鄧 磊，張 豪，鄭穗平

（華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006）

L-組氨酸（L-histidine）是含有咪唑基團的半必需堿性氨基酸，因其具有免疫調(diào)節(jié)[1]和抗氧化[2]等多種生理功效而被廣泛應(yīng)用于食品[3]、飼料[4]和醫(yī)藥[5]等領(lǐng)域。以血粉等天然蛋白質(zhì)為原料的水解提取法是目前L-組氨酸的主要生產(chǎn)方式，但由于單一分離組氨酸成本高、提取損失率高等因素導(dǎo)致該方法在組氨酸大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用受到限制[6]。發(fā)酵法是最理想的氨基酸生產(chǎn)方法，通過發(fā)酵法生產(chǎn)的L-谷氨酸[7]、L-賴氨酸[8]等大宗氨基酸品種早已形成產(chǎn)業(yè)化。然而L-組氨酸是為數(shù)不多的幾種未能實現(xiàn)大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的氨基酸品種之一，因此選育L-組氨酸產(chǎn)生菌株對加快發(fā)酵法生產(chǎn)L-組氨酸具有非常重要的意義。然而由于從頭合成L-組氨酸的途徑長、代謝調(diào)控復(fù)雜，完全利用系統(tǒng)代謝工程改造菌株難度大并且L-組氨酸產(chǎn)量提高不明顯[9]。通過選育氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株獲得氨基酸產(chǎn)生菌株，依然是目前氨基酸發(fā)酵常規(guī)育種的有效方法[10]。

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）是一種新型的誘變技術(shù)，因其具有突變率高、環(huán)境友好、操作安全等優(yōu)勢[11]，已被廣泛應(yīng)用于氨基酸[12]、維生素[13]、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）[14]等高產(chǎn)菌株的選育。雖然ARTP誘變在突變庫容量、突變率等方面發(fā)揮的巨大優(yōu)勢，但突變后的菌株仍然面臨篩選工作量大的問題。近期基于微流控技術(shù)開發(fā)出的全自動高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)（microbialmicrodropletculturesystem，MMC）[15]具有高通量、自動培養(yǎng)、自動傳代、化學(xué)因子梯度添加、在線檢測液滴的生長以及微生物分選等功能，目前已被用于菌種壓力富集篩選[16]、菌種適應(yīng)性進化[17]等方面的研究。

為了獲得L-組氨酸過量產(chǎn)生菌株，以野生型谷氨酸棒桿菌ATCC 14067為出發(fā)菌株，首先利用常壓室溫等離子體（ARTP）對菌株進行誘變處理，然后通過全自動高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)（MMC）和平板相結(jié)合選育耐受高濃度組氨酸結(jié)構(gòu)類似物的抗性突變株。通過孔板發(fā)酵初篩以及搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，分析各個結(jié)構(gòu)類似物抗性突變體產(chǎn)L-組氨酸的能力并確定最佳L-組氨酸產(chǎn)生菌株。菌株選育流程如下：

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與主要試劑

野生型谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC 14067：美國菌株保藏協(xié)會購買并保存于實驗室。

L-組氨酸（L-histidine，L-His）、D-組氨酸（D-His）、對氨基苯磺酸（純度99.5%）、玉米漿：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；3-氨基-1,2,4-三氮唑（3-amino-1,2,4-triazole，AMT）（純度96%）、3-（N-嗎啉基）丙磺酸（3-morpholinopropanesulfonic acid，MOPS）（純度99.5%）：上海麥克林生化科技股份有限公司；腦心浸液（brain heart infusion，BHI）：美國BD公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

腦心浸液培養(yǎng)基：腦心浸液37 g/L，固體培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g/L，調(diào)pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

選擇培養(yǎng)基：BHI固體培養(yǎng)基滅菌冷卻至60 ℃左右后，添加過濾除菌的不同質(zhì)量濃度的L-組氨酸類似物3-氨基-1,2,4-三氮唑（AMT）和（或）D-組氨酸（D-His），制成組氨酸類似物抗性平板。

