劉延波，劉洋洋，趙志軍，吳俊儀，王 賢，潘春梅，孫西玉*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院（酒業(yè)學(xué)院），河南 鄭州 450046；2.河南仰韶酒業(yè)有限公司博士后創(chuàng)新實(shí)踐基地，河南 澠池 472400；3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 河南省白酒風(fēng)格工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046；4.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 鄭州市白酒釀造微生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046；5.賒店老酒股份有限公司，河南 社旗 473300；6.河南張弓老酒酒業(yè)有限公司，河南 寧陵 476733）

濃香型白酒是中國白酒銷售市場的主力，具有窖香濃郁、綿柔醇厚、香味和諧、尾凈余長的特征[1]。濃香型白酒的制作主要是以酒醅和窖池為基礎(chǔ)，依靠大曲、窖泥和空氣中的一些微生物在白酒釀造的窖池中進(jìn)行極其龐大的物質(zhì)與能量代謝的流程。酒醅是釀制白酒的原料經(jīng)過微生物融合后發(fā)酵的物質(zhì)，也是酒精發(fā)酵過程中物質(zhì)能量代謝最活躍的反應(yīng)中心[2]。在白酒的窖池環(huán)境中，酒醅充當(dāng)著信息傳導(dǎo)、物質(zhì)循環(huán)和能量流動的“三流運(yùn)行”定律的介質(zhì)[3]。酒醅之中的揮發(fā)性成分則直接影響著白酒酒體的口感與風(fēng)味[4]。

纖維素是由β-葡聚糖苷鍵將葡萄糖相連接而成的多聚糖，其降解需內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三種酶的協(xié)作作用，才能夠?qū)⑵浞纸鉃槠咸烟?，這一原理廣泛應(yīng)用于工業(yè)制造中[5-6]。白酒發(fā)酵的酒醅中含有許多種類的產(chǎn)生纖維素酶的菌株，它們所形成的纖維素酶對于白酒的生產(chǎn)品質(zhì)起著十分關(guān)鍵的作用，其不僅能夠影響到白酒中的有機(jī)酸、酯、醇、醛等風(fēng)味成分的產(chǎn)量，而且能夠提高白酒的出酒效率[7]。

迄今為止也有較多關(guān)于高產(chǎn)纖維素酶菌株的報道，但大部分是從土壤和腐爛的植物葉片中篩選出來的[8-12]，而從酒醅中進(jìn)行篩選高產(chǎn)纖維素酶菌株的研究較少[13]。本試驗(yàn)擬從賒店老酒濃香型白酒酒醅中篩選出一株高產(chǎn)纖維素酶的菌株，對該菌株進(jìn)行分離鑒定和產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，以便將其應(yīng)用于酒糟中纖維素的降解，從而提高白酒的出酒率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅樣品：取自賒店老酒股份有限公司。

羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose-Na，CMC-Na）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、柱式細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒：天根生化科技有限公司。

CMC-Na培養(yǎng)基：CMC-Na 1.5%，KH2PO40.1%，NH4NO30.1%，瓊脂2%，酵母膏0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH為自然條件（CMC-Na液體培養(yǎng)基不加瓊脂）。

剛果紅纖維素固體培養(yǎng)基：CMC-Na 1.5%，瓊脂2%，KH2PO40.1%，NH4NO30.1%，MgSO4·7H2O 0.05%。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：CMC-Na l%，酵母膏0.02%，蛋白胨0.3%，（NH4）2SO40.2%，CaC12·2H2O0.03%，MgSO4·7H2O0.03%，KH2PO40.4%。以上培養(yǎng)基均在121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9272BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；Z-211恒溫培養(yǎng)搖床：上海知楚儀器有限公司；LDZX-50KBS立式高壓滅菌器：上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州方科儀器（常州）有限公司；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 纖維素酶生產(chǎn)菌株的分離與初篩

將酒醅樣品溶入無菌水中，稀釋為一系列不同的稀釋度，取10-3、10-4、10-5這3個稀釋梯度，將其分別涂布于CMC-Na培養(yǎng)基上，每個稀釋度取100 μL涂布于3個平板，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[14]，反復(fù)分離劃線至單個菌落。

在剛果紅纖維素固體培養(yǎng)基上接種通過分離和篩選獲得的單個菌落，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d之后用剛果紅溶液（1 mg/mL）染色30 min，再采用蒸餾水清洗，最后用NaCl溶液（1 mol/L）進(jìn)行30 min脫色。觀察菌落的周圍是否存在透明圈，記錄透明圈的直徑和菌落的直徑的比值，并將產(chǎn)纖維素酶活較佳的菌種進(jìn)行保存[15-16]。

