農(nóng)斯偉 沈水寶 韋曉芳 吳克寧 袁汝喜 藍(lán)林誠 伍校軍 韋 區(qū)

（1.百色學(xué)院教育科學(xué)學(xué)院，廣西百色533000；2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530004）

隨著社會(huì)快速發(fā)展，人們對(duì)食品的安全和質(zhì)量越來越重視，據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194 號(hào)公告：2020 年7 月1 日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料?？股亟o畜禽行業(yè)帶來了很多益處，但同時(shí)造成了諸多的食品安全問題。因此，尋找抗生素替代品已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。廣西三黃雞是兩廣地區(qū)的土雞代表之一，肉質(zhì)鮮皮黃薄脆、香味濃郁，是制作白切雞或原味雞的上好品種，但產(chǎn)量和養(yǎng)殖模式存在許多瓶頸，是需要解決的技術(shù)難點(diǎn)。目前市場(chǎng)上以快大雞為主，但人們對(duì)土雞的味道保持著喜愛。土雞的養(yǎng)殖過程需要一定的運(yùn)動(dòng)量和飼養(yǎng)周期才可以沉淀美味和質(zhì)量，生產(chǎn)上以放養(yǎng)為主，而放養(yǎng)過程中由于環(huán)境的不穩(wěn)定影響，經(jīng)常出現(xiàn)疾病和使用抗生素治療導(dǎo)致的食品藥物殘留等問題。研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌都可改善動(dòng)物腸道的微生物區(qū)系平衡，通過競(jìng)爭抑制有害菌的生長繁殖，且產(chǎn)生的多種代謝產(chǎn)物具有類似抗生素的作用[1-2]。產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)、短鏈∕支鏈脂肪酸（SCFA∕BCFA）、維生素、甾醇類物質(zhì)、芳香族化合物、胺類物質(zhì)等，對(duì)機(jī)體免疫[3]和血液代謝等具有改善作用[4]。彭豫東等[5]在石門土雞中添加枯草芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)除了提高屠宰性能外，對(duì)機(jī)體抗氧化能力和腸道形態(tài)都有一定的改善作用；杜云平等[6]分別在肉雞和種雞的飲水中添加1.5×109CFU∕mL的丁酸梭菌，發(fā)現(xiàn)肉雞日增重增高4.62%，料肉比下降9.26%，并且可以很好地預(yù)防仔雞腸炎。本試驗(yàn)旨在研究益生菌對(duì)廣西黎村黃雞的生長性能和腸道發(fā)育的影響，為廣西優(yōu)質(zhì)土雞的飼養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

丁酸梭菌（由湖北藍(lán)谷中微生物技術(shù)有限公司提供，活菌數(shù)見表1），復(fù)合菌（由北京科為博生物科技有限公司，活菌數(shù)見表1）添加量均為廠家指導(dǎo)劑量，并于飼料制粒過程中加入，成品料的活菌測(cè)量由北京科為博生物科技有限公司檢測(cè)，以上數(shù)據(jù)為實(shí)測(cè)值。

表1 添加劑與含量

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼糧

試驗(yàn)選用國家畜禽新品種（配套系）認(rèn)定的廣西“黎村黃雞”，參照NRC（1994）《家禽營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》的營養(yǎng)需要的基礎(chǔ)上，根據(jù)黎村黃雞的品種特性、飼養(yǎng)管理和營養(yǎng)需求進(jìn)行調(diào)整（見表2）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

試驗(yàn)選用35 日齡，平均體重383.52 g 左右健康、精神狀態(tài)良好的廣西黎村黃雞3 000 羽，按照試驗(yàn)要求隨機(jī)分成3 個(gè)處理組，每個(gè)處理組5 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)200 羽。第一組：基礎(chǔ)飼糧+丁酸梭菌（500 g∕t），第二組：基礎(chǔ)飼糧+復(fù)合菌（丁酸梭菌+枯草芽孢桿菌）1 000 g∕t，第三組是對(duì)照組為基礎(chǔ)飼糧，正式試驗(yàn)45 d。本試驗(yàn)采用籠養(yǎng)方式，飼養(yǎng)管理根據(jù)雞場(chǎng)規(guī)定進(jìn)行，人工限飼，自由飲水、溫濕度控制在本階段最適范圍，每天飼喂2 次，分為上午08：00 和下午15：00，并保持雞舍清潔衛(wèi)生。試驗(yàn)期間每日記錄料耗和死亡數(shù)，試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)禁食12 h，每個(gè)重復(fù)抽取60羽進(jìn)行稱重，記錄初重和末重。

1.4 生長性能測(cè)定

由于限飼，因此采食量是相對(duì)固定，耗料量以實(shí)際投飼量計(jì)，各組總耗料量一致。

平均日采食量(ADFI，g)=總投料量∕試驗(yàn)天數(shù)

