張釬，沈雪梅，劉琨毅，張紀(jì)偉，周藝凡，李光秀，李家華

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤(rùn)普洱茶學(xué)院，云南 昆明 650201；2.昆明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650201；3.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院，五糧液技術(shù)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓 644003；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；5.鹽津縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，云南 鹽津 657500)

紫娟茶(Camelliasinensisvar.assamica)是云南所特有的茶樹特異新品種，其除含有其他茶葉中所含有的兒茶素、茶氨酸和咖啡堿等生化成分外，花青素含量高是其特有的品種特征之一[1-2].大量的研究證實(shí)，花青素對(duì)心血管疾病具有良好的預(yù)防作用[3-4]，具有抗氧化和清除自由基[5-6]、抗突變及抗腫瘤[7-8]、改善人眼機(jī)能與預(yù)防眼疾[9-10]、減輕肝功能障礙[11]和抗炎及抗過(guò)敏[12]等生理功能.因此，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)茶樹種質(zhì)中花青素含量較高、芽葉呈紫紅色的茶樹品種中花青素方面開展了一定的研究，也獲得了部分研究成果[13-16].

目前，為深度開發(fā)利用紫娟茶及其花青素資源奠定相關(guān)基礎(chǔ)，提高紫娟茶花青素的提取率，有研究者圍繞紫娟茶花青素的提取方法開展了有意義的研究，如羅正飛等[17]以70%乙醇水溶液為提取溶劑，以回流提取方法開展了紫娟茶花青素提取工藝的研究，并獲得了最佳醇提工藝；費(fèi)旭元[18]、李璐[19]等分別采用酸性1%和1.5 N的鹽酸甲醇為提取溶劑，開展了紫娟茶中花青素提取工藝的研究，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化了酸性甲醇提取紫娟茶中花青素的工藝.但是，仔細(xì)考量上述提取方法，可以發(fā)現(xiàn)上述研究都以乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑為提取溶劑，以鹽酸為酸化劑，如在未來(lái)將紫娟茶花青素的應(yīng)用領(lǐng)域擴(kuò)大的藥品、食品以及化妝品等領(lǐng)域，需要工廠化提取紫娟茶花青素時(shí)，出于安全性考慮，用有機(jī)溶劑、鹽酸等化學(xué)制劑作為提取溶劑將變?yōu)椴豢赡?所以，有必要開展環(huán)保、經(jīng)濟(jì)的紫娟茶中花青素的提取方法的研究.基于此，本試驗(yàn)利用食品級(jí)檸檬酸為酸化劑，純凈水為提取溶劑，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化紫娟茶中花青素提取工藝，以期獲得高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的提取方法，為擴(kuò)大紫娟茶花青素在食品、藥品以及化妝品等與紫娟茶相關(guān)的延伸產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

紫娟茶曬青綠茶(云南省農(nóng)科院茶葉研究所提供)，粉碎后作為分析樣品備用；無(wú)水乙醇、鹽酸(均為分析純，無(wú)錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司)，無(wú)水檸檬酸(食品級(jí)，山東優(yōu)索化工科技有限公司)；純凈水(昆明珍茗食品有限責(zé)任公司).

1.2 儀器與設(shè)備

JA1003型電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，756CRT型紫外可見分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)，HH-S28型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)，AQ-180E型食品加工機(jī)(慈溪市耐歐電器有限公司).

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 單因素優(yōu)化試驗(yàn) 參考李璐等[19]的方法并加以調(diào)整，取1.000 g 樣品，以0.07%檸檬酸水溶液作為溶劑，料液比為1∶35，在70 ℃提取15 min的條件下，保持其它因素不變，只改變其中一個(gè)因素，設(shè)置提取溫度40、50、60、70、80 ℃，料液比1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45(M∶V)，提取時(shí)間5、10、15、20、25 min，以花青素質(zhì)量濃度為指標(biāo)，試驗(yàn)重復(fù)3次，開展單因素試驗(yàn).

參考文獻(xiàn)[20-21]的方法，吸取4 mL花青素待測(cè)液于刻度試管內(nèi)，加入6 mL酸性乙醇(作為顯色劑)，顯色30 min后，于535 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，用1 cm比色皿，并用酸性乙醇做空白.試驗(yàn)數(shù)據(jù)需要重復(fù)測(cè)定3次.

根據(jù)公式計(jì)算其花青素的質(zhì)量濃度：

花青素質(zhì)量濃度(mg/mL)=[(A待測(cè)樣-A對(duì)照樣)×101.83]/[吸取供液量(mL)×樣品干質(zhì)量(g)]

1.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 基于單因素考察結(jié)果，在較優(yōu)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行分析試驗(yàn)[22]，確定以水為溶劑優(yōu)化提取花青素的工藝條件，因素水平如表1所示.