1.3.2 高產(chǎn)纖維素酶菌株復(fù)篩

將初步篩選得來的菌株接種到CMC-Na液體培養(yǎng)基中，并于搖床（37 ℃、150 r/min）中培養(yǎng)2 d獲得均勻的種子溶液，然后按5%的比例分別接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中于搖床（37 ℃、150 r/min）中培養(yǎng)3 d，將發(fā)酵液以8 000 r/min離心10 min，所取上清液作為粗酶液[17]。以3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測定羧甲基纖維素酶（CMC）活力和濾紙酶（filter paper activity，F(xiàn)PA）活力，最后根據(jù)所測酶活性值選擇高產(chǎn)纖維素酶菌株。

羧甲基纖維素酶酶活力的定義：在50 ℃條件下，1 mL酶液在1 min內(nèi)水解底物所生成1 μg的葡萄糖所消耗的酶量為1個酶活力單位，U/mL。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取25 mL試管分別添加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（2 mg/mL）0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL，添加蒸餾水至2 mL，然后加入DNS試劑3 mL，于沸水中煮沸5 min，待其冷卻，再添加蒸餾水，定容至15 mL，充分搖勻，用分光光度計在波長540 nm處測量并記錄吸光度值，以葡萄糖含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.864x+0.030 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 9。

CMC酶活測定：分別向4支試管中（1支空白試管，3支樣品試管），加入用醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.8）所配制的1%CMC-Na溶液1.5 mL，再加入0.50 mL一定稀釋比例的粗酶液（空白管中加入蒸餾水），混勻。將4支試管于（50±0.1）℃水浴中反應(yīng)30 min，然后將3 mL DNS試劑快速添加到每個試管中并充分搖勻。將4支試管同時進(jìn)行5 min沸水浴加熱后取出冷卻至室溫，再添加蒸餾水至15 mL并搖動，以空白管作為對照液進(jìn)行調(diào)零，檢測其波長540 nm處的OD540nm值[18]。

FPA酶活測定：分別向4支試管中（1支空白管，3支樣品管），加入1.5 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH4.8）和（50±0.5）mg濾紙，然后加入稀釋一定比例的粗酶液0.50 mL（空白管加蒸餾水），使濾紙完全浸沒試管內(nèi)溶液。將4支試管一并置于（50±0.1）℃水浴，反應(yīng)60 min，之后立即向各試管中加入DNS試劑3.0 mL，搖勻。后續(xù)試驗(yàn)操作同上[19]。

1.3.3 菌種的鑒定

形態(tài)學(xué)特征初步鑒定：對菌落形態(tài)特征、顏色、大小、革蘭氏染色等進(jìn)行觀察。

生理生化試驗(yàn)鑒定參照文獻(xiàn)[20]。

分子生物學(xué)鑒定：以總DNA為模板，利用16S rDNA的1492R和27F通用引物開展聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)過凝膠電泳后采用凝膠成像系統(tǒng)觀察，再進(jìn)行測序與拼接，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)中進(jìn)行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對后，采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 產(chǎn)酶條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

分別考察不同氮源、碳源、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、初始pH值等單因素對菌株產(chǎn)纖維素酶能力的影響。

不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響：分別以CMC-Na、麩皮、蔗糖、葡萄糖、淀粉作為液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基單一碳源（添加量為1.5%），接種量為5%，37 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)72 h后測定酶活性[21-22]。確定最適碳源后，改變碳源添加量分別為1%、2%、3%、4%、5%，按上述條件測定酶活以確定碳源添加量。

不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響：分別以蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨、尿素、酵母粉作為液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基單一氮源（添加量為0.1%），接種量為5%，37 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)72 h后測定酶活性。確定最適氮源后，改變氮源添加量分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，按上述條件測定酶活以確定氮源添加量。

培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)酶的影響：在接種量為5%的條件下，將液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基于恒溫?fù)u床中37 ℃、150 r/min分別培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d后測定酶活性。

培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶的影響：在接種量為5%的條件下，將液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基分別置于28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃恒溫?fù)u床中150 r/min培養(yǎng)72 h后測定酶活性[23]。

培養(yǎng)基的初始pH對菌株產(chǎn)酶的影響：在接種量為5%的條件下，用檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基的初始pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，37 ℃恒溫?fù)u床中150 r/min培養(yǎng)72 h后測定酶活性[16]。

