黃新新 朱 靜 李璇玥 馬 田 李曉斌* 李佳豪 丁 峰 高慧香

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)計(jì)算機(jī)與信息工程學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

腸道菌群是機(jī)體的“第二大腦”，與宿主是互利共生的關(guān)系，參與宿主營養(yǎng)物質(zhì)代謝、免疫調(diào)節(jié)、激素分泌表達(dá)及促進(jìn)腸道發(fā)育等[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失衡會導(dǎo)致消化、循環(huán)、代謝和神經(jīng)等多個系統(tǒng)疾病的發(fā)生[4-5]。如微生物失衡導(dǎo)致的腹瀉、腸道炎癥等是誘發(fā)大腸癌和肝功能損傷的原因之一[6-9]?？股卦跉绮≡耐瑫r也會對腸道微生態(tài)環(huán)境造成破壞，長期使用使病原菌產(chǎn)生耐藥性，從而提高宿主對病原菌的易感性，導(dǎo)致腸道免疫功能下降、菌群數(shù)量和豐度減少及微生物代謝產(chǎn)物異常，最終對宿主健康產(chǎn)生負(fù)面影響[10-11]。因此，調(diào)控動物腸道微生物多樣性及腸道穩(wěn)態(tài)對維持腸道健康意義重大。飼料中抗生素類添加劑的大量使用對食品安全以及人類健康產(chǎn)生重大影響。因此，抗生素替代物的篩選一直是研究的熱點(diǎn)。鞣花酸是一種天然多酚，廣泛分布于蔬菜、水果與堅(jiān)果中，其具有調(diào)節(jié)腸道菌群、抗癌、抗氧化及抗炎癥等生物學(xué)作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腸道發(fā)生炎癥時，腸道中的厚壁菌門和擬桿菌門的數(shù)量減少，而促進(jìn)炎癥發(fā)生的有害菌數(shù)量增加[13]。沈起兵等[14]給大鼠灌喂純度為90%的鞣花酸，結(jié)果顯示鞣花酸能夠顯著增加大鼠腸道中擬桿菌門和擬桿菌屬的豐度（P＜0.05），極顯著降低變形菌門的豐度（P＜0.01），顯著提高細(xì)菌的多樣性（P＜0.05）；同時鞣花酸可以促進(jìn)腸道中有益菌的生長和降低厚壁菌門∕擬桿菌門的比值，從而調(diào)控腸道微生態(tài)的穩(wěn)定[15]。因此，本試驗(yàn)以小鼠為研究對象，通過給小鼠灌喂石榴皮瓤提取物，探究石榴皮瓤中鞣花酸對小鼠腸道菌群的影響，為進(jìn)一步深入探究鞣花酸對腸道菌群調(diào)控的機(jī)制及其生物學(xué)作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)選擇平均日齡50 d、體重相近（37.31±5.57）g、健康良好的SPF級雄性昆明小鼠30只，購自新疆醫(yī)科大學(xué)。

1.2 石榴皮瓤中鞣花酸的提取及測定

1.2.1 提取方法

在市場上購買新疆和田皮亞曼新鮮石榴，石榴去除籽實(shí)后剩余的皮瓤晾干，用于提取。石榴皮瓤中鞣花酸提取方法參考陳鵬等[16]提取方法。

1.2.2 測定方法及鞣花酸含量

鞣花酸測定的色譜分析條件：色譜柱為C18（Welch Ultimate AQ-C18，4.6×250 mm，5 μm）；流動相的配制：分別量取甲醇∶水∶冰乙酸銨50∶49.85∶0.15（V∕V∕V）的比例混合，用0.45 μm濾膜抽濾，超聲脫氣30 min；檢測波長：254 nm，柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。鞣花酸的平均含量為（27.16±5.26）mg∕g（風(fēng)干重）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將試驗(yàn)小鼠，隨機(jī)分為2組，每組15只，分別為對照組和試驗(yàn)組。在相同基礎(chǔ)日糧條件下試驗(yàn)組小鼠灌喂1.5 g∕（d·只）石榴皮瓤粗提物[即鞣花酸的灌喂量為40.74 mg∕（d·只）]，將1.5 g 提取物溶解于2 mL蒸餾水中，分別在每天10：00 和18：00 分兩次灌喂，每次灌喂1 mL，對照組每次灌喂相應(yīng)體積的蒸餾水，進(jìn)行為期21 d的灌喂試驗(yàn)。第22 d早晨空腹斷頸處死全部小鼠，采集小鼠盲腸內(nèi)容物，-70 ℃冷凍保存，待測。日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.4 樣品采集與指標(biāo)測定