種子培養(yǎng)基：（NH4）2SO45 g/L，玉米漿35 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，調(diào)pH 至7.0，121 ℃滅菌20 min；葡萄糖25 g/L單獨滅菌。

發(fā)酵培養(yǎng)基：（NH4）2SO420 g/L，KH2PO41 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，3-（N-嗎啉基）丙磺酸（MOPS）42 g/L，調(diào)pH 7.0，121 ℃滅菌20 min；葡萄糖40 g/L，尿素5 g/L分別單獨滅菌；FeSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，CaCl210 mg/L，ZnSO4·7H2O 1 mg/L，NiCl2·6H2O 0.02 mg/L，CuSO40.2 mg/L，生物素0.2 mg/L，原兒茶酸0.03 mg/L，硫胺素HCl 0.1 mg/L（上述微量元素、生物素、硫胺素HCl、原兒茶酸配制母液并過濾除菌后按上述質(zhì)量濃度加入）。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2802S型分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；ARTP-M誘變系統(tǒng)、MMC-B微生物液滴細胞培養(yǎng)儀：天木生物科技有限公司；5810R臺式離心機：德國Eppendorf公司；恒溫培養(yǎng)搖床：上海知楚儀器有限公司；DHP-9052A電熱恒溫培養(yǎng)箱：紹興市景邁儀器設(shè)備有限公司；L550湘儀離心機：濟南千司生物技術(shù)有限公司；48深孔板：上海甘薇生物科技有限公司；48淺孔板：美國康寧公司。

1.3 方法

1.3.1 ARTP誘變

將活化的菌液轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基，控制起始OD600nm值為0.2～0.3，待培養(yǎng)OD600nm值為0.8～1.0時離心收集菌體。用無菌生理鹽水洗滌3次，再將菌體稀釋至OD600nm值為0.6～0.8。取10 μL菌液均勻涂抹在載片上，隨后載片放入ARTP儀器樣品板中，與等離子炬噴嘴對齊并暴露于輻射下。ARTP誘變參數(shù)：載片與氣流端口距離2 mm；射頻功率100 W；氣流量10 SLM；溫度25～35 ℃。實驗中各個組ARTP處理為0、30～270 s，處理過后的載片用1 mL 的0.85%無菌生理鹽水洗下菌體并稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，取100 μL均勻涂抹于BHI培養(yǎng)基固體平板上，每組設(shè)置3個平行，30 ℃培養(yǎng)3～4 d后進行單菌落計數(shù)，并計算致死率，其計算公式如下：

式中：A為未經(jīng)ARTP誘變處理對照菌的總菌落數(shù)，CFU/mL；B為經(jīng)ARTP誘變處理后對應(yīng)的總菌落數(shù)，CFU/mL。

1.3.2 誘變菌株篩選

初篩：根據(jù)菌落生長的大小、圓整和豐度，從組氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性平板上隨機挑選單菌落進行孔板篩選。種子培養(yǎng)使用48孔淺孔板，裝液量400 μL，于30 ℃、800 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h；發(fā)酵培養(yǎng)使用48孔深孔板，裝液量800 μL，接種量為10%，每株菌3個平行，于30 ℃、650 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h后，發(fā)酵結(jié)束后用孔板離心機收集上清液進行組氨酸含量測定。

復(fù)篩：將孔板篩選得到的組氨酸生產(chǎn)菌株，進行搖瓶復(fù)篩驗證。種子培養(yǎng)使用250 mL搖瓶，裝液量25 mL，于30 ℃、250 r/min的搖床培養(yǎng)24 h；發(fā)酵培養(yǎng)使用500 mL搖瓶，裝液量30 mL，接種量為10%，每株菌三個平行，于30 ℃、250 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h后，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵上清液組氨酸含量。

