（湖南省郴州市第一人民醫(yī)院藥劑科，湖南 郴州 423000）

車前草是車前科植物車前Plantago asiatica L.或平車前Plantago depressa Willd.的干燥全草，具有清熱利尿通淋，祛痰，涼血，解毒的功效，用于治療熱淋澀痛，水腫尿少，暑濕泄瀉，痰熱咳嗽，吐血衄血，癰腫瘡毒等證[1]。車前草有廣泛的臨床用途、藥源豐富、廉價易得，含黃酮類、苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、三萜類等成分[2-3]，在抗炎、抗腫瘤、抗氧化等方面顯示出潛在的藥用價值[4-6]。其質(zhì)量研究報道多為高效液相色譜（HPLC）法測定其若干活性成分的含量[7-12]，未見有相關(guān)指紋圖譜研究的文獻(xiàn)報道。本研究以江西、四川、江蘇、廣西、安徽5個產(chǎn)地16批車前草為研究對象，建立其指紋圖譜，通過相似度評價、聚類分析和主成分分析對其質(zhì)量進(jìn)行評價，旨在為車前草的合理利用和質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀，包括HPG-3x00A二元泵、Split-Loop自動進(jìn)樣器、Chromeleon 7色譜工作站、PDA-3000二極管陣列檢測器（美國Thermo Fisher Scientific公司）；SP3-100AL超聲波清洗機(jī)（上海泗裴電子科技有限公司）；Mettler Toledo Xs205 分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；QJ-02A 型粉碎機(jī)（上海兆申科技有限公司）。

1.2 材料

大車前苷，毛蕊花糖苷，異毛蕊花糖苷，木樨草苷，木犀草素，芹菜素對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度均≥98.0 %）；收集的16批樣品信息見表1。16批車前草藥材經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院鞏仔鵬教授鑒定，均為車前科植物車前 Plantago asiatica L.或平車前Plantago depressa Willd.的干燥全草。甲醇、乙腈為色譜純（美國 Tedia 公司），其他試劑均為分析純，水為純凈水。

表1 車前草藥材來源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1 %甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，10 %A；8～20 min，10 %A→15 %A；20～28 min，15 %A→25 % A；28～40 min，25 %A→40 %A；40～52 min，40 %A→55 %A；52～60 min，55 %A→10 %A；65～70 min，8 %A）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：330 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取車前草藥材樣品粉末2.0 g，置于具塞錐形瓶中，加70 %甲醇30 ml，稱定重量，超聲提?。üβ剩?50 W，頻率：40 kHz） 30 min，放冷，再稱定重量，用70 %甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng) 0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜素對照品適量，加70 %甲醇制成每1 ml分別含352.1，65.32，42.47，25.14，17.98 μg的混合對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 取2.2項下供試品（樣品編號：S1）溶液適量，按2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定 6次。以9號峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，19個共有峰相對保留時間的RSD為0.12 %～0.38 %，相對峰面積的RSD為0.74 %～1.91 %，均小于 2.0 %（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取2.2項下供試品（編號：S1）溶液適量，分別于室溫下放置 0，6，12，20，30 h 時，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定。以9號峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，19個共有峰相對保留時間的RSD為0.28 %～0.81 %，相對峰面積的RSD為0.98 %～1.81 %，均小于2.0 %（n=5），表明供試品溶液于室溫下放置30 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 取車前草藥材樣品（編號：S1）適量，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定。以9號峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果19個共有峰相對保留時間的RSD為0.17 %～0.69 %，相對峰面積的RSD為0.74%～1.85 %，均小于2.0 %（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的建立及分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜測定及相似度分析 取16批藥材樣品（編號：S1～S16），按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。將16批藥材的HPLC色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版），以 S1樣品圖譜為參考圖譜，時間窗寬度設(shè)為 0.1 s，中位數(shù)法生成對照指紋圖譜，其疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜詳見圖1、圖2。對16批藥材樣品（編號：S1～S16）進(jìn)行相似度分析，結(jié)果表明，10批藥材樣品相似度在0.854～0.957之間，表明各批藥材主要化學(xué)成分較為一致。

圖1 16批藥材樣品的HPLC疊加指紋圖譜

圖2 16批藥材樣品的HPLC對照指紋圖譜

2.4.2 共有峰指認(rèn) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012年A版），對16批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析，16批樣品共有19個共有峰，其峰面積占色譜峰總面積的90 %以上，提示該方法可用于評價藥材的整體質(zhì)量。在19個共有峰中，通過與對照品圖譜對比，并結(jié)合各峰的紫外吸收光譜，指認(rèn)出4號峰為大車前苷、7號峰為毛蕊花糖苷、9號峰為異毛蕊花糖苷、11號峰為木樨草苷、14號峰為木犀草素、17號峰為芹菜素?；旌蠈φ掌飞V圖和樣品色譜圖見圖3。9號峰的峰面積和保留時間適中，且分離度較好，可作為參照峰。各共有峰相對于參照峰的相對峰面積，見表2。

表2 16批藥材樣品HPLC指紋圖譜共有峰的相對峰面積

圖3 混合對照品色譜圖（A）、樣品色譜圖（B）

2.5 聚類分析

以14號峰為參照，以16批藥材樣品（編號：S1～S16）中19個共有峰的相對峰面積為變量，組成16×19階原始數(shù)據(jù)矩陣，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行聚類分析，采用組間連接法，以歐式距離作為樣品的測度。結(jié)果，16批藥材樣品可聚為2類，S6～S9、S13、S14聚為一類，S1～S5、S10～S12、S15、S16聚為一類，見圖4。