在第22 d，將所有小鼠斷頸處死，采集小鼠盲腸內(nèi)容物，同一組3 只小鼠的樣品合為1 個樣品，用無RNA凍存管分裝，-70 ℃冷凍保存，即每個組最終5個樣品，用于分析盲腸菌群結(jié)構(gòu)和多樣性。

1.5 樣品測定

總DNA 提取、PCR 擴(kuò)增及Illumina HiSeq 測序及結(jié)果分析均委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司協(xié)助完成。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平（以風(fēng)干物質(zhì)計(jì)，%）

1.6 數(shù)據(jù)處理

菌群豐度數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）”表示，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴皮瓤提取物對小鼠盲腸門水平菌群豐度的影響（見表2）

表2 門水平小鼠盲腸菌群豐度

由表2可知，小鼠盲腸內(nèi)容物中門水平豐度較高的物種有厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、脫鐵桿菌門、軟壁菌門。其中80%以上的是厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門。而石榴皮瓤提取物對擬桿菌門和放線菌門豐度有顯著影響（P＜0.05），擬桿菌門試驗(yàn)組比對照組顯著提高了65.00%（P＜0.05）；而放線菌門試驗(yàn)組比對照組降低了49.35%（P＜0.05）。其他菌門試驗(yàn)組與對照組之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 石榴皮瓤提取物對小鼠盲腸科水平菌群豐度的影響（見表3）

表3 科水平小鼠盲腸菌群豐度

由表3可知，小鼠盲腸內(nèi)容物中科水平豐度較高的物種有乳桿菌科、腸球菌科、毛螺菌科、Muribacula?ceae、脫疏弧菌科、理研菌科、Eggerthellaceae、韋榮球菌科及瘤胃菌科。試驗(yàn)組與對照組相比，石榴皮瓤提取物能夠顯著增加小鼠腸道中理研菌科豐度（P＜0.05）。其他菌科試驗(yàn)組與對照組之間差異不顯著（P＞0.05）。但毛螺菌科試驗(yàn)組比對照組減少了41.65%（P＞0.05），而Muribaculaceae試驗(yàn)組比對照組有所增加。

2.3 石榴皮瓤提取物對小鼠盲腸屬水平菌群豐度的影響（見表4）

表4 屬水平小鼠盲腸菌群豐度

由表4可知，小鼠盲腸內(nèi)容物中屬水平豐度的較高的物種有乳桿菌屬、腸球菌屬、脫硫弧菌屬、單胞生糖菌屬、腸桿菌屬、另枝菌屬、Faecalitalea、擬桿菌屬、分節(jié)絲狀菌以及臭桿菌。試驗(yàn)組與對照組相比，石榴皮瓤提取物能夠顯著增加擬桿菌屬（P＜0.05），試驗(yàn)組比對照組增加了96.84%（P＜0.05）。屬水平上其他物種，試驗(yàn)組與對照組差異均不顯著（P＞0.05）。但腸桿菌屬試驗(yàn)組比對照組有所減少。

2.4 Alpha diversity分析

Alpha 多樣性分析表明，Chao1、ACE、Shannon 數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說明菌群豐富度和多樣性越高。由表5可知，對照組與試驗(yàn)組小鼠腸道中菌群豐度和多樣性差異不顯著（P＞0.05），但試驗(yàn)組小鼠在灌喂石榴皮瓤提取物后腸道中Chao1、ACE和Shan?non指數(shù)相比對照組有所增加（P＞0.05）。

表5 小鼠盲腸菌群Alpha多樣性

2.5 Beta diversity分析

2.5.1 LEfSe分析

LEfSe分析能夠在組與組之間尋找有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的物種。由圖1 LDA分布柱狀圖可知，小鼠盲腸內(nèi)容物中，對照組與試驗(yàn)組在各類水平上有差異性物種共有13種。試驗(yàn)組在各類水平上的顯著優(yōu)勢物種有10種，分別為擬桿菌門、擬桿菌綱、擬桿菌科，Muribacu?laceae 科、瘤胃球菌科、另枝菌屬、Marinifilaceae 科、Odoribacter 屬、巴氏鏈球菌種、生黃瘤胃球菌種。對照組優(yōu)勢物種有3 種，分別為根瘤菌科、Parvibacter屬、Streptocoocus_azizii 種。試驗(yàn)組差異顯著的物種種類比對照組豐富，這可能與小鼠灌喂石榴皮瓤提取物對腸道菌群的影響有關(guān)。

