劉景輝，孫倩，王帥，孫冬梅

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

氟磺胺草醚主要用于花生、大豆的芽前芽后使用，高效、低毒、選擇性強[1]，大豆田常用的25%氟磺胺草醚水劑是一種莖葉處理的除草劑，其較長的半衰期使氟磺胺草醚在連作的土壤中不斷積累，甚至影響到后茬作物的正常生長，產(chǎn)生藥害[2-4]。此外，該類除草劑長期的使用會造成嚴重的土壤殘留，對土壤與環(huán)境造成危害，由于其分布于土壤和自然水體[5-6]，不利于用化學(xué)方法解除其危害，而微生物降解可能成為一種比較好的解決方案，化學(xué)方法不利于解除氟磺胺草醚的藥害，微生物降解成為一種比較好的解決方案[7-8]。梁波等[9]從長期受氟磺胺草醚污染的土壤中分離到Lysiniacillus sp.ZB-1 菌株，高效液相法證實其對氟磺胺草醚7 d 降解率為81.32%。吳秋彩等[10]從氟磺胺草醚污染土壤中分離出一株Klebsiella.sp降解菌F-12 菌株，2 d 降解率達80%以上。楊峰山等[11]從土壤中得到一株P(guān)seudomonas mendocina FB8 菌株，對氟磺胺草醚的5 d 降解率為86.75%。李陽等[12]也分離出一株能降解氟磺胺草醚的黑曲霉菌。說明利用微生物降解氟磺胺草醚是完全可行的，而且降解效率是非常高。然而，不同菌株存在多種生理特性，所以氟磺胺草醚生物降解的產(chǎn)物是多樣的[13-14]，如果想達到無害化處理，還需進一步進行生物測定，對氟磺胺草醚敏感的作物及雜草均可作為降解能力檢測的植物，高世杰等[15]利用玉米、向日葵、高粱作為指示植物，對氟磺胺草醚的生測方法進行了研究，白杰[16]也對在氟磺胺草醚危害的土壤的玉米生理指標進行了研究，證明了氟磺胺草醚生物測定的可行性，利用生物檢測法不僅可以檢測出氟磺胺草醚降解菌的降解力，還可以對其降解產(chǎn)物的部分特性及菌體對指標生物的影響一并表現(xiàn)出來，結(jié)合高效液相法色譜分析，可準確測出微生物的氟磺胺草醚的降解率，以便有針對性地對氟磺胺草醚污染的土壤和水體進行環(huán)境修復(fù)。試驗以玉米為研究檢測植株，確定其生物測定方法，并對分離到的氟磺胺草醚降解菌進行生物方法驗證及液相檢測復(fù)合驗證，以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供有益微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試作物種籽、農(nóng)藥

玉米品種：必祥101（北京化農(nóng)偉業(yè)種子科技有限公司），25%氟磺胺草醚水劑（青島瀚生生物科技股份有限公司）。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)無機鹽液體培養(yǎng)基 （g·L-1）：NaCl 1.0，K2HPO41.5，KH2PO40.5，（NH4）2SO41.0，MgSO40.2，CoCl2·6H2O 0.1，MnCl2·4H2O 0.425，ZnCl20.05，NiCl2·6H2O 0.01，CuSO4·5H2O 0.015，Na2MoO4·2H2O 0.01，Na2SeO4·2H2O 0.01，pH 7.0～7.5[11]。

PDA 培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.1.3 供試土樣

分別采自長期使用氟磺胺草醚的黑龍江省牡丹江市軍馬場大豆田（土樣1）和黑龍江墾區(qū)856 農(nóng)場的大豆田（土樣2），耕層5～20 cm 深的土壤，快速放入無菌牛皮紙袋[11]，陰涼保管。

