抗PXR抗體購自英國Abcam公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng)與UA劑量篩選

正常肝細(xì)胞系（HL‐7702和HHL‐5）和HCC細(xì)胞系（BEL‐7404、Huh7、SMMC‐7721和HepG2）購自武漢普諾賽生命科技有限公司，均培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，每2~3 d換液一次。取生長期的上述細(xì)胞分別用0、5、10、20、40和80 μmol/L的UA刺激48 h，用CCK‐8法篩選對(duì)正常肝細(xì)胞系無毒且能抑制HCC細(xì)胞系細(xì)胞活性的劑量濃度。

3 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲與遷移

取HepG2細(xì)胞，用已篩選的UA劑量處理48h后，然后用無血清的DMEM培養(yǎng)基制作細(xì)胞懸液。將100 μL細(xì)胞懸液分別加入測(cè)定細(xì)胞侵襲（鋪基質(zhì)膠）與遷移（未鋪基質(zhì)膠）的Transwell小室的上室中，下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用無水甲醇固定已穿至Transwell小室底膜下表面上的細(xì)胞，并用結(jié)晶紫染色，顯微鏡下對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。

4 RT-qPCR檢測(cè)miR-148a-3p表達(dá)水平

取HepG2細(xì)胞，用已篩選的UA劑量處理48h后，收集細(xì)胞。用Trizol試劑提取RNA，并經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)為cDNA。取引物和cDNA，用端粒酶活性熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)試劑盒在ABI7400熒光實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行RT‐qPCR反應(yīng)。并以U6為內(nèi)參，用2‐△△CT法計(jì)算miR‐148a‐3p相對(duì)表達(dá)水平。

5 免疫熒光法觀察PXR的表達(dá)

收集UA處理48 h的HepG2細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定后，用0.5%Triton X‐100室溫通透5 min，用PBS洗滌后加入兔源PXR抗體（1:1500）室溫孵育1 h，再次用PBS洗滌后加入DyLight 488標(biāo)記山羊抗兔IgG（1:1000）室溫避光孵育40min，滴加DAPI染核后，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與功能分析

收集HepG2細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書步驟，用Lipofectamine 2000對(duì)細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR‐NC、

miR‐148a‐3p inhibitor、miR‐148a‐3p mimic、sh‐NC、sh‐PXR、pcDNA或pcDNA‐PXR，轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，然后再用或不用40 μmol/L的UA刺激48h。用CCK‐8法檢測(cè)細(xì)胞活性，用Tranwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲與遷移，用RT‐qPCR檢測(cè)檢測(cè)PXR mRNA的相對(duì)表達(dá)量（GAPDH mRNA為內(nèi)參，檢測(cè)步驟同4）。

7 Western blot檢測(cè)PXR的表達(dá)

收集已處理的HepG2細(xì)胞，用RIPA提取蛋白后，用BCA法對(duì)蛋白定量后，每樣品取等量（40μg）蛋白進(jìn)行電泳。將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上并用5%脫脂乳封閉。封閉后，將膜轉(zhuǎn)移至抗體孵育盒，并用兔抗PXR抗體（1:1000）和兔GAPDH抗體（1:5000）在室溫下孵育2 h，用含0.05%吐溫‐20的PBS溶液洗滌3次后，用HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（1:1000）室溫孵育1 h，再次用含0.05%吐溫‐20的PBS溶液洗滌3次。用ECL化學(xué)發(fā)光試劑使得蛋白條帶發(fā)光顯色，并用eBlot接觸式化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海易孛特光電技術(shù)有限公司）采集蛋白條帶圖像。用Image‐pro Plus軟件定量PXR相對(duì)于GAPDH條帶的光密度值。

8 雙熒光素酶報(bào)告基因分析miR-148a-3p與PXR的靶向關(guān)系

將StarBase 3.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)的與miR‐148a‐3p具有結(jié)合的PXR靶序列3’UTR‐PXR進(jìn)行點(diǎn)突變。分別用PCR將野生型（WT）和突變型（MUT）的PXR擴(kuò)增，然后構(gòu)建WT和MUT的PXR的熒光素酶表達(dá)載體（PXR WT和PXR MUT）。用Lipofectamine 2000分別將miR‐NC+PXR WT、miR‐148a‐3p mim‐ic+PXR WT、miR‐NC+PXR MUT和miR‐148a‐3p mimic+PXR MUT轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48h。收集細(xì)胞，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒步驟，用熒光化學(xué)發(fā)光分析儀（Fluoroskan FL；美國Thermo Scientific公司）檢測(cè)螢火蟲熒光素酶的活性與海腎熒光素酶的活性，細(xì)胞的相對(duì)熒光活性以二者比值表示。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s），用GraphPad Prism 7.02軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組均數(shù)間的兩兩比較采用方差分析事后SNK-q法檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 40μmol/L熊果酸對(duì)正常肝細(xì)胞系無毒且能抑制HCC細(xì)胞活性