圖1 LDA分布

2.5.2 主成分分析

由圖2 可知小鼠盲腸主成分（PCA）分析結(jié)果，圖中主成分1（PC1）為第1主坐標(biāo)，對檢測到總微生物的代表性貢獻(xiàn)率為42.99%，主成分2（PC2）為第2 主坐標(biāo)，對檢測到總微生物的代表性貢獻(xiàn)率為35.63%。試驗(yàn)組有兩種菌與對照組較為接近，而試驗(yàn)組的其他三種菌與對照組區(qū)分開來。

圖2 主成分分析結(jié)果

2.5.3 T-test

為了尋找各菌群分類水平下，組間的差異物種，做組間的T-test 檢驗(yàn)，找出差異顯著（P＜0.05）的物種。由圖3 可知，左圖為組間差異物種豐度展示，圖中每個條形分別表示在分組間豐度差異顯著的物種在每個組中的均值。右圖為組間差異置信度展示，圖中每個圈的最左端點(diǎn)表示均值差的95%置信區(qū)間下限，圓圈的最右端點(diǎn)表示均值差95%置信區(qū)間上限。圓圈的圓心代表的是均值的差。圓圈顏色所代表的組為均值高的組。展示結(jié)果的最右端是對應(yīng)差異物種的組間顯著性檢驗(yàn)P值。該結(jié)果為屬水平，試驗(yàn)組另枝菌屬（Alistipes）的豐度顯著高于對照組。

2.5.4 MetaStat分析

MetaStat分析能夠找出不同分組間顯著差異的物種，在門、綱、目、科、屬、種6 個層級分別做組間物種差異顯著性分析，得到不同層級。由圖4可知，Candi?datus_Stoquefichus、Streptocoocus、unidentified_Clostridi?ales 和臭桿菌屬（Odoribacter）4 個物種試驗(yàn)組與對照組差異顯著（P＜0.05）。而另枝菌屬（Alistipes）試驗(yàn)組與對照組差異極顯著（P＜0.01）。

3 討論

圖3 T-test組間物種差異分析

圖4 MetaStat分析

腸道微生物包括真菌、古菌、細(xì)菌及原蟲等，與腸道內(nèi)容物（消化物、消化液及消化酶）、腸道組織共同構(gòu)建成一個復(fù)雜而穩(wěn)衡的內(nèi)環(huán)境，維持腸道發(fā)育與腸道健康，對動物的生長發(fā)育意義重大[17]。相反，腸道微生態(tài)破壞會導(dǎo)致機(jī)體代謝性疾病、自身免疫病、炎癥反應(yīng)等多種疾病的并發(fā)癥[18]。影響和改變腸道菌群組成及多樣性的因素較多，包括年齡、性別及生理狀態(tài)等內(nèi)部因素[19-22]，也包括影響較大的日糧結(jié)構(gòu)的改變、飼料添加劑的飼喂(如抗生素、益生菌、多酚等)及飼養(yǎng)管理環(huán)境等外部因素[23-26]。

Bialonska 等[27]研究表明，石榴副產(chǎn)物中的多酚可以促進(jìn)人體腸道中雙歧桿菌、乳桿菌屬及產(chǎn)生短鏈脂肪酸類菌群的數(shù)量。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，給小鼠灌喂石榴皮瓤提取物，在門水平上，可顯著增加擬桿菌門的豐度（P＜0.05），降低厚壁菌門∕擬桿菌門的比值；顯著降低了放線菌門的豐度（P＜0.05）。在科水平上，可顯著增加理研菌科豐度（P＜0.05）和提高M(jìn)uribaculaceae豐度（P＞0.05）；降低了毛螺菌科的豐度，試驗(yàn)組比對照組減少了41.65%（P＞0.05）。在屬水平，可顯著增加擬桿菌屬的豐度（P＜0.05），而降低腸桿菌屬的豐度（P＞0.05）。Wang等[28]研究結(jié)果顯示，給高膽固醇飲食的大鼠日糧中補(bǔ)喂薏仁多酚，可減少與體內(nèi)脂代謝平衡相關(guān)的丹毒絲菌科、梭狀芽孢桿菌科以及毛螺菌科中Blautialuti 屬這3 種菌的豐度；同時能夠緩解高膽固醇飲食誘導(dǎo)的代謝紊亂。沈起兵等[14]給大鼠灌喂純度90%的鞣花酸，能夠顯著增加大鼠腸道中擬桿菌門和擬桿菌屬的豐度，而極顯著降低變形菌門的豐度。本試驗(yàn)研究結(jié)果與Wang 等[28]和沈起兵等[14]相一致，說明多酚類物質(zhì)可以改變動物腸道內(nèi)微生物的種類和數(shù)量。本試驗(yàn)小鼠盲腸菌群的改變，與石榴皮瓤提取物中的鞣花酸有關(guān)。由于鞣花酸生物學(xué)作用的發(fā)揮主要依賴于腸道微生物將鞣花酸代謝為尿石素，在代謝過程鞣花酸扮演了被代謝與調(diào)節(jié)的作用，從而改變了腸道微生物，促進(jìn)相關(guān)微生物的繁殖[29]。同時，鞣花酸的抗炎和抗菌的生物活性能夠抑制與腸道炎癥、腹瀉有關(guān)的毛螺菌科和腸桿菌屬的生長，減少致病菌帶來的危害[30-31]。因此，這可能就是鞣花酸調(diào)控腸道菌群種類和數(shù)量的原因。