1.3.5 產(chǎn)酶條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用DesignExpert8.0.6軟件，確定3因素3水平的最佳參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面分析研究，優(yōu)化產(chǎn)纖維素酶菌株的產(chǎn)酶條件。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平編碼見表1。

表1 菌株4-2產(chǎn)酶條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for optimization of enzyme production conditions by strain 4-2

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的分離與篩選

將樣品酒醅稀釋液涂布于CMC-Na培養(yǎng)基上培養(yǎng)，共分離篩選出89株菌株，進(jìn)一步將菌株點(diǎn)種于剛果紅纖維素固體培養(yǎng)基上，用剛果紅溶液進(jìn)行染色。測透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值（D/d），篩選得到8株D/d值較大的菌株。將篩選得到的8株菌株接種到羧甲基纖維素鈉液體培養(yǎng)基中，測定CMC酶活、FPA酶活。結(jié)果見表2。

表2 菌株水解圈直徑與菌落直徑比值及酶活力測定結(jié)果Table 2 Determination results of hydrolysis circle diameter to colony diameter ratio and enzyme activity of strain

由表2可知，菌株4-2酶活力最高，其CMC酶活達(dá)149.93 U/mL，F(xiàn)PA酶活達(dá)92.90 U/mL。

2.2 菌株4-2的形態(tài)學(xué)鑒定及生理生化試驗(yàn)

在37 ℃條件下，將菌株4-2于CMC培養(yǎng)基中培育1 d后，觀察菌株的菌落形態(tài)，結(jié)果表明，菌株的菌落顏色為乳白色，表面濕潤、不透明，菌落為規(guī)則的圓形或者橢圓形。顯微鏡下觀察的革蘭氏染色結(jié)果為紫色，菌株形態(tài)為短桿狀，說明菌株4-2為革蘭氏陽性菌。菌株4-2的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 菌株4-2生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of physiological and biochemical experiments of strain 4-2

由表3可知，菌株4-2可水解淀粉、V.P試驗(yàn)、明膠液化、硝酸鹽還原均為陽性，而吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)均為陰性。

2.3 菌株4-2的分子生物學(xué)鑒定

菌株4-2的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖1所示。由圖1可知，菌株4-2與Bacillus tequilensis相似性達(dá)100%。結(jié)合菌株4-2的生理生化結(jié)果、菌落形態(tài)特征及16S rDNA分析，鑒定菌株4-2為特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）。

圖1 基于16S rDNA基因序列菌株4-2的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain 4-2 based on 16S rDNA gene sequences

2.4 不同條件對菌株4-2產(chǎn)酶的影響

2.4.1 不同碳源對菌株4-2產(chǎn)酶的影響

由圖2可知，液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基碳源為淀粉時，CMC酶活力最高，為2 028.01 U/mL，由此確定，淀粉為該菌株產(chǎn)酶的最佳碳源。由圖3可知，在淀粉添加量為3%時，該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶能力最好，CMC酶活達(dá)2 403.78 U/mL，F(xiàn)PA酶活達(dá)2 234.65 U/mL。由此確定，該菌株產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基碳源添加量為3%。

圖2 不同碳源對菌株4-2產(chǎn)酶活力影響Fig.2 Effect of different carbon sources on the activity of enzyme produced by strain 4-2

圖3 淀粉添加量對菌株4-2產(chǎn)酶活力影響Fig.3 Effect of starch addition on the activity of enzyme produced by strain 4-2

2.4.2 不同氮源對菌株4-2產(chǎn)酶的影響

由圖4可知，液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基氮源為酵母粉時，CMC酶活最高，為195.83 U/mL，由此確定，酵母粉為該菌株產(chǎn)酶的最佳氮源。由圖5可知，當(dāng)酵母粉添加量為0.6%時，該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶能力最好，CMC酶活達(dá)199.88 U/mL，F(xiàn)PA酶活達(dá)133.71 U/mL。由此確定，該菌株產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基氮源添加量為0.6%。

圖4 不同氮源對菌株4-2產(chǎn)酶活力影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on the activity of enzyme produced by strain 4-2

圖5 酵母粉添加量對菌株4-2產(chǎn)酶活力影響Fig.5 Effect of yeast powder addition on the activity of enzyme produced by strain 4-2