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)采用Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)制圖，SPSS 24軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Design Expert 12軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同水浴溫度對(duì)花青素提取效果的影響 控制處理?xiàng)l件為提取時(shí)間15 min、料液比1∶35(M∶V)，考察在提取溫度分別為40、50、60、70、80 ℃時(shí)紫娟茶花青素質(zhì)量濃度，結(jié)果見圖1.由圖1可知，花青素質(zhì)量濃度隨著溫度的提高而上升，至70 ℃達(dá)到最高值(6.314±0.294)mg/mL，且與其他溫度所提取花青素質(zhì)量濃度有顯著差異(P<0.05).雖然溫度高有利于花青素的提取，但花青素?zé)岱€(wěn)定性較差，在高溫環(huán)境下較易分解，因此隨著溫度的繼續(xù)上升，花青素質(zhì)量濃度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì).故選用溫度為60 ℃、70 ℃及80 ℃用于后續(xù)響應(yīng)面法試驗(yàn).

2.1.2 不同料液比對(duì)花青素提取效果的影響 以0.07%檸檬酸水溶液為溶劑，不同提取溫度單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，設(shè)定提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間為15 min，考察不同料液比(1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45)紫娟茶花青素質(zhì)量濃度.由圖2可知，花青素質(zhì)量濃度隨著料液比的增大而上升，至料液比為1∶35時(shí)達(dá)到最高值(5.694±0.480)mg/mL，且與其他料液比所提取花青素質(zhì)量濃度有顯著差異(P<0.05).當(dāng)料液比達(dá)到1∶40時(shí)，提取率不升反降.因此，考慮到提取效果以及提取成本等因素，選擇1∶30、1∶35以及1∶40用于響應(yīng)面法試驗(yàn).

不同字母表示差異顯著(P<0.05).Different lower case letters significant show differences.圖1 不同溫度的提取效果比較Figure 1 Comparison of different temperature on the extraction effect

不同字母表示差異顯著(P<0.05).Different lower case letters significant show differences.圖2 不同料液比提取效果比較Figure 2 Comparison of different solid-liquid ratio on the extraction Effect

2.1.3 不同水浴提取時(shí)間對(duì)花青素提取效果的影響 以0.07%檸檬酸水溶液為溶劑，不同提取溫度以及不同料液比單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，設(shè)定提取溫度為70 ℃，料液比為1∶35，考察提取時(shí)間分別在10、12.5、15、17.5、20 min時(shí)紫娟茶花青素質(zhì)量濃度.由圖3可知，花青素質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間從10 min增加到15 min時(shí)，花青素質(zhì)量濃度顯著增加(P<0.05)，最高達(dá)到(5.598±0.170)mg/mL；當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)增加后，花青素質(zhì)量濃度顯著降低(P<0.05)，因過(guò)長(zhǎng)的提取處理會(huì)破壞花青素的結(jié)構(gòu).故選擇12.5 min、15 min以及17.5 min用于響應(yīng)面法試驗(yàn).

不同字母表示差異顯著(P<0.05).Different lower case letters significant show differences.圖3 不同時(shí)間提取效果比較Figure 3 Comparison of different time on the extraction effect

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理與試驗(yàn)，對(duì)溫度、料液比、時(shí)間3個(gè)因素分析得到以下試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2.再通過(guò)Design-Expert 軟件對(duì)響應(yīng)面法試驗(yàn)得到花青素質(zhì)量濃度進(jìn)行方差分析，得到結(jié)果如表3所示.

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

由表3可知，3個(gè)因素對(duì)水提紫娟茶花青素質(zhì)量濃度高低影響的強(qiáng)弱順序依次為：時(shí)間>溫度>料液比，其中時(shí)間對(duì)水提紫娟茶花青素質(zhì)量濃度高低的影響極為顯著(P<0.01)，溫度對(duì)水體紫娟茶花青素質(zhì)量濃度高低的影響為顯著(P<0.05).設(shè)提取溫度、料液比、提取時(shí)間、分別為A、B、C，以花青素質(zhì)量濃度為響應(yīng)值，經(jīng)多元回歸擬合后，得到水提紫娟茶中花青素質(zhì)量濃度回歸方程：花青素質(zhì)量濃度=6.29+0.358 1A-0.318 6B-0.537 6C-0.112 5AB+0.234 5AC-0.130 4BC-0.717 3A2-0.189 3B2+0.000 5C2.失擬值不顯著(P>0.05)，表明該回歸方程擬合程度好.決定系數(shù)接近0.9，表明該模型的準(zhǔn)確性很好.

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因子所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上可形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用[23-25]，根據(jù)水提紫娟茶中花青素質(zhì)量濃度回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面分析圖結(jié)果見圖4.

由圖4知，因子A(溫度)與因子B(料液比)之間所形成的響應(yīng)面曲面坡度在兩因素交互作用響應(yīng)面圖中最為陡峭，即因子A與因子B相互之間具有最強(qiáng)的交互作用.因子A(溫度)與因子C(時(shí)間)之間的交互作用次之，因子B(料液比)與因子C(時(shí)間)之間的交互作用最弱.