1.2 實驗方法

1.2.1 氟磺胺草醚10 d 齡玉米苗生物檢測方法的建立

將砂子過5 mm 篩，烘干，分別配成濃度為A-0、B-0.05、C-0.10、D-0.15、E-0.20、F-0.25、G-0.30 mg·kg-1分裝于發(fā)芽盒中，每一濃度梯度3 次重復(fù)，選取催芽后發(fā)芽勢整齊一致的玉米種子芽朝上栽種于裝有藥土濃度梯度的發(fā)芽盒內(nèi)，每盒8 株，并給予一致的光照和適宜的水份管理，10 d 后，取地上部分稱重，以藥土濃度為自變量，10 d 齡玉米苗鮮重為因變量建立線性關(guān)系[9-10]。

1.2.2 降解菌的馴化培養(yǎng)與分離

取五支250 mL 錐形瓶，分別裝入適量液體無機鹽培養(yǎng)基，第一支加入玻璃珠與氟磺胺草醚水劑，配制成100 mg·L-1的氟磺胺草醚溶液，其余四支錐形瓶不加玻璃珠，以100 mg·L-1氟磺胺草醚濃度遞增梯度配成液體無機鹽培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌，取土樣以10%土樣量接種量放入滅菌的裝有玻璃珠的無機鹽液體培養(yǎng)中，置 30 ℃，150 r·min-1，7 d，以 10%的接種量轉(zhuǎn)接到200 mg·L-1氟磺胺草醚濃度液體無機鹽培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，按濃度遞增的順序依次轉(zhuǎn)接，最后采用傾注分離，利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離細菌，利用PDA 培養(yǎng)基分離真菌[11-12]。

1.2.3 降解菌降解能力的生物檢測與高效液相檢測

將25%氟磺胺草醚水劑用液體無機鹽培養(yǎng)基稀釋成含量為500 mg·L-1的稀溶液，分裝，滅菌，分別接入馴化分離出的氟磺胺草醚降解菌株，接種量為10%，以不接菌為對照，置 30 ℃，150 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)，5 d 后將對照與降解液處理均拌入砂土中，使對照沙土氟磺胺草醚的濃度為0.30 mg·kg-1，依此稀釋倍數(shù)將接菌的降解液與砂土充分混勻，配成藥土。將玉米種子催芽，選發(fā)芽勢一致的種子芽朝上栽種于裝有 0.30 mg·kg-1的藥土基質(zhì)上，3 次重復(fù)，給予一致的光照和適宜的水分條件，10 d 后生測地上部分鮮重。

取500 mg·L-1的氟磺胺草醚溶液各150 mL 分裝于6 支250 mL 錐形瓶中，封口膜封口，滅菌，其中3 支接入對數(shù)期FCX2 菌體，接種量10%，另3 支設(shè)為對照，置 30 ℃，150 r·min-1，搖床振蕩培養(yǎng) 5 d 后利用高效液相色譜法檢測。

高效液相色譜法檢測條件：儀器型號SPD-20A，柱溫（℃）室溫，柱型號C18，梯度方式高壓梯度，檢測器紫外，波長（nm）245，積分方法面積歸一法，譜圖文件浙大智達N2000[19-20]。

1.2.4 FCX2 菌株對玉米種子萌發(fā)的影響

將 FCX2 菌株發(fā)酵液與清水按 0∶1，1∶50，1∶40，1∶30，1∶20，1∶10，1∶0 配制成 7 個處理的溶液[22]，分別以培養(yǎng)基和與發(fā)酵液pH 相同的NaOH 溶液作為空白對照[23]，共 21 個處理，3 次重復(fù)，每次重復(fù)精選 100 粒玉米種子，用各處理液同時浸種8 h，然后，將浸種后的玉米種子整齊擺入裝有雙層濕潤濾紙的發(fā)芽盒中[15-16]，封蓋保溫保濕，28 ℃，48 h 后計算玉米種子萌發(fā)率，3 次重復(fù)[15-16]。

1.2.5 FCX2 菌株生長特性初探

不同溫度下的生長情況：按10%的接種量接入對數(shù)期FCX2 菌株培養(yǎng)液于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基內(nèi)，分別放入 20、25、30、35 ℃和 40 ℃，150 r·min-1條件下培養(yǎng)，利用紫外分光光度計每隔4 h 測定OD值，波長 600 nm，3 次重復(fù)[7-8]。