2.4.3 不同培養(yǎng)溫度對菌株4-2產(chǎn)酶的影響

由圖6可知，培養(yǎng)溫度為34 ℃時，菌株4-2發(fā)酵產(chǎn)酶能力最好，CMC酶活達(dá)115.59 U/mL，F(xiàn)PA酶活達(dá)111.73 U/mL。由此確定，該菌株產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)溫度為34 ℃。

圖6 不同培養(yǎng)溫度對菌株4-2產(chǎn)酶活力影響Fig.6 Effect of different temperature on the activity of enzyme produced by strain 4-2

2.4.4 不同初始pH對菌株4-2產(chǎn)酶的影響

由圖7可知，在初始pH值=5時，菌株4-2發(fā)酵產(chǎn)酶能力最好，CMC酶活達(dá)206.64 U/mL，F(xiàn)PA酶活達(dá)120.22 U/mL。由此確定，該菌株產(chǎn)酶的培養(yǎng)基最佳初始pH值為5。

圖7 不同初始pH值對菌株4-2產(chǎn)酶活力影響Fig.7 Effect of different initial pH value on the activity of enzyme produced by strain 4-2

2.4.5 不同培養(yǎng)時間對菌株4-2產(chǎn)酶的影響

由圖8可知，菌株4-2在培養(yǎng)5 d的時候，發(fā)酵產(chǎn)酶能力最好，CMC酶活達(dá)223.61 U/mL，F(xiàn)PA酶活達(dá)108.64 U/mL。由此確定，該菌株產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)時間為5 d。

圖8 不同培養(yǎng)時間對菌株4-2產(chǎn)酶活力影響Fig.8 Effect of culture time on the activity of enzyme produced by strain 4-2

2.5 產(chǎn)酶條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.5.1 響應(yīng)面設(shè)計、回歸模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

由表4、表5可知，回歸模型F值為489.14，且顯著性檢驗(yàn)為極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.892 7＞0.05），說明該模型可靠。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果表5對各因素試驗(yàn)結(jié)果的影響進(jìn)行二次擬合，經(jīng)回歸擬合，得回歸方程：

回歸方程決定系數(shù)（R2）=99.84%，表明該模型可以解釋99.84%的酶活變化，非常適合實(shí)際的情況。該方程式提供了適用于菌株4-2產(chǎn)纖維素酶的模型，因此該模型可用于代替實(shí)際試驗(yàn)點(diǎn)，以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和纖維素酶生產(chǎn)能力的預(yù)測。

表4 菌株4-2產(chǎn)酶條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table 4 Design and results of response surface experiments for optimization of enzyme production conditions by strain 4-2

表5 回歸模型的方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

2.5.2 各因素交互作用的響應(yīng)面圖

采用Design-Expert 8.0.6軟件得到二次響應(yīng)面回歸模型，并分析和創(chuàng)建相應(yīng)的響應(yīng)面。利用回歸模型繪制的響應(yīng)面及等高線見圖9。對獲得的回歸擬合方程中的三個變量分別求一階偏導(dǎo)數(shù)，組成方程組求解。所得結(jié)果即為最大酶活力時菌株4-2所需最佳發(fā)酵條件，為A=3.53，B=0.59，C=5.75。根據(jù)實(shí)際操作條件即得最佳發(fā)酵條件為：淀粉添加量為3.5%，酵母粉添加量為0.6%，初始pH為5.8，在此優(yōu)化條件下，理論上預(yù)測的CMC最大酶活為3 058.15 U/mL，重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)的CMC酶活實(shí)際值為3 101.83 U/mL，是優(yōu)化前的20.69倍?；旧吓c預(yù)測值接近，說明所構(gòu)建的模型具有良好且穩(wěn)定的擬合性能。

圖9 淀粉添加量、酵母粉添加量與初始pH值交互作用對菌株4-2產(chǎn)酶活力影響的響應(yīng)曲面與等高線Fig.9 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between starch addition,yeast powder addition and initial pH on the activity of enzyme produced by strain 4-2

3 結(jié)論

本研究通過剛果紅染色測透明圈法初篩和DNS法復(fù)篩，從賒店老酒酒醅中篩選出1株產(chǎn)纖維素酶能力高的菌株4-2，通過形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株為特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）。通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)確定該菌株產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)條件為液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，淀粉添加量3.5%，酵母粉添加量0.6%，初始pH 5.8，培養(yǎng)時間5 d，培養(yǎng)溫度34 ℃。在此優(yōu)化條件下，該菌株產(chǎn)纖維素酶活力達(dá)3 101.83 U/mL，是優(yōu)化前的20.69倍。