常新會(huì)，司海超，徐宏超

（1南陽(yáng)市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，南陽(yáng) 473000；2南陽(yáng)市中心醫(yī)院麻醉科，南陽(yáng) 473000）

缺血性腦血管疾病是腦血管疾病的主要類(lèi)型，占腦血管疾病患者總數(shù)的60%~80%[1]。缺血性腦血管病的發(fā)病機(jī)制主要包括腦損傷以及腦神經(jīng)元變性和死亡，其中自噬作用在這此過(guò)程中起到重要作用[2,3]。自噬是缺血和缺氧條件下機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)[4]，因此，局灶性腦缺血/再灌注（ischemia reperfusion，I/R）可以激活自噬。自噬是細(xì)胞成分通過(guò)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體進(jìn)行降解的過(guò)程。在真核生物中，自噬不僅涉及如生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝和免疫等生理過(guò)程，而且還涉及如腦缺血、心肌缺血和腎缺血等病理過(guò)程[5]。另外，溫和的自噬具有神經(jīng)保護(hù)作用，而過(guò)激的自噬則能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的死亡[6,7]。因此，研究自噬在腦I/R中的作用非常重要。

星狀神經(jīng)節(jié)阻滯（stellate ganglion block，SGB）已被廣泛應(yīng)用于臨床鎮(zhèn)痛。先前的研究[8]表明SGB能減輕失血性休克后的損傷，并改善動(dòng)物的生存條件。此外，SGB模擬的交感神經(jīng)切斷術(shù)能降低膿毒癥大鼠的器官損傷[9]。然而，SGB對(duì)腦I/R損傷的機(jī)制仍不清楚。研究[2,3]表明，自噬和凋亡參與了I/R后神經(jīng)元細(xì)胞損傷的過(guò)程，提示自噬和凋亡可能是神經(jīng)元損傷的重要貢獻(xiàn)者。然而，SGB對(duì)I/R引起的腦神經(jīng)元損傷抑制作用是否與抑制自噬和凋亡有關(guān)仍不清楚。我們假設(shè)SGB對(duì)I/R引起的腦神經(jīng)元損傷的有益作用是通過(guò)抑制自噬和凋亡而實(shí)現(xiàn)的，為驗(yàn)證這一假設(shè)，我們檢測(cè)了SGB對(duì)腦I/R大鼠的影響，并探索了與凋亡和自噬通路相關(guān)的蛋白表達(dá)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑（盒）和抗體

36只SPF級(jí)7~8周齡雄性SD大鼠（290~310g）購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（SCXK（豫）2017－0001）。2,3,5氯化三苯基四氮唑（2,3,5‐Triphen‐yltetrazolium chloride，TTC）染液和HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），TUNEL染色試劑盒和組織蛋白提取試劑盒（中國(guó)北京中山金橋生物技術(shù)有限公司），ECL發(fā)光底物和BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。兔抗Cleaved Caspase‐3抗體、兔抗GAPDH抗體以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)二抗（武漢博士德生物工程有限公司），兔抗LC3抗體和兔抗beclin1抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）。

2 實(shí)驗(yàn)造模及處理

將大鼠飼養(yǎng)在屏障環(huán)境的動(dòng)物房中，并使其自由飲食物和水。所有大鼠飼養(yǎng)性飼養(yǎng)3 d后，按照隨機(jī)數(shù)字法分為3組：假手術(shù)（Sham）組，I/R組和I/R+SGB組，每組12只。I/R組大鼠在術(shù)前先將大鼠禁食10 h，然后用10%水合氯醛（380 mg/kg）麻醉后，沿頸部正中線切開(kāi)一個(gè)切口，并通過(guò)鈍器分離使肌肉和筋膜沿著胸鎖乳突肌分開(kāi)，暴露右頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，隨后，斜切頸外動(dòng)脈，小心地將氨綸細(xì)絲尼龍縫線（直徑0.2 mm）遠(yuǎn)端插入約18 mm并打一活結(jié)，以阻塞大腦中動(dòng)脈，在腦缺血2 h后，將縫線活結(jié)緩慢松開(kāi)以實(shí)現(xiàn)再灌注。Sham組大鼠僅分離動(dòng)脈，不予I/R操作；I/R+SGB組大鼠在水合氯醛麻醉后，先在左側(cè)頸靜脈切口入路阻斷星狀神經(jīng)節(jié)1 h后，再做I/R手術(shù)。I/R術(shù)后4 h，待大鼠蘇醒后，將發(fā)生抽搐和持續(xù)意識(shí)障礙的大鼠剔除實(shí)驗(yàn)，最終，Sham組納入12只大鼠，I/R組和I/R+SGB組均納入11只大鼠。