不同pH 下的FCX2 生長情況：用硫酸或氫氧化鈉將牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基pH 分別調(diào)成5、6、7、8 和9，分別按10%接種量接入對數(shù)期FCX2 菌株培養(yǎng)液，150 r·min-1條件下培養(yǎng)，并每隔4 h 測定OD值，3 次重復(fù)[9]。

不同N 源下的FCX2 的生長情況：基礎(chǔ)無機鹽液體培養(yǎng)基中分別加等量的牛肉膏、酵母膏和蛋白胨，pH 值 8，30 ℃，150 r·min-1條件下培養(yǎng)，并每隔 4 h測定 OD 值[17-21]，3 次重復(fù)。

不同C 源下的FCX2 的生長情況：基礎(chǔ)無機鹽液體培養(yǎng)基中分別加等量的蔗糖、牛肉膏、可溶性淀粉和葡萄糖，pH 值 8，30 ℃，150 r·min-1條件下培養(yǎng)，并每隔 4 h 測定 OD 值，3 次重復(fù)[11，13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟磺胺草醚殘留量的玉米生苗期測方法

受藥土濃度的影響，10 d 苗齡玉米苗藥害顯著，隨著藥土濃度的增加，玉米枯斑顯著增加，玉米苗低矮、瘦弱、萎蔫和黃化（圖1），地上部鮮重顯著下降，甚至在0.30 mg·kg-1的藥土濃度上，玉米苗已經(jīng)接近枯死，這也說明了玉米苗對土壤中氟磺胺草醚是敏感的，可以在一定程度上用來指示土壤中氟磺胺草醚的殘留量。

圖1 不同氟磺胺草醚濃度條件下玉米苗生長情況Fig.1 Growth of maize seedlings under different concentration of fomesafen

對不同濃度氟磺胺草醚的玉米苗鮮重進行測定發(fā)現(xiàn)：隨著藥土濃度增加，10 d 齡玉米鮮重下降顯著，且不同濃度氟磺胺草醚的玉米苗鮮重變化相對規(guī)律明顯，一定程度上可適用于對氟磺胺草醚的殘留檢測，故以藥土濃度為自變量，10 d 玉米苗地上部分鮮重為因變量，用SPSS 軟件進行線性回歸分析，得到一元線性回歸方程：Y=-7.096 x+3.281，R2=0.882，P=0.002≤0.01，自變量變異水平達到顯著，表明該方法能夠很好的預(yù)測氟磺胺草醚殘留量對玉米10 d 苗齡地上部分的影響，從而可以用來指示土壤中氟磺胺草醚的殘留量（圖2）。

圖2 不同氟磺胺草醚濃度條件下玉米苗地上部位鮮重Fig.2 Fresh weight of aboveground part of maize seedling under different concentration of fomesafen

2.2 降解菌株的獲得

傾注法從土樣1 中分離得到一株呈黃色、濕潤、小而突起、與培養(yǎng)基結(jié)合不緊密菌落的菌株FCX2，進一步劃線分離成純菌落（圖3）。

圖3 氟磺胺草醚降解菌的劃線分離Fig.3 Isolation of fomesafen-degrading bacteria on plate medium

2.3 降解菌株降解能力的生物測定與高效液相檢測

由于菌株對氟磺胺草醚是降解利用還是耐受并不能確定，通過對比氟磺胺草醚濃度為0.30 mg·kg-1的藥土濃度上生長的玉米苗試驗發(fā)現(xiàn)，與對照相比，利用FCX2 菌株降解過的氟磺胺草醚藥液處理的長勢要好很多，枯斑數(shù)量明顯下降，說明FCX2 菌株有利于改善玉米苗的藥害狀況（圖4）。經(jīng)玉米苗鮮重均值比較試驗，利用FCX2 菌株降解的藥液種植的玉米苗鮮重（均值1.687 6 g）比對照（1.509 1 g）增加11.36%，達顯著水平，在一定程度上改善了玉米苗的藥害狀況。