1.3.3 AMT抗性菌株馴化

將從組氨酸結(jié)構(gòu)類似物AMT抗性平板篩選得到的組氨酸生產(chǎn)菌株，接種于含有一定質(zhì)量濃度組氨酸結(jié)構(gòu)類似物AMT的BHI培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用新滅菌的BHI培養(yǎng)基將菌液稀釋至OD600nm值為0.8～1.2，之后注入液滴微流控培養(yǎng)儀專用進樣瓶（液滴生成進樣瓶），同時配制一個含低質(zhì)量濃度AMT（2 g/L）的BHI培養(yǎng)基進樣瓶和一個含高質(zhì)量濃度AMT（10 g/L）的BHI培養(yǎng)基進樣瓶。通過MMC設(shè)備使菌株在含組氨酸類似物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)、傳代并伴隨不同質(zhì)量濃度的AMT添加，最后根據(jù)菌株馴化生長情況選擇相應(yīng)液滴，進行收集。

1.3.4L-組氨酸含量的測定

采用Pauly比色法測定發(fā)酵液中組氨酸的含量[18]。L-組氨酸標準曲線的繪制：將配制好的質(zhì)量濃度為0.1 g/L的組氨酸標準溶液分別準確吸取0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL于10 mL比色管中，加入0.2 mL 1%對氨基苯磺溶液和0.2 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻后25 ℃水浴反應(yīng)15 min；反應(yīng)結(jié)束后迅速加入10%碳酸鈉溶液0.6 mL，振蕩10 s后，加入2 mL體積分數(shù)20%的乙醇溶液，混勻后蓋上瓶塞，室溫條件下靜置5 min；之后定容至10 mL。在本實驗條件下利用分光光度計分析反應(yīng)產(chǎn)物最大吸收波長以及對應(yīng)的吸光度值。

1.3.5 細胞生物量測定

將發(fā)酵液稀釋20倍，在波長600 nm處測量吸光度值。

1.3.6 突變菌株遺傳穩(wěn)定性分析

將篩選出的組氨酸生產(chǎn)菌株，接種于BHI液體培養(yǎng)基進行活化，然后將其轉(zhuǎn)移至種子培養(yǎng)基中并連續(xù)轉(zhuǎn)移7次，之后進行搖瓶發(fā)酵，測試突變菌株組氨酸生產(chǎn)能力以及生長狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-組氨酸標準曲線的確定

通過在300～800 nm波長條件下掃描Pauly試劑以及不同濃度的L-組氨酸Pauly顯色產(chǎn)物，結(jié)果見圖1。由圖1a可知，當(dāng)反應(yīng)中有L-組氨酸參與時，在波長500 nm處存在吸收峰；由圖1b可知，在此波長條件下隨著反應(yīng)的L-組氨酸質(zhì)量濃度增加，對應(yīng)的吸光度值也在增加；由圖1c可知，以L-組氨酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，對應(yīng)波長500 nm處吸光度值（y）為縱坐標，繪制L-組氨酸的標準曲線方程為y=13.678x+0.043，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 4，L-組氨酸檢測質(zhì)量濃度在0.01～0.05 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可用于發(fā)酵液中L-組氨酸含量的測定。

圖1 Pauly試劑（a）和L-組氨酸（b）的顯色產(chǎn)物吸光度值檢測結(jié)果及L-組氨酸標準曲線（c）Fig.1 Result absorbance detection of the color product of Pauly reagent (a) and L-histidine (b) and standard curve of L-histidine (c)

2.2 ARTP誘變致死曲線的測定

按照方法1.3.1，對出發(fā)菌野生型谷氨酸棒桿菌ATCC 14067進行ARTP誘變，按照ARTP處理時間為變量，測定菌株致死曲線。如圖2所示，當(dāng)ARTP照射180 s時，菌株致死率可達83.05%；進一步將ARTP處理時間增至210 s時，菌株致死率高達93.26%；而ATRP處理240 s后菌株致死率基本穩(wěn)定在98.11%。根據(jù)之前的研究報道[19]，當(dāng)菌株致死率約為90%時菌株正突變率最高，但由于本實驗ARTP照射時間超過240 s后，幾乎沒有菌體存活下來，因此確定野生型谷氨酸棒桿菌ATCC 14067最佳的誘變時間210 s。