平均日增重（ADG，g）=（末重-初重）∕試驗(yàn)天數(shù)

料重比（F∕G）=總耗料量∕總增重

1.5 屠宰收集樣品

于試驗(yàn)第45 d，試驗(yàn)雞禁食12 h。每個(gè)重復(fù)選1 只體重接近該重復(fù)平均體重的供試雞進(jìn)行屠宰，分別采集十二指腸、空?qǐng)?、回腸各2～3 cm，置于10%甲醛溶液中固定。

1.6 樣品測(cè)定及方法

1.6.1 腸道形態(tài)測(cè)定

取出固定瓶中腸道組織，常規(guī)石蠟切片制作，顯微鏡鏡檢，圖像在專業(yè)成像系統(tǒng)測(cè)量40倍視野下，測(cè)量隱窩深度、絨毛高度。

1.6.2 盲腸菌群測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束前，禁食12 h，每個(gè)重復(fù)選取1羽，進(jìn)行屠宰，取盲腸內(nèi)容物2～5 g放入凍存管中，迅速轉(zhuǎn)入-80 ℃液氮中保存待高通檢測(cè)測(cè)序，對(duì)所有盲腸樣本進(jìn)行總DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和Miseq 測(cè)序，數(shù)據(jù)使用專用軟件進(jìn)行分析。

1.7 數(shù)據(jù)整理與分析

數(shù)據(jù)使用Excel 軟件先統(tǒng)計(jì)整理，再用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)計(jì)算顯著性分析，用單因素方差分析（one-way ANOVA,）和Duncan's 多重比較檢驗(yàn)法來對(duì)比組間是否差異，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）”表示。用P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著，0.05＜P＜0.10表示有差異趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼用芽孢桿菌和丁酸梭菌對(duì)黎村黃雞生長性能的影響（見表3）

表3 飼用芽孢桿菌和丁酸梭菌對(duì)黎村黃雞生長性能的影響

由表3 可知，由于飼養(yǎng)過程采取限飼，根據(jù)肉雞日齡實(shí)行固定遞增投喂量，因此耗料量一致。平均日增重方面，丁酸梭菌組和復(fù)合組分別比對(duì)照組提高7.25%和6.80%，但差異不顯著（P＞0.05）；同時(shí)丁酸梭菌組和復(fù)合組的料重比與對(duì)照組相比，有降低趨勢(shì)，但差異不顯著（0.05＜P＜0.10）。丁酸梭菌組和復(fù)合組的死淘率與對(duì)照組相比，有降低的趨勢(shì)，但差異不顯著（0.05＜P＜0.10）。

2.2 飼用芽孢桿菌和丁酸梭菌對(duì)黎村黃雞腸道形態(tài)的影響（見表4）

表4 飼用芽孢桿菌和丁酸梭菌對(duì)黎村黃雞腸道形態(tài)的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，腸絨毛高度方面，復(fù)合組和丁酸梭菌組十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度有提高的趨勢(shì)，但差異均不顯著（0.05＜P＜0.10）；隱窩深度方面，復(fù)合組和丁酸梭菌組的空腸隱窩深度顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），且復(fù)合組和丁酸梭菌組的回腸的隱窩深度低于對(duì)照組，但差異不顯著（0.05＜P＜0.10）；絨毛高度∕隱窩深度方面，復(fù)合組和丁酸梭菌組空腸和回腸顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其他組間差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 飼用芽孢桿菌和丁酸梭菌對(duì)黎村黃雞盲腸食糜中微生物區(qū)系的影響（見表5～表6）

表5 各組黃雞盲腸微生物區(qū)系在門水平上的分布（門水平%）

表6 各組黃雞盲腸微生物區(qū)系在屬水平上的分布（屬水平%）

由表5可知，80 d黎村黃雞盲腸內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門和擬桿菌門，占據(jù)90%左右。其中，丁酸梭菌組厚壁菌門的相對(duì)豐度顯著高于復(fù)合組和對(duì)照組（P＜0.05），而擬桿菌門的相對(duì)豐度顯著低于復(fù)合組和對(duì)照組（P＜0.05）。各組間的變形桿菌門和放線菌門差異均不顯著（P＞0.05）。

從表6 可知，復(fù)合組的擬桿菌屬的相對(duì)豐度最高，但與其他兩組差異不顯著（P＞0.05）。丁酸梭菌組的另枝菌屬的相對(duì)豐度顯著低于復(fù)合組和對(duì)照組（P＜0.05）。復(fù)合組的乳桿菌屬的相對(duì)豐度顯著低于丁酸梭菌組和對(duì)照組（P＜0.05）。對(duì)照組的梭菌屬的相對(duì)豐度顯著低于丁酸梭菌組和復(fù)合組（P＜0.05）。丁酸梭菌組的瘤胃球菌屬的相對(duì)豐度顯著高于復(fù)合組和對(duì)照組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 飼用芽孢桿菌和丁酸梭菌對(duì)黎村黃雞生長性能的影響