腸道中菌群多樣性一方面反映出菌群的種類和數(shù)量的多少，另一方面反映出菌群對不同胃腸道環(huán)境的適應(yīng)性。菌群在腸道適應(yīng)性越強(qiáng)，其菌群的多樣性越明顯，對腸道健康和宿主健康更有益[32]。研究表明，膳食和果蔬中含有的多酚類物質(zhì)可被腸道菌群代謝分解進(jìn)一步提高它們的生物活性和利用率，從而改善宿主的腸道健康[33]。沈起兵等[14]研究結(jié)果顯示鞣花酸能夠改變腸道菌群多樣性，隨著試驗(yàn)期的進(jìn)行，試驗(yàn)第28 d的大鼠腸道菌群多樣性指數(shù)Shannon、Chao1和ACE 均顯著或極顯著（P＜0.05 或P＜0.01）的高于灌喂第0 d。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，給小鼠灌喂石榴皮瓤提取物對小鼠腸道菌群多樣性無顯著影響，但提高了Shannon、chao1 和ACE 的值；此外Beta diversity 分析中使用LEfSe、主成分分析、T-test 和MetaStat 分析發(fā)現(xiàn)，石榴皮瓤提取物能夠增加試驗(yàn)組小鼠盲腸差異物種的數(shù)量，豐富了細(xì)菌的結(jié)構(gòu)，與上述研究結(jié)果相似。因此，菌群多樣性更進(jìn)一步的說明鞣花酸的補(bǔ)喂能夠改變腸道菌群的種類與數(shù)量，增加細(xì)菌的多樣性和豐富度。鞣花酸作為一類多酚物質(zhì)，已被證實(shí)具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用[14]。此外，由于鞣花酸在腸道中作為代謝底物被腸道菌群分解產(chǎn)生尿石素，而尿石素也具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用[29]?？赡苁潜驹囼?yàn)小鼠盲腸菌群結(jié)構(gòu)和多樣性改變的原因。

抗生素等藥物添加劑產(chǎn)生的危害引起了社會的廣泛重視。在2020年飼料端全面“禁抗”，養(yǎng)殖端“減抗、限抗”行業(yè)背景下，綠色無殘留安全的“替抗”產(chǎn)品成為當(dāng)前急需解決的問題。鞣花酸作為一類植物多酚類物質(zhì)，其生物學(xué)作用已被證實(shí)。本試驗(yàn)的目的不僅是為了深層次研究鞣花酸調(diào)控腸道菌群的生物學(xué)作用，同時也為鞣花酸可作為當(dāng)前畜牧生產(chǎn)中“替抗”產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，給小鼠灌喂石榴皮瓤提取物可顯著增加小鼠腸道中擬桿菌門、理研菌科、擬桿菌屬的豐度，降低了厚壁菌門∕擬桿菌門比值；顯著降低了放線菌門；使小鼠腸道中的菌群多樣性呈上升趨勢。給小鼠灌喂石榴皮瓤提取物鞣花酸可以改善和調(diào)控小鼠腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，優(yōu)化腸道菌群的結(jié)構(gòu)。初步揭示了鞣花酸具有調(diào)節(jié)腸道菌群的生物學(xué)作用，而鞣花酸在腸道中如何發(fā)揮其生物作用和是否適用于大型家畜有待進(jìn)一步研究。