CCK‐8檢測(cè)顯示：在0~80 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，UA濃度依賴性地抑制HCC細(xì)胞系（BEL‐7404、Huh7、SMMC‐7721和HepG2）的細(xì)胞活性；而在80 μmol/L時(shí)，UA對(duì)正常肝細(xì)胞系（HL‐7702和HHL‐5）也具有細(xì)胞毒性（圖1），因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇0~40 μmol/L的UA。

圖1 適宜熊果酸濃度的篩選。A，不同濃度熊果酸下的HCC細(xì)胞系的細(xì)胞活性。B，不同濃度熊果酸下的正常肝細(xì)胞系的細(xì)胞活性。與0μmol/L組比較：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；n=3Fig. 1 Screening for suitable ursolic acid concentration. A, cell viability of HCC cell lines treated with different concentrations of ursolic acid; B, cell viability of normal liver cell lines treated with different concentrations of ursolic acid. Compared with group 0 μmol/L: *P＜0.05, **, P＜0.01, ***,P＜0.001; n=3

2 熊果酸抑制HepG2細(xì)胞的活性、遷移與侵襲

CCK‐8法和Transwell小室法檢測(cè)顯示：0~40 μmol/L的UA能濃度依賴性抑制HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活性、遷移與侵襲（圖2）。

圖2 熊果酸對(duì)HepG2細(xì)胞活性、遷移與侵襲的影響。A，熊果酸對(duì)HepG2細(xì)胞活性影響的CCK‐8法檢測(cè)。B，熊果酸對(duì)HepG2細(xì)胞遷移與侵襲影響的Transwell法分析；B1，細(xì)胞遷移與侵襲力代表性Transwell分析結(jié)果（比例尺，50 μm）；B2和B3，細(xì)胞遷移（B2）與侵襲力（B3）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與0 μmol/L組比較：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；n=3Fig. 2 Effect of ursolic acid on the viability, migration and invasion of HepG2 cells. A, statisctical analysis of CCK‐8 assay for the effect of ursolic acid on the viabilities of HepG2 cells; B, Transwell analysis for the effect of ursolic acid on migration and invasion of HepG2 cells; B1, representative results of migration and invasion of HepG2 cells (scale bar, 50 μm); B2 and B3, statistical analysis of migration (B2) and invasion (B3) of HepG2 cells.*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, compared with 0 μmol/L group; n=3

3 熊果酸上調(diào)HepG2細(xì)胞中miR-148a-3p的表達(dá)

qRT‐PCR檢測(cè)顯示：0~40 μmol/L的UA能濃度依賴性地上調(diào)HepG2細(xì)胞中miR‐148a‐3p的表達(dá)水平（圖3）。

圖3 熊果酸對(duì)HepG2細(xì)胞中miR‐148a‐3p表達(dá)的影響。與0 μmol/L組比較：*P＜0.05，**P＜0.01, ***P＜0.001；n=3Fig. 3 Effect of ursolic acid on the expression of miR‐148a‐3p in HepG2 cells. Compared with 0 μmol/L group: *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001;n=3

4 miR-148a-3p inhibitor部分逆轉(zhuǎn)熊果酸對(duì)HepG2細(xì)胞活性、遷移與侵襲的抑制作用

CCK‐8法和Transwell小室法檢測(cè)顯示：與miR‐NC組比較，UA+miR‐NC組HepG2細(xì)胞的活性、遷移與侵襲均明顯降低；與UA+miR‐NC組比較，UA+miR‐148a‐3p inhibitor組HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活性、遷移與侵襲均明顯增加（圖4）。

圖4 miR‐148a‐3p 抑制劑對(duì)熊果酸抑制HepG2細(xì)胞活性、遷移與侵襲作用的影響。A，各組HepG2細(xì)胞活性。B—D，HepG2細(xì)胞的遷移與侵襲；比例尺，50μm。與miR‐NC組比較：***P＜0.01；與UA+miR‐NC組比較：##P＜0.01；n=3。Fig. 4 Effect of miR‐148a‐5p inhibitor on the inhibitory effects of ursolic acid on cell viability, migration and invasion of HepG2 cells. A, statisctical analysis of HepG2 cells viability; B to D, migration and invasion of HepG2 cells; scale bar, 50 μm. ***P＜0.001 vs miR+NC group; ##P＜0.01 vs UA+miR‐NC group; n=3