研究表明，丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物包括多種活性酶、抗菌肽、短鏈脂肪酸等物質(zhì)，能夠提高動(dòng)物對(duì)飼料的利用率，改善動(dòng)物生長性能[7]；肉雞養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌可以提高肉雞的生長性能[8]，但也有發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌對(duì)肉雞的平均日增重和料重比無顯著影響[9]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在采食量固定的情況下，丁酸梭菌和復(fù)合菌的平均日增重有提高的趨勢(shì)且料重比都有降低的趨勢(shì)，但是差異不顯著（P＞0.05）。這可能是由于采取限飼，提供的營養(yǎng)物質(zhì)有限，益生菌難以發(fā)揮最大的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌組和復(fù)合組的生長性能無顯著差異，可能是由于限飼造成枯草芽孢桿菌沒能發(fā)揮功能，而丁酸梭菌發(fā)揮了主要功能；造成這一現(xiàn)象的機(jī)理還要進(jìn)一步研究證實(shí)。丁酸梭菌和復(fù)合組的死亡率有所降低，但與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

3.2 飼用芽孢桿菌和丁酸梭菌對(duì)黎村黃雞腸道發(fā)育的影響

腸道是動(dòng)物吸收營養(yǎng)的主要場(chǎng)所，是機(jī)體內(nèi)最大的消化、轉(zhuǎn)運(yùn)器官，同時(shí)也是一道重要的物理防御系統(tǒng)[10]。腸絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度∕隱窩深度常作為評(píng)定小腸吸收營養(yǎng)物質(zhì)能力及腸道功能的指標(biāo)。絨毛高度∕隱窩深度的比值，是小腸對(duì)養(yǎng)分的吸收功能的保證，比值小可反映隱窩相對(duì)較厚，絨毛上皮細(xì)胞更新率減弱，吸收養(yǎng)分能力相對(duì)較弱，絨毛高度∕隱窩深度比值大，可在一定程度表明吸收養(yǎng)分能力強(qiáng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌組和復(fù)合組十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度均優(yōu)于對(duì)照組，但是差異不顯著（P＞0.05）。但在空腸的隱窩深度方面，丁酸梭菌和復(fù)合組空腸的隱窩深度顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。徐晨希[11]發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼料中添加丁酸梭菌可顯著降低十二指腸的隱窩深度。本研究發(fā)現(xiàn)回腸的隱窩深度也有降低的趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05），與上述結(jié)果相似。齊博等[12]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌可顯著提高愛拔益加(AA)肉仔雞十二指腸的絨毛高度和絨毛高度∕隱窩深度。同樣地，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加益生菌可顯著提高空腸和回腸的絨毛高度∕隱窩深度（P＜0.05）。但丁酸梭菌組和復(fù)合組間無顯著差異（P＞0.05），造成這一現(xiàn)象可能是由于限飼引起的，肉雞攝入量有限，具體機(jī)理還有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

3.3 飼用芽孢桿菌和丁酸梭菌對(duì)黎村黃雞盲腸菌群分布的影響

動(dòng)物腸道是一個(gè)開放的生態(tài)系統(tǒng)，與外界接觸最為廣泛，在腸道里面存在著許多微生物，這些微生物與宿主免疫防御系統(tǒng)之間經(jīng)過長期的協(xié)同進(jìn)化，與宿主共生，在維持腸道健康方面起著重要作用。研究表明，腸道中菌群的種類有500 多種，但是這些菌種大部分屬于少數(shù)的幾個(gè)門類[13-14]。雞腸道中以厚壁菌門為主，其次為擬桿菌門、變形菌門和放線菌門[15]。本試驗(yàn)研究，黃雞的盲腸微生物中以厚壁菌門、擬桿菌門為主，兩種菌門的占比達(dá)到90%左右，其次為變形菌門和放線菌門。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)厚壁菌門與擬桿菌門比值（F∕B）與動(dòng)物脂類代謝有關(guān)聯(lián)，F(xiàn)∕B 值增大，動(dòng)物機(jī)體的脂肪沉積較多，這可能是由于厚壁菌門有較強(qiáng)的發(fā)酵能力，其產(chǎn)出較多的短鏈脂肪酸和代謝脂類的能力，有利于動(dòng)物體沉積脂肪[16]。本研究發(fā)現(xiàn)各組的優(yōu)勢(shì)菌門主要是厚壁菌門和擬桿菌門，但是兩個(gè)處理組的菌群F∕B 比例相差較大，復(fù)合組的第一優(yōu)勢(shì)菌門為擬桿菌門，而丁酸梭菌組的第一優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門，提示丁酸梭菌組可提高厚壁菌門相對(duì)豐度，而復(fù)合組提高擬桿菌門相對(duì)豐度，這可能是由于復(fù)合組中枯草芽孢桿菌促進(jìn)擬桿菌門的繁殖，從而導(dǎo)致厚壁菌門的相對(duì)豐度下降。據(jù)報(bào)道，擬桿菌門是食草性動(dòng)物主要的優(yōu)勢(shì)菌門，其功能是分解宿主難以分解的多糖（如粗纖維）、增強(qiáng)草食動(dòng)物對(duì)纖維素的消化，促進(jìn)物質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]。提示飼料中添加含有枯草芽孢桿菌的益生素有利于散養(yǎng)雞對(duì)粗料的消化和吸收，而單用丁酸梭菌可能不利于散養(yǎng)雞對(duì)粗飼料的耐受。