3 局部腦血流量測(cè)量

I/R術(shù)后7 d，腹腔注射水合氯醛使大鼠深度麻醉，將大鼠仰臥位固定，并用加熱墊使其體溫維持在37~38℃。沿顱骨中線切開(kāi)頭皮，用骨水泥激光多普勒血流儀探頭固定在顱骨矢狀縫右2 mm，管狀縫前1 mm處。測(cè)量右半球的區(qū)域局部腦血流量（regional cerebral blood flow，rCBF），并用moorLDIMeasV60數(shù)據(jù)采集和分析系統(tǒng)對(duì)rCBF進(jìn)行量化。

4 腦梗死體積的測(cè)量

rCBF測(cè)量后，每組任選5只大鼠麻醉后處死，迅速取出大腦并在‐40°C下冷凍20 min。然后用切片機(jī)制備2 mm厚度連續(xù)冠狀切片，并用4%多聚甲醛固定，隨后在37%的條件下用0.5%TTC染色30 min。梗死的組織呈蒼白色，而正常組織則染紅色。對(duì)切片拍照，并用Image J軟件計(jì)算梗塞面積。梗死體積=腦片厚度（2 mm）×梗塞面積。根據(jù)以下公式將梗塞區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)化至對(duì)側(cè)半球以消除局部缺血造成水腫干擾：校正后的梗死區(qū)域=測(cè)量的梗死區(qū)域+對(duì)側(cè)對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的區(qū)域‐同側(cè)對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的區(qū)域。結(jié)果以半球總體積的百分比表示。

5 HE染色

剩余的大鼠處死后，取腦并固定在4%多聚甲醛溶液中。將腦組織用石蠟包埋并切成4 μm厚度的冠狀切片。腦片經(jīng)常規(guī)程序的脫蠟至水后，用蘇木素將腦組織切片染色15 min，用自來(lái)水沖洗。用0.1%鹽酸乙醇分化切片30 s，在自來(lái)水中浸泡15 min，然后用伊紅染色5 min。常規(guī)脫水、透明和封片后，用BX51顯微鏡（Olympus，日本）白光視野下觀察。

6 TUNEL染色

將大鼠缺血半影區(qū)或Sham組同位置的腦組織切片（4 μm）經(jīng)常規(guī)程序的脫蠟至水后，按照試劑盒方法，滴加20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K，37℃作用20 min，PBS洗3次；滴加50 μL FITC標(biāo)記的TdT酶試劑，37℃作用45 min，PBS洗3遍；隨后使用5 mg/mL DAPI試劑在室溫復(fù)染細(xì)胞核3 min。在BX51熒光顯微鏡（Olympus，日本）×20物鏡視野下觀察，并隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性染色的細(xì)胞數(shù)量，并將陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)的比率記為凋亡率。

7 透射電子顯微鏡觀察

將分離的缺血半影區(qū)或Sham組同位置的腦組織固定在2.5%戊二醛溶液中。丙酮脫水后，將樣品用金相熱埋樹(shù)脂包埋，制備1 μm厚度的切片。然后在體視光學(xué)顯微鏡下用EM UC7超薄切片機(jī)（Lecia，奧地利）制成厚度為60 nm的超薄切片。將超薄切片用檸檬酸鉛染色10 min，用不含CO2的雙蒸餾水清洗。樣品用醋酸鈾染色30 min，用雙蒸餾水洗滌并干燥。使用JEM‐1400透射電鏡（JEOL，日本）觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)并拍照。

8 Western blot檢測(cè)

將缺血半影區(qū)或Sham組同位置的腦組織切碎并在冰冷的RIPA裂解緩沖液中勻漿。收集溶解的蛋白質(zhì)，并在4℃下以12000 r/min離心5min以除去碎片。用BCA蛋白測(cè)定試劑定量總蛋白濃度。將等量蛋白上樣并行SDS‐聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將電泳的蛋白電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶封閉膜40 min后，使用針對(duì)LC3、beclin1和cleaved caspase 3和GAPDH的特異性抗體在4°C下孵育過(guò)夜。用TBST洗滌3次后，將其與相應(yīng)的第二抗體在室溫下孵育1 h。用ECL試劑和凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）對(duì)膜條帶顯像，并用Image J軟件計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件采用單因素方差分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05則認(rèn)為差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 星狀神經(jīng)節(jié)阻滯術(shù)前處理減輕I/R引起的病理性腦損傷