圖2 谷氨酸棒桿菌ATCC 14067 常壓室溫等離子誘變致死曲線Fig.2 Lethal rate curve of Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 mutated by ARTP

2.3 L-組氨酸產(chǎn)生菌的選育

2.3.1 AMT抗性突變株的篩選

將野生型谷氨酸棒桿菌ATCC 14067利用ARTP處理后，分別稀釋涂布于含5種不同質(zhì)量濃度的AMT抗性平板上。從抗性平板上一共挑取264個單菌落，通過孔板發(fā)酵72 h后檢測組氨酸產(chǎn)量，結(jié)果如表1所示。由表1可知，5.0 g/L和4.0 g/L AMT 抗性平板上的菌株明顯比1.0 g/L、2.0 g/L、3 g/L AMT抗性平板的菌株的正突變率要高，這說明從抗性較高的突變菌株中，篩選獲得組氨酸積累菌株的可能性更大。

表1 不同質(zhì)量濃度的3-氨基-1,2,4-三氮唑抗性突變株篩選結(jié)果Table 1 Screening results of resistant mutants by different concentrations of 3-amino-1,2,4-triazole

從117株正突變菌株中，挑選出產(chǎn)量最高的6株菌株（編號為Cg-A1～Cg-A6）與出發(fā)菌株谷氨酸棒桿菌ATCC 14067（編號為Cg-A0）一起進行搖瓶發(fā)酵進一步驗證組氨酸產(chǎn)量以及檢測對應(yīng)的細胞生物量，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，菌株Cg-A1組氨酸產(chǎn)量最高可達（110.39±2.09）mg/L，比出發(fā)菌株提高約493%，但菌株Cg-A1生長OD600nm值較出發(fā)菌株卻下降了38.11%，下降幅度較為明顯。

圖3 菌株Cg-A0和Cg-A1～A6搖瓶發(fā)酵的OD600nm值和L-組氨酸產(chǎn)量Fig.3 OD600nmvalue and L-histidine yields of Cg-A0 and Cg-A1-A6 after shake-flask fermentation

2.3.2 AMT抗性菌株穩(wěn)定表型的篩選

以菌株Cg-A1作為出發(fā)菌株，按照方法1.3.3對其進行AMT濃度耐受性馴化，結(jié)果如圖4所示。在傳代時間恒定條件下，由圖4a可知，隨著培養(yǎng)基中AMT的濃度在2～10 g/L范圍內(nèi)增加，菌株整體生長呈現(xiàn)下降趨勢，并且當(dāng)AMT質(zhì)量濃度為10g/L時，OD600nm值下降至5左右。因此需要在AMT10g/L條件下連續(xù)馴化多代，結(jié)果見圖4b。由圖4b可知，液滴在不含AMT的條件下傳代培養(yǎng)3代，OD600nm值能夠恢復(fù)并且穩(wěn)定在12～14。然后將AMT質(zhì)量濃度固定為10 g/L，在前兩代，液滴生長OD600nm值整體有一個明顯的下降，但之后液滴整體生長呈現(xiàn)穩(wěn)定的趨勢，此時表明菌株能夠穩(wěn)定耐受10 g/L AMT。根據(jù)生長狀況提取馴化OD600nm值最高的6個液滴進行搖瓶發(fā)酵檢測L-組氨酸產(chǎn)量情況，由圖5可知，馴化之后的菌株（編號為Cg-B1～Cg-B6）較馴化之前的菌株Cg-A1，L-組氨酸產(chǎn)量都有明顯的提高，其中菌株Cg-B1的組氨酸產(chǎn)量最高可達（0.23±0.013）g/L，同時該菌株的生長OD600nm值與野生型菌株Cg-14067的OD600nm值相接近。

圖4 組氨酸類似物3-氨基-1,2,4-三氮唑不同含量條件下菌體生長曲線Fig.4 Growth curves of the strain under different concentration of histidine analog 3-amino-1,2,4-triazole

圖5 馴化后菌株搖瓶發(fā)酵OD600nm值和L-組氨酸產(chǎn)量Fig.5 OD600nmvalue and L-histidine yields of strain after domestication by shake-flask fermentation