通過(guò)響應(yīng)面分析確定水提紫娟茶中花青素工藝為提取溫度為71.288 1 ℃，料液比1∶32.320 1，提取時(shí)間12.5000min，此條件下由公式算出的花青素質(zhì)量濃度為6.882 0 mg/mL.根據(jù)所得的分析數(shù)據(jù)進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)的條件為溫度71.3 ℃，料液比1∶32及提取時(shí)間12.5 min，得到浸提液中花青素質(zhì)量濃度平均值為6.908 mg/mL，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，偏差不大，且優(yōu)于理論值，證明該結(jié)果合理可靠.

不同字母表示差異顯著(P<0.05).Different letters indicate significant differences(P<0.05).圖4 各因素交互作用的響應(yīng)面曲線及等高線Figure 4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors

3 討論

目前，關(guān)于植物中花青素提取工藝的研究已有較多報(bào)道.如肖麗霞等[26]利用酸醇提取紫玉米花青素能得到較高的提取率(27.6 mg/g).楊玲等[27]分析了不同提取溶劑對(duì)紫羅蘭馬鈴薯花青素含量的影響，結(jié)果表明，酸性乙醇溶液提取率最高，為16.2 mg/g.因花青素結(jié)構(gòu)呈極性，故多項(xiàng)研究均用甲醇等極性溶劑.但若要將所提取的花青素直接用于食品以及化妝品開發(fā)應(yīng)用領(lǐng)域，則有必要用水代替酸性極性溶劑.

羅正飛等[17]選用乙醇為溶劑，進(jìn)行正交試驗(yàn)得出提取紫娟茶中花青素條件70%乙醇溶液，以1∶10料液比在80 ℃下回流提取30 min，得出結(jié)果為1.68 mg/mL，遠(yuǎn)低于本試驗(yàn)結(jié)果.費(fèi)旭元等[18]利用響應(yīng)面法對(duì)紫娟中花青素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到結(jié)果為采用酸性甲醇為提取溶劑，提取溫度 29 ℃，提取時(shí)間132 min，料液比1∶26；提取結(jié)果為5.94 mg/mL.但提取時(shí)間超過(guò)2 h，可能導(dǎo)致花青素降解.李璐等[19]同樣對(duì)紫娟茶花青素提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到結(jié)果為酸性甲醇為溶劑、提取溫度為30.5 ℃，料液比為1∶41，提取時(shí)間為60.6 min為最佳提取方案，提取結(jié)果為5.926 mg/mL，與費(fèi)旭元等[18]所得提取結(jié)果基本一致，與本試驗(yàn)提取結(jié)果相比少了將近1 mg/mL，且浸提時(shí)間是本試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果的4倍左右.根據(jù)李燕麗等[28]研究發(fā)現(xiàn)，春季到夏季紫娟茶花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在急劇上升，李璐等[19]所用茶樣與本試驗(yàn)所用茶樣采集月份不同，可能是提取結(jié)果不同的另一原因.涂云飛等[29]使用70%乙醇提取紫娟茶中原花青素發(fā)現(xiàn)提取溫度為70 ℃，原花青素浸出率與其他梯度有顯著差異，這與本試驗(yàn)的71.3 ℃基本一致，但是本試驗(yàn)所用提取時(shí)間較短，可以較大程度減少花青素在提取過(guò)程中的損耗.本試驗(yàn)利用Box- Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理采用響應(yīng)面法對(duì)紫娟茶花青素提取工藝做出了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間對(duì)提取效果影響較大，這與呂海鵬等[30]所得結(jié)果有一定出入，可能是因?yàn)閰魏ｙi等以蒸餾水作為提取溶劑，且沒有添加酸化劑.因花青素結(jié)構(gòu)具有堿性不穩(wěn)定性，前人多在花青素提取體系中加入鹽酸，可增強(qiáng)花青素在提取過(guò)程中的穩(wěn)定性，但鹽酸具有一定的腐蝕性且對(duì)人體有一定毒性，所提取的提取物不能直接用于護(hù)膚品、食品等相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā).因此，本研究在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用0.07%檸檬酸溶液為酸性溶劑，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法優(yōu)化水提紫娟茶中花青素的工藝，并由此將所提取得到的花青素進(jìn)行濃縮用于后續(xù)相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)，能夠在一定程度上降低提取成本.

4 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對(duì)水提紫娟茶中花青素工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定了其最優(yōu)工藝條件為：0.07%檸檬酸溶液為溶劑，提取溫度為71.3 ℃，料液比1∶32(M∶V)，提取時(shí)間12.5 min.在此條件下得到提取結(jié)果為6.908 mg/mL.構(gòu)建了以檸檬酸為酸化劑、純凈水為提取溶劑的一種高效、經(jīng)濟(jì)環(huán)保、工藝可行的紫娟茶花青素提取方法