朱 明，李 巧，余 磊，戴 唯

（1.貴陽(yáng)海關(guān)綜合技術(shù)中心，貴州貴陽(yáng) 550081；2.貴陽(yáng)學(xué)院，貴州生態(tài)環(huán)境中優(yōu)勢(shì)農(nóng)產(chǎn)品殘留農(nóng)藥降解關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550005）

隨著中國(guó)白酒越來(lái)越受世界消費(fèi)者的青睞，國(guó)際市場(chǎng)更加廣泛，因此，要求我國(guó)白酒企業(yè)的釀造工藝更加規(guī)范，衛(wèi)生質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)向國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)靠近[1]。貴州白酒文化歷史悠久，也是我國(guó)傳統(tǒng)白酒發(fā)源地和醬香型白酒的主要產(chǎn)區(qū)，白酒工業(yè)在貴州經(jīng)濟(jì)中占有重要的位置。貴州白酒生產(chǎn)企業(yè)既有茅臺(tái)、國(guó)臺(tái)等大型企業(yè)，也有眾多小作坊，大多數(shù)小作坊廠房簡(jiǎn)陋，設(shè)備陳舊，技術(shù)落后。隨著白酒行業(yè)不斷的發(fā)展，國(guó)內(nèi)白酒行業(yè)各類安全隱患和事件凸顯，甜味劑問(wèn)題等多種白酒事件頻發(fā)，這些問(wèn)題在一定程度上制約了白酒行業(yè)的發(fā)展[2]。據(jù)貴州省市場(chǎng)監(jiān)管局食品不合格情況的通告，2019—2020年貴州省食品安全監(jiān)督抽檢結(jié)果涉及甜味劑的超范圍使用問(wèn)題，其中白酒中不合格項(xiàng)目包括甜蜜素、糖精鈉、三氯蔗糖等甜味劑[3-4]。

甜味劑是賦予食品甜味的物質(zhì)，是一類重要的食品添加劑，已在美國(guó)、歐盟及中國(guó)等100 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛使用，有的品種使用歷史已超過(guò)100年[5]。甜味劑有人工和天然之分，在食品中適量添加可改善食品風(fēng)味，但長(zhǎng)期大量攝入人工甜味劑可能會(huì)導(dǎo)致高血糖、葡萄糖耐受不良、肥胖等代謝系統(tǒng)性疾病[6]。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，復(fù)合甜味劑的使用和新型甜味劑的開(kāi)發(fā)成為發(fā)展的潮流和趨勢(shì)，但這也對(duì)監(jiān)管提出了新的挑戰(zhàn)[7]。我國(guó)GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)范管理使用的甜味劑有甜菊糖苷、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、安賽蜜、甘草、木糖醇、麥芽糖醇等十余種，可以用于面包、糕點(diǎn)、餅干、飲料、調(diào)味品等食品中。根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，白酒中不允許添加天然或人工合成甜味劑[8]。因此白酒中檢出甜味劑屬于超范圍使用，原因可能是生產(chǎn)企業(yè)為增加產(chǎn)品的某方面口感，在產(chǎn)品中添加甜味劑來(lái)調(diào)節(jié)，也可能是原輔料帶入的因素。

食品中甜味劑的分析方法有液相色譜法[9-16]、氣相色譜法[17-20]、拉曼光譜法[20]、離子色譜法[21-24]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[25-50]。液相色譜檢測(cè)時(shí)由于甜蜜素與三氯蔗糖的紫外吸收較弱，不適宜使用紫外檢測(cè)器，使得多種甜味劑同時(shí)檢測(cè)受到限制，氣相色譜檢測(cè)甜蜜素需要衍生化且會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性情況。上述幾種檢測(cè)方法抗干擾能力弱、靈敏度低及特異性不強(qiáng)。目前檢測(cè)機(jī)構(gòu)多采用液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法檢測(cè)白酒中甜味劑，但低分辨率質(zhì)譜的缺點(diǎn)是必須采用標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)做定性的依據(jù)。鑒于此，本研究針對(duì)白酒樣品的特性，建立了一種基于超高效液相色譜串聯(lián)靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)白酒中10 種甜味劑的快速檢測(cè)方法，該方法前處理簡(jiǎn)單、快速，不僅可以實(shí)現(xiàn)甜味劑的精準(zhǔn)定性，同時(shí)可完成準(zhǔn)確定量，為白酒中甜味劑檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

酒樣：市售某品牌白酒樣品。

甜味劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：安賽蜜（德國(guó)Dr 公司，批號(hào)：G137930）；甜蜜素（北京壇墨公司，批號(hào)：A1910277）；D(+)-甘露糖（德國(guó)Dr 公司，批號(hào)：G832837）；D-山梨糖醇（德國(guó)Dr 公司，批號(hào)：G145145）；糖精鈉（德國(guó)Dr 公司，批號(hào)：G154497）；阿斯巴甜（德國(guó)Dr 公司，批號(hào)：G132138）；阿力甜（加拿大Toronto Research Chemicals 公司，批號(hào)：A536500）；麥芽糖醇（美國(guó)TMstandard 公司，批號(hào)2221805）；紐甜（上海安譜公司，批號(hào)：44760100）；三氯蔗糖（德國(guó)Dr 公司，批號(hào)：G125127）；乙酸銨（色譜純，天津科密歐公司）；甲醇（色譜純，美國(guó)默克公司）；純水（18.2Ω，美國(guó)密理博公司）。