在實(shí)施SGB術(shù)后7 d，對(duì)大鼠腦冠狀切片進(jìn)行TTC染色以評(píng)估I/R損傷后腦梗死的程度。如圖1A和1B所示，假手術(shù)組沒(méi)有腦梗死，而I/R組呈現(xiàn)明顯的梗死區(qū)域；與I/R組相比，I/R+SGB組大鼠腦梗死體積顯著降低。隨后通過(guò)HE染色檢測(cè)梗塞區(qū)域的邊界，以觀察缺血半影區(qū)中的神經(jīng)元形態(tài)。如圖1C所示，假手術(shù)組中的神經(jīng)元沒(méi)有明顯的病理學(xué)改變，而I/R組的缺血性半影區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)松散和萎縮結(jié)構(gòu)，以及縮突核深染，SGB前處理可逆轉(zhuǎn)I/R誘導(dǎo)的這一現(xiàn)象；此外，I/R組中的許多神經(jīng)元失去了結(jié)構(gòu)完整性，并顯示出明顯的核仁分解；與I/R組相比，SGB前處理可顯著減少神經(jīng)元損傷，抑制神經(jīng)元腫脹并恢復(fù)缺血半影區(qū)神經(jīng)元的排列。

圖1 星狀神經(jīng)節(jié)阻滯術(shù)前處理對(duì)I/R誘導(dǎo)的腦損傷的影響。A，TTC染色的大腦冠狀切片。B，由TTC染色的切片厚度和梗塞面積計(jì)算的梗塞體積統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與Sham組相比，###P＜0.001；與I/R組相比，**P＜0.01；n=5。C，缺血半影區(qū)的代表性HE染色圖像；比例尺，150μmFig. 1 Effect of stellate ganglion block pretreatment on I/R‐induced brain injury. A, TTC stained coronal sections of the rat cerebrum; B, statistical anal‐ysis of infarct volume calculation from thickness and infarct area of TTC stained slices; ###P＜0.001, compared with Sham group; **P＜0.01, compared with I/R group; n=5; C, representative HE staining images of ischemic penumbra; scale bar, 150μm

2 星狀神經(jīng)節(jié)阻滯術(shù)前處理抑制I/R后大鼠局部腦血流量降低

通過(guò)激光多普勒血流儀系統(tǒng)對(duì)大鼠rCBF進(jìn)行測(cè)定（rCBF的大小以不同的顏色顯示，藍(lán)色到紅色表示從低到高），結(jié)果顯示，與Sham組比較，I/R組rCBF明顯降低；與I/R組相比，SGB前處理可使rCBF顯著增加（圖2），說(shuō)明SGB前處理可恢復(fù)I/R后大鼠的rCBF。

圖2 星狀神經(jīng)節(jié)阻滯術(shù)前處理對(duì)腦I/R大鼠rCBF的影響。A，同側(cè)皮質(zhì)rCBF代表性結(jié)果；B，rCBF統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與Sham組相比，###P＜0.001；與I/R組相比，**P＜0.01；n=11或12Fig. 2 Effect of stellate ganglion block pretreatment on rCBF in rats with cerebral I/R. A, representative results of rCBF in the ipsilateral cortex; B,statistical analysis of rCBF; ###P＜0.001, compared with Sham group; **P＜0.01, compared with I/R group; n=11 or 12

3 SGB前處理可降低I/R后大鼠缺血半影區(qū)神經(jīng)元凋亡

采用TUNEL法評(píng)估大鼠缺血半影區(qū)神經(jīng)元凋亡。如圖3所示，Sham組同位置腦切片中TUNEL陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量極少，細(xì)胞排列整齊；與Sham組相比，I/R組缺血半影區(qū)的TUNEL陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)目顯著增加；與I/R組相比，I/R+SGB組缺血半影區(qū)的TUNEL陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)目顯著減少，染色度降低。

圖3 星狀神經(jīng)節(jié)阻滯術(shù)前處理對(duì)大鼠I/R后缺血半影區(qū)中細(xì)胞凋亡的影響。A，缺血半影區(qū)的TUNEL染色的代表性圖像；比例尺，150μm。B，凋亡率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。與Sham組相比，###P＜0.001；與I/R組相比，**P＜0.01；n=6或7Fig. 3 Effect of stellate ganglion block pretreatment on apoptosis of ischemic penumbra in rats after I/R. A, representative TUNEL staining images of ischemic penumbra; scale bar, 100μm; B, statistical analysis of apoptosis rate; ###P＜0.001, compared with Sham group; **P＜0.01, compared with I/R group; n=6 or 7

4 SGB前處理可降低I/R后大鼠缺血半影區(qū)神經(jīng)元自噬和凋亡水平

采用透射電鏡觀察缺血半影區(qū)神經(jīng)元自噬。如圖4A所示，Sham組缺血半影區(qū)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器正常，線粒體的結(jié)構(gòu)正常，而沒(méi)有溶酶體或雙層膜結(jié)構(gòu)；I/R組缺血半影區(qū)神經(jīng)元周?chē)黠@水腫，線粒體嵴斷裂，并產(chǎn)生嚴(yán)重空泡結(jié)構(gòu)，同時(shí)，I/R組中觀察到了雙層或單層膜的自噬體，并且溶酶體的數(shù)量增加；與I/R組相比，I/R+SGB組的自噬程度有所降低，水腫和空化的程度有所降低。Western blot檢測(cè)顯示，I/R后腦缺血半影區(qū)中Cleaved Caspase‐3和beclin1水平以及LC3Ⅱ/LC3I的比值均顯著升高，而SGB前處理能顯著降低I/R誘導(dǎo)的上述蛋白水平的升高。