5 熊果酸和miR-148a-3p抑制孕烷X受體表達(dá)

免疫熒光染色顯示，在UA處理的HepG2細(xì)胞中，PXR免疫反應(yīng)性明顯減弱，其中40μmol/L的UA較10 μmol/L的UA作用更明顯（圖5A）。進(jìn)一步Western blot分析驗(yàn)證UA可降低PXR蛋白的表達(dá)（圖5B）。雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示：過表達(dá)miR‐148a‐3p顯著抑制PXR轉(zhuǎn)錄活性，PXR是miR‐148a‐3p的靶基因（圖5C）。RT‐qPCR和Western blot顯示：過表達(dá)miR‐148a‐3p能顯著降低HepG2細(xì)胞中PXR水平（圖5D、E）。

圖5 熊果酸和miR‐148a‐3p對(duì)PXR表達(dá)的影響。A，熊果酸對(duì)HepG2細(xì)胞PXR免疫反應(yīng)性影響的免疫熒光分析；A1，代表性免疫熒光檢測(cè)結(jié)果（比例尺，100μm）；A2， PXR免疫反應(yīng)性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。B，熊果酸對(duì)HepG2細(xì)胞PXR水平影響的Western blot分析；C，miR‐148a‐3p靶向的雙熒光素酶報(bào)告基因分析。D和E，miR‐148a‐3p對(duì)PXR表達(dá)影響的RT‐qPCR（D）和Western blot檢測(cè)（E）。與0 μmol/L組或miR‐NC組比較：**P＜0.01，***P＜0.01；n=3Fig. 5 Effects of ursolic acid and miR‐148a‐3p on PXR expression. A, immunofluorescence analysis of the effect of ursolic acid on PXR expression in HepG2 cells; A, representative results of immunofluorescence examination (scale bar, 100 μm); B, Western blot analysis of the effect of UA on PXR expression in HepG2 cells; C, analysis by duel‐luciferase reporter gene for mir‐148a‐3p targeting; D and E, detection by RT‐qPCR (E) and Western blot(F) for effect of miR‐148a‐3p on PRX expression. **P＜0.01, ***P＜0.001, compared with 0 μmol/L group or miR‐NC group; n=3

6 沉默PXR抑制HepG2細(xì)胞的活性、遷移與侵襲

通過轉(zhuǎn)染sh‐PXR沉默細(xì)胞中PXR表達(dá)（圖6A），CCK‐8和Transwell小室法分析表明：沉默PXR能抑制HepG2細(xì)胞的活性、遷移與侵襲（圖6B、C）。

圖6 沉默PXR對(duì)HepG2細(xì)胞活性、遷移與侵襲的影響。A，沉默效果驗(yàn)證；A1，代表性Western blot檢測(cè)結(jié)果；A2,PXR水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。B，CCK‐8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染sh‐PXR對(duì)HepG2細(xì)胞活性影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。C，轉(zhuǎn)染sh‐PXR對(duì)HepG2細(xì)胞遷移與侵襲影響的Transwell法分析；C1, 轉(zhuǎn)染sh‐PXR對(duì)HepG2細(xì)胞遷移與侵襲影響的代表性Transwell檢測(cè)結(jié)果（比例尺，100μm）；C2和C3，轉(zhuǎn)染sh‐PXR對(duì)HepG2細(xì)胞遷移（C2）與侵襲（C3）影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與對(duì)照組比較：***P＜0.001；n=3Fig. 6 Effect of PXR silencing on the viability, migration and invasion of HepG2 cells. A, verification of silence effect; A1, representative Western blot test results; A2, statistical analysis of PXR level; B, CCK‐8 analysis for the effect of sh‐PXR transfection on the viability of HepG2 cells; C, Transwell analysis for the effect of sh‐PXR transfection on the migration and invasion of HepG2 cells; C1, representative Transwell test results of the effect of sh‐PXR transfection on the migration and invasion of HepG2 cells (scale bar, 100μm); C2 and C3, statistical analysis of the effects of sh‐PXR transfection on migration (C1) and invasion (C2) of HepG2 cells. ***P＜0.001, compared with control group; n=3