儀器設(shè)備：超高效液相色譜（美國(guó)賽默飛世爾公司，Ultimate-3000）和靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛世爾公司，Q-Exactive）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取樣品1.00 g，用純水定容至10.0 mL，混勻，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后測(cè)定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別用純水溶解后配制成1000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃冷藏保存。準(zhǔn)確吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液繪制1.0～100 ng/mL 工作曲線。

1.2.3 色譜條件

ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫35 ℃。流動(dòng)相為0.01 mol/L 乙酸銨溶液和甲醇；流速0.3 mL/min；采用梯度洗脫（見(jiàn)表1）；進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫條件

1.2.4 質(zhì)譜條件

可加熱點(diǎn)噴霧離子源（HESI），負(fù)離子檢測(cè)模式；鞘氣流速：12 L/min（即40 arb）；輔助氣流速：3.6 L/min（即12 arb）；吹掃氣流速：0 L/min；噴霧電壓：3000 V；毛細(xì)管溫度：325 ℃；輔助氣加熱溫度：350 ℃；掃描模式：一級(jí)全掃描+數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)掃描（Full scan+ddms2），母粒子掃描分辨率：70000，最大注入時(shí)間：200 ms，掃描范圍100～500 m/z，子粒子掃描分辨率：17500，觸發(fā)閾值：1×105，最大注入時(shí)間：50 ms。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理的選擇

在一個(gè)檢測(cè)過(guò)程中，樣品前處理通常會(huì)占用全程時(shí)間的50 %以上，因此在不影響檢測(cè)結(jié)果的前提下采用簡(jiǎn)單、無(wú)損、低成本、環(huán)境友好的前處理方法是最優(yōu)選擇。針對(duì)白酒樣品，本方法采用樣品用水稀釋10 倍后直接上機(jī)檢測(cè)，結(jié)合色譜柱分離和精確質(zhì)量數(shù)定性定量，未見(jiàn)有基質(zhì)干擾和基質(zhì)效應(yīng)。

2.2 流動(dòng)相的選擇

本文對(duì)常用的流動(dòng)相甲醇-水和乙腈-水進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明，使用甲醇效果略好于乙腈。同時(shí)，將0.1 %甲酸水溶液和0.01 mol/L 乙酸銨溶液分別與甲醇作流動(dòng)相進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中含有0.1%甲酸時(shí)，部分甜味劑峰形拖尾，而用0.01 mol/L乙酸銨時(shí)，響應(yīng)較高，同時(shí)峰形較好。因此，本文采用0.01 mol/L乙酸銨水溶液-甲醇作流動(dòng)相。

2.3 質(zhì)譜參數(shù)的選擇

采用Xcalibur 2.1 軟件計(jì)算的化合物加合離子的理論單一同位素的精確質(zhì)量數(shù)作為提取色譜圖的依據(jù)，表2 列出了10 種甜味劑的分析參數(shù)。理論精確質(zhì)量數(shù)與實(shí)測(cè)精確質(zhì)量數(shù)的相對(duì)偏差越小，則篩查結(jié)果的可信程度越高。

從表2 可看出，10 甜味劑的質(zhì)量數(shù)相對(duì)偏差全部＜3 μg/kg，按照歐盟2002/657/EC 增加的LC/MS目標(biāo)準(zhǔn)則，篩查要求質(zhì)量精度在±50 mDa 之間，分辨率＞10000，因此可根據(jù)保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)對(duì)白酒中非法添加甜味劑進(jìn)行快速篩查與確證。10種甜味劑相關(guān)色譜和質(zhì)譜信息見(jiàn)表2和圖1。

2.4 線性范圍和最低檢出限

關(guān)于高分辨質(zhì)譜的最低檢出限，有報(bào)道以10倍信噪比所對(duì)應(yīng)的濃度值作為最低檢出限[51-52]，但由于高分辨質(zhì)譜提取目標(biāo)離子的精確質(zhì)量數(shù)，基線噪音極低，以此方法計(jì)算出的最低檢出限與方法的真實(shí)性存在差距。本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)空白提取液逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至儀器所能檢出的最低濃度，該濃度應(yīng)滿足在較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)多次平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較低，然后將該濃度做為方法的最低檢出限。見(jiàn)表3。

表2 10種甜味劑的分子式、保留時(shí)間、理論精確質(zhì)量數(shù)和實(shí)測(cè)精確質(zhì)量數(shù)

圖1 10種甜味劑提取離子色譜圖和二級(jí)質(zhì)譜圖

表3 10種甜味劑的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限和回歸方程

表4 10種甜味劑加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.5 方法的回收率和精密度

以1 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg 3 個(gè)水平添加到空白樣品中，測(cè)定回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表4。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了超高效液相色譜串聯(lián)靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜快速檢測(cè)白酒中10 種甜味劑的方法，白酒樣品用水稀釋后即可直接進(jìn)樣分析，采用ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱同時(shí)對(duì)安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、紐甜、麥芽糖醇、阿力甜、D-山梨糖醇、D-甘露糖及三氯蔗糖進(jìn)行色譜分離檢測(cè)，并采用高分辨質(zhì)譜與二級(jí)離子碎片進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析。實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果表明，該方法能夠滿足白酒中10 種甜味劑的精準(zhǔn)定性和準(zhǔn)確定量的快速檢測(cè)，極大地提高了分析效率和準(zhǔn)確性。