圖4 星狀神經(jīng)節(jié)阻滯術(shù)前處理對(duì)I/R后缺血半影區(qū)自噬和凋亡的影響。A，神經(jīng)元自噬的透射電鏡觀察；比例尺，10μm。B，Cleaved Caspase‐3、beclin1和LC3水平的代表性Western blot檢測(cè)結(jié)果；C，Cleaved Caspase‐3水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；D，beclin 1水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；E. LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與Sham組相比：###P＜0.001；與I/R組相比：**P＜0.01；n=6Fig. 4 Effect of stellate ganglion block pretreatment on autophagy and apoptosis in ischemic penumbra after I/R. A, transmission electron microscopic observation on autophagy of neurons; scale bar, 10μm; B, representative results of Western blotting detection for the levels of Cleaved Caspase‐3, be‐clin1 and LC3; C, statistical analysis for the relative levels of Cleaved Caspase‐3; D, statistical analysis for the relative levels of beclin1; E, statistical analysis for the ratio of LC3Ⅱ/LC3 I; ###P＜0.001, compared with Sham group; **P＜0.01, ***P＜0.001, compared with I/R group; n=6

討 論

中風(fēng)是世界上第三大死亡原因，也是成人神經(jīng)系統(tǒng)殘疾的主要原因[10]。 此外，約有80%的中風(fēng)病例歸因于原發(fā)性腦缺血[11]。中斷大腦的血供會(huì)誘發(fā)包括興奮性毒性、酸毒性、離子失衡、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和炎癥等一系列分子事件，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和腦組織損傷[12]。因此，開(kāi)發(fā)有效的治療腦缺血的方法具有重要意義。星狀神經(jīng)節(jié)為頭部、頸部、頸胸區(qū)和上肢的交感神經(jīng)支配的神經(jīng)節(jié)。星狀神經(jīng)節(jié)的阻塞或切除會(huì)引發(fā)這些區(qū)域的血管擴(kuò)張，進(jìn)而增強(qiáng)這些區(qū)域的血供[8,9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SGB前處理可增強(qiáng)腦I/R大鼠的血供，降低腦梗死，并減少缺血半影區(qū)神經(jīng)元形態(tài)改變和凋亡的病理變化，說(shuō)明SGB前處理是潛在的用于局灶性腦缺血的保護(hù)策略，此技術(shù)可能適用于如溶栓和取栓等腦I/R損傷的高發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)疾病的術(shù)前處理。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，自噬廣泛參與腦缺血損傷后的一系列反應(yīng)[2,3,7]。但目前對(duì)于自噬在缺血性腦損傷中的作用尚存在爭(zhēng)議，如有些研究[7,13]認(rèn)為自噬能促進(jìn)缺血性腦損傷后神經(jīng)元的存活，而有些研究[14,15]認(rèn)為腦損傷后的神經(jīng)元自噬能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并進(jìn)一步加劇認(rèn)知功能障礙。造成這些矛盾的因素主要包含誘導(dǎo)自噬信號(hào)的強(qiáng)度、損傷的腦組織取材部位、以及腦缺血后的取材時(shí)間不同以及不同部位神經(jīng)元自噬閾值的不同等。本研究顯示，SGB能減少腦I/R大鼠缺血半影區(qū)中自噬體以及Beclin‐1表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，提示SGB能降低腦I/R后缺血半影區(qū)中自噬水平；造成這一現(xiàn)象的原因可能是本研究在I/R術(shù)前已經(jīng)進(jìn)行SGB術(shù)，造成腦血供增強(qiáng)而降低I/R誘導(dǎo)的自噬。另外，本研究是在I/R術(shù)后7d取材，此階段屬于神經(jīng)損傷急性期的末端，缺血半影區(qū)中繼發(fā)性損傷神經(jīng)元均處于恢復(fù)狀態(tài)，自噬降低使得神經(jīng)元多處于“健康”狀態(tài)。因此，若細(xì)致研究SGB對(duì)局灶性腦缺血的自噬的影響，應(yīng)細(xì)致SGB前處理和后處理，I/R術(shù)后不同時(shí)間以及不同腦部位中自噬水平。

總之，就目前結(jié)果而言，本研究結(jié)果顯示SGB前處理能增加大鼠腦I/R損傷后腦血供、改善腦梗死和降低缺血半影區(qū)神經(jīng)元凋亡和自噬。