在屬水平上，許多研究表明動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)菌屬主要以擬桿菌屬、梭菌屬、瘤胃球菌屬為主，這些菌群有利于動(dòng)物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)吸收[18-22]。如擬桿菌屬可促進(jìn)動(dòng)物對(duì)飼料中淀粉的消化吸收，且對(duì)腸道炎癥有一定的調(diào)節(jié)功能，本研究得出各組間擬桿菌屬相對(duì)含量無顯著差異。

另枝菌屬是一種相對(duì)較新的細(xì)菌屬，主要從醫(yī)學(xué)臨床樣品中分離出來，盡管與其他細(xì)菌類屬相比，其發(fā)病率較低，而其他細(xì)菌屬與菌群失調(diào)和疾病高度相關(guān)，但目前的分離方式還不能足以全部區(qū)分該屬的物種；從患有闌尾炎，腹部和直腸膿腫的患者中分離出了該屬的各種物種，有研究表明另枝菌屬可能對(duì)某些疾病具有保護(hù)作用，包括肝纖維化、結(jié)腸炎、癌癥免疫療法和心血管疾病，但也有相反的研究證明另枝菌屬在大腸癌中表現(xiàn)為致病性[23]。由于另枝菌屬是擬桿菌屬的一個(gè)較新的分支，并且擬桿菌屬通常與慢性腸道炎癥相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌組的另枝菌屬相對(duì)豐度顯著低于其他兩組，且對(duì)照組的含量最高，提示丁酸梭菌肉雞對(duì)腸道炎癥方面具有良好的保護(hù)作用，效果優(yōu)于復(fù)合組。

乳桿菌屬是動(dòng)物腸道的有益菌群，具有維持動(dòng)物機(jī)體健康和免疫調(diào)節(jié)功能，能夠利用葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵并產(chǎn)生乳酸和乙酸等降低腸道pH，抵御外來入侵，促進(jìn)其他有益菌的生長繁殖，調(diào)節(jié)腸道功能及營養(yǎng)的吸收利用。本研究發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌組的乳桿菌屬相對(duì)含量最高，顯著高于復(fù)合組；提示丁酸梭菌可提高肉雞腸道乳桿菌屬的含量，而含有枯草芽孢桿菌的丁酸梭菌復(fù)合組不利于乳桿菌屬的生長繁殖。

梭菌屬和瘤胃球菌屬可促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體對(duì)飼料中纖維和碳水化合物的消化吸收。本試驗(yàn)添加有丁酸梭菌菌種，因此兩個(gè)處理組的梭菌屬含量顯著高于對(duì)照組，提示添加丁酸梭菌和復(fù)合丁酸梭菌均可以提高肉雞對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，生長性能的平均日增重的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。丁酸梭菌組的瘤胃球菌屬顯著高于其他兩組，提示丁酸梭菌可促進(jìn)瘤胃球菌屬的生長繁殖，而復(fù)合丁酸梭菌組對(duì)于瘤胃球菌屬的生長繁殖能力較弱。

4 結(jié)論

研究表明丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌均有提高動(dòng)物的生長性能，促進(jìn)動(dòng)物腸道健康以及提高動(dòng)物機(jī)體免疫。本試驗(yàn)條件下添加丁酸梭菌和復(fù)合丁酸梭菌均有提高小腸絨毛的高度、提高梭菌屬、瘤胃球菌屬、乳桿菌屬的相對(duì)豐度，促進(jìn)黃雞對(duì)飼料中纖維和碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，改善黎村黃雞腸道健康和生長性能。添加丁酸梭菌和丁酸梭菌+芽孢桿菌組對(duì)擬桿菌、梭菌屬、瘤胃球菌屬、乳桿菌屬等分布有一定的影響，但各組的各菌屬間無規(guī)律性變化。