圖4 聚類分析樹狀圖

2.6 主成分（PCA）分析

以9號峰為參照，以16批藥材樣品（編號：S1～S16）中19個共有峰的相對峰面積為變量，導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，進(jìn)行PCA分析，模型自動擬合選擇2個主成分，其累積方差貢獻(xiàn)率為85.47 %，提示模型預(yù)測良好，見圖5。由圖5可知，16批藥材樣品可分為2 組，S6～S9、S13、S14為一組，S1～S5、S10～S12、S15、S16為一組，該結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。兩組車前草藥材存在產(chǎn)地交叉情況，因此，產(chǎn)地不能作為車前草質(zhì)量優(yōu)劣的唯一標(biāo)準(zhǔn)，需要綜合藥材各化學(xué)成分含量進(jìn)行整體質(zhì)量評價[13]。為了更好地考察不同產(chǎn)地車前草藥材成分差異的主要標(biāo)志性成分，進(jìn)一步采用偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）法對樣品進(jìn)行分析。

圖5 16批藥材樣品的PCA得分圖

2.7 PLS-DA

PLS-DA主要原理是先利用PLS提取樣本的主成分，然后將主成分作為新變量建立訓(xùn)練樣本自變量和分類變量之間的回歸模型，進(jìn)行判別分析[14]。本研究對上述兩組樣品進(jìn)行PLS-DA分析，繪制PLS-DA模型得分圖，見圖6。模型的主成分回歸系數(shù)Q2Y=0.645＞0.5，說明模型的預(yù)測能力較強(qiáng)，反映兩組樣本具明確分離的趨勢；R2Y=0.973，說明模型對因變量變異貢獻(xiàn)的百分比為 97.3 %，即自變量（共有峰）的變化能解釋導(dǎo)致97.3 %不同分類（因變量）發(fā)生，模型的擬合度較好[14]。通過VIP（variable importance）圖篩選出差異較大成分，見圖7。文獻(xiàn)指出[15]，VIP＞1的變量對分類起著關(guān)鍵作用。由圖 7可知4（大車前苷）、7（毛蕊花糖苷）、17（芹菜素）、14（木犀草素）、6號峰5個成分VIP值均大于1，對車前草藥材的質(zhì)量影響較大。

圖6 16批藥材樣品的PLS-DA模型得分圖

圖7 16 批藥材樣品PLS-DA模型中共有峰的VIP值

3 討論

3.1 色譜條件及提取方法的選擇

本研究前期預(yù)試驗中比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸水溶液（0.2 %，0.1 %）、乙腈-甲酸水溶液（0.2 %，0.1 %）、乙腈-乙酸水溶液（0.2 %，0.1 %）等不同流動相系統(tǒng)的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.1 %乙酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫時，各峰分離度較好，且色譜峰保留時間適中。通過3D全波長掃描，發(fā)現(xiàn)檢測波長為330 nm時HPLC指紋圖譜色譜峰較多，基線平穩(wěn)，特征峰信號較明顯，故選擇330 nm為檢測波長。比較超聲提取與加熱回流提取兩種提取方式，結(jié)果兩種提取方法的效果相當(dāng)，考慮超聲提取操作簡單，因此選擇超聲提取，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察提取時間和提取溶劑對HPLC指紋圖譜的影響，最終選擇用70 %甲醇超聲提取30 min。

3.2 化學(xué)模式識別結(jié)果分析

指紋圖譜相似度評價結(jié)果顯示，16批車前草藥材樣品的相度為0.854～0.957，表明不同產(chǎn)地車前草藥材質(zhì)量相對穩(wěn)定；聚類分析和PCA分析結(jié)果均顯示，16批車前草藥材樣品分為2類，S6～S9、S13、S14為一組，S1～S5、S10～S12、S15、S16為一組，分析結(jié)果表明不同產(chǎn)地的車前草藥材質(zhì)量具有差異性，兩組車前草藥材存在產(chǎn)地交叉情況，故產(chǎn)地不能作為評價車前草藥材質(zhì)量的唯一標(biāo)準(zhǔn)，藥材質(zhì)量還受采收時間、土壤、降水量、溫度等其他因素影響，需要綜合整體化學(xué)成分的含量特征進(jìn)行質(zhì)量評價。通過PLS-DA分析找出影響車前草分類的5個差異性成分，并指認(rèn)出其中4個影響較大的化學(xué)成分，即大車前苷、毛蕊花糖苷、芹菜素、木犀草素，提示車前草藥材中這4個成分受生長環(huán)境的影響較大，大車前苷和毛蕊花糖苷為車前草主要活性物質(zhì)[11]，芹菜素、木犀草素為其黃酮類成分[7]，具有良好的抗菌、抗炎、抗氧化等生理活性[6,16]，為車前草主要有效成分[7]，因此在判斷車前草藥材真?zhèn)魏蛢?yōu)劣時應(yīng)對上述4個成分重點考察。

本研究采用HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別對不同產(chǎn)地車前草藥材進(jìn)行質(zhì)量評價，所建立的測定方法準(zhǔn)確，穩(wěn)定性好，靈敏度高，專屬性強(qiáng)，可為車前草藥材的質(zhì)量控制和質(zhì)量鑒別提供有效手段。