7 過表達(dá)PXR減輕熊果酸對(duì)HepG2細(xì)胞活性、遷移和侵襲的抑制作用

為明確UA是否通過抑制PXR的表達(dá)而抑制HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，進(jìn)一步檢測(cè)了過表達(dá)PXR的HepG2細(xì)胞其在UA處理后活力、侵襲和遷移的變化。Western blot檢測(cè)顯示，過表達(dá)PXR能抑制UA所致的HepG2細(xì)胞PXR水平降低（圖7A）；CCK ‐8和Transwell分析顯示，過表達(dá)PXR能顯著減輕UA所致的HepG2細(xì)胞活力、侵襲力和遷移能力的下降（圖7B、C）。

圖7 過表達(dá)PXR對(duì)熊果酸抑制HepG2細(xì)胞活力、遷移和侵襲作用的影響抑制作用。A，過表達(dá)PXR 對(duì)UA處理HepG2細(xì)胞內(nèi)PXR水平的影響；A1，PXR水平的代表性Western blot檢測(cè)結(jié)果；PXR水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。B，過表達(dá)PXR對(duì)UA處理HepG2細(xì)胞活力影響的CCK‐8法檢測(cè)。C，過表達(dá)PXR對(duì)UA處理HepG2細(xì)胞侵襲和遷移影響的Transwell法分析；C1，代表性Transwell檢測(cè)結(jié)果（比例尺，100μm）；C2，侵襲力統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；C3，遷移力統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與pcDNA組比較： ***P＜0.01；與UA+pcDNAr組比較：###P＜0.01；n=3Fig. 7 Effects of PXR overexpression on the inhibitory effects of ursolic acid on the viability, migration and invasion of HepG2. A, effect of PXR overexpression on PXR level in UA treated HepG2 cells; A1, representative Western blot results of PXR level; A2, statistical analysis of PXR level;B, the effect of PXR overexpression on the viability of UA treated HepG2 cells detected by CCK‐8 method; C, Transwell analysis of the effect of PXR overexpression on the invasion and migration of UA treated HepG2 cells; C1, representative Transwell test results (scale bar, 100 μm); C2, statistical analysis of cell invasivon; C3, statistical analysis of cell migration. ***P＜0.01, **P＜0.01, compared with pcDNA vector group; ###P＜0.01, compared with UA + pcDNA group; n=3

討 論

目前，肝癌切除術(shù)后輔以的綜合治療策略存在毒副作用大且療效不盡人意的缺點(diǎn)[3]，因此，尋找毒副作用小且能具有防止HCC再次復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的治療策略尤為迫切。以往研究[4,5]報(bào)道，UA能抑制包含HCC細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的增殖，但其劑量范圍并未做到精確分析。本研究發(fā)現(xiàn)，無正常肝細(xì)胞毒性劑量的UA能抑制HepG2細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，提示UA是潛在的可用于肝癌切除術(shù)后綜合治療的替代藥物。

本研究進(jìn)一步對(duì)UA抑制HCC細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的作用機(jī)制進(jìn)行了探索。已有研究[6‐8]表明，miR‐148a‐3p在胃癌、食管癌和HCC等多種惡性腫瘤中低表達(dá)，過表達(dá)miR‐148a‐3p能抑制上述腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲。本研究結(jié)果顯示，UA能濃度依賴性上調(diào)HepG2細(xì)胞中miR‐148a‐3p的表達(dá)水平，且miR‐148a‐3p inhibitor轉(zhuǎn)染能部分逆轉(zhuǎn)UA的治療作用，說明UA能通過上調(diào)miR‐148a‐3p來發(fā)揮抑制HCC細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的作用。眾所周知，miRNAs是通過調(diào)控靶基因來發(fā)揮生物學(xué)功能。本研究進(jìn)一步對(duì)miR‐148a‐3p的靶基因進(jìn)行了探索，結(jié)果顯示PXR是其靶基因。已有研究[9,10]明確顯示，上調(diào)PXR能促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，且下調(diào)PXR能抑制肝癌的發(fā)生與進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，UA能抑制HepG2細(xì)胞中PXR的表達(dá)，且沉默PXR具有UA類似的效果，另外，過表達(dá)PXR后能消除UA處理對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用，以上表明UA可通過上調(diào)miR‐148a‐3p表達(dá)及由此抑制PXR的表達(dá)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。這初步揭示了熊果酸對(duì)肝癌細(xì)胞抑制作用的分子機(jī)制。

綜上所述，無正常肝細(xì)胞毒性劑量的UA能抑制HepG2細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，且這些作用可能與其調(diào)節(jié)miR‐148a‐3p/PXR軸相關(guān)。本研究還提示，UA可能是肝癌術(shù)后綜合治療的替代藥劑，但具體作用仍需進(jìn)一步探索。