2.3.3 AMT和D-His雙重抗性突變株的篩選

D-組氨酸（D-His）與組氨酸結(jié)構(gòu)相似度極高，已被用作組氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株的表型篩選[20]。為了篩選到組氨酸產(chǎn)量進一步提高的菌株，以菌株Cg-B1作為出發(fā)菌，采用ARTP迭代誘變的處理方式（即：將每一輪篩選得到組氨酸產(chǎn)量最高的菌株作為下一輪誘變的起始菌株），并且于兩種組氨酸類似物AMT和D-His在平板上AMT質(zhì)量濃度固定為10 g/L、D-His的質(zhì)量濃度依次從2 g/L遞增至8 g/L。從雙重抗性平板上的挑取單菌落，通過48孔板發(fā)酵72 h后檢測發(fā)酵上清液中L-組氨酸含量，各輪檢測結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，最終從耐受組氨酸結(jié)構(gòu)類似物AMT 10 g/L和D-His 8 g/L表型中篩選到L-組氨酸產(chǎn)量最高的菌株Cg-F4，該菌株積累L-組氨酸產(chǎn)量可達（0.561±0.016）g/L。

圖6 組氨酸結(jié)構(gòu)類似物3-氨基-1,2,4-三氮唑和D-His抗性突變株初篩選結(jié)果Fig.6 Screening results of histidine analogs 3-amino-1,2,4-triazole and D-His resistant mutants

2.4 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性

按照方法1.3.6，對突變株Cg-F4 的生長和組氨酸生產(chǎn)的遺傳穩(wěn)定性進行考察，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，菌株Cg-F4傳代7次之后，分別發(fā)酵72 h后L-組氨酸可穩(wěn)定在0.55 g/L左右，OD600nm值都在9左右，表明突變菌株Cg-F4菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

圖7 突變菌株Cg-F4的遺傳穩(wěn)定性分析結(jié)果Fig.7 Analysis results of genetic stability for mutant Cg-F4

2.5 討論

L-組氨酸的生物合成受其自身的反饋抑制和反饋阻遏，消除這種反饋調(diào)節(jié)是開發(fā)組氨酸產(chǎn)生菌株的重要一步[21]。選育組氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株解除L-組氨酸自身的反饋調(diào)節(jié)，使菌株積累L-組氨酸[22]。本研究通過ARTP誘變技術(shù)與MMC技術(shù)相結(jié)合可以高效選育穩(wěn)定表型的組氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株，同時利用L-組氨酸與Pauly試劑反應(yīng)生成顏色化合物這種特性，實現(xiàn)了L-組氨酸的快速測定，提高了L-組氨酸產(chǎn)生菌的篩選效率。目前使用了兩種組氨酸結(jié)構(gòu)類似物作為篩選壓力，篩選到L-組氨酸產(chǎn)生菌Cg-F4，為了進一步提高菌株產(chǎn)L-組氨酸的能力，可以在下兩個方面進行研究：進一步提高目前組氨酸結(jié)構(gòu)類似物的濃度或者引入其他種類組氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性標記，更進一步解除了組氨酸自身的反饋調(diào)節(jié)，使產(chǎn)量不斷提升。發(fā)酵條件及工藝控制的優(yōu)化對進一步提高L-組氨酸的積累至關(guān)重要，因此，在選育高產(chǎn)菌種后，還應(yīng)進行發(fā)酵條件及工藝控制的優(yōu)化，包括發(fā)酵培養(yǎng)基的組成、pH值、溫度、溶氧量等。

3 結(jié)論

本研究首次將ARTP誘變技術(shù)與MMC技術(shù)相結(jié)合定向選育組氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株。通過孔板發(fā)酵初篩以及搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，最終從耐受兩種組氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株中篩選獲得菌株Cg-F4 其L-組氨酸產(chǎn)量可達（0.561±0.016）g/L。菌株Cg-F4經(jīng)過7次連續(xù)傳代實驗，證明該突變菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。