圖4 10 d 齡玉米苗地上部分生長情況Fig.4 Growth of aboveground part of 10-day-old maize seedling

色譜圖上顯示出氟磺胺草醚主峰時間軸上的峰值變化明顯（圖5），表明發(fā)酵液組分上了有明顯變化，依據(jù)面積歸一法，檢測結(jié)果顯示，與對照相比FCX2 降解5 d 后，氟磺胺草醚濃度降低了44.86%，說明了FCX2 菌株有較強的降解能力，雖然并不確定降解產(chǎn)物的種類和特性，但結(jié)合生物檢測結(jié)果，證實了其在改善氟磺胺草醚殘留方面的應(yīng)用價值。

圖5 FCX2 菌株處理5 d 后的氟磺胺草醚色譜圖Fig.5 HPLC analysis of fomesafen after 5 days of FCX2 treatment

2.4 FCX2 菌株對玉米種子萌發(fā)的影響

從玉米種子萌發(fā)試驗的結(jié)果可以看出（圖6），玉米種子發(fā)芽率在發(fā)酵液與水配成的 1∶50、1∶40 和1∶30 處理上，比培養(yǎng)基對照分別高出2.84%、5.78%和3.95%，均達到顯著水平，比pH 水溶液分別高出3.66%、5.02%和3.33%，均達到顯著水平，說明FCX2菌株發(fā)酵液在 1∶50、1∶40 和 1∶30 處理上有明顯的促生能力。而隨著各處理混合液中FCX2 菌株發(fā)酵液含量的增加，則玉米種子發(fā)芽率開始緩慢下降，當達到1∶0 的處理后，玉米種子發(fā)芽率已降至最低，僅為41.67%，比培養(yǎng)基對照降低了50.20%，達極顯著水平，而對比于pH 水溶液對照則差異不顯著，說明pH在發(fā)芽率降低規(guī)律中起了主導(dǎo)作用。

圖6 不同處理對玉米種子萌發(fā)率的影響Fig.6 Effect of different treatments on corn seed germination rate

2.5 FCX2 的生長特性初探

不同初始的pH 條件下，F(xiàn)CX2 菌株生長趨勢相同，即菌液均在8 h 后達到最大OD 值，但不同條件下的最大OD 值并不相同，其中該菌最適的pH 為8。圖7 的結(jié)果同樣說明FCX2 菌株在供試pH6-9 范圍內(nèi)該菌均可達到最大產(chǎn)量，而在pH5 的初始狀態(tài)下，F(xiàn)CX2菌株培養(yǎng)液OD 幾乎不變，菌體生長接近停止，說明菌體無論是在產(chǎn)量還是在生長速率上均較低，可能是因為初始的酸性環(huán)境對菌體生長產(chǎn)生了抑制作用。

圖7 不同pH 值條件下FCX2 菌株的生長情況Fig.7 Growth of FCX2 strain under different pH conditions

不同溫度下的培養(yǎng)表明：30 ℃的條件下，F(xiàn)CX2菌株無論在菌體生長速率還是在菌體最大產(chǎn)量上均較高，表明FCX2 菌株的最適溫度為30 ℃；而在20 ℃和25 ℃條件下，F(xiàn)CX2 菌株菌體生長速率均很慢，且達到平穩(wěn)期的時間較晚，說明溫度越低FCX2生長速度越慢；當培養(yǎng)溫度為35 ℃和40 ℃時，雖然菌液很快達到穩(wěn)定期，但明顯可以看出，達到穩(wěn)定期時菌液的濃度是很低的，當培養(yǎng)溫度達40 ℃時菌液濃度較其它溫度都要低，也說明高溫對此菌有一定的抑制作用（圖8）。

圖8 不同溫度條件下FCX2 菌株的生長情況Fig.8 growth of FCX2 strain at different temperatures

不同N 源的培養(yǎng)結(jié)果表明：牛肉膏、酵母膏和蛋白胨均可作為FCX2 菌株的氮源，且蛋白胨為氮源時FCX2 菌株的生長速率最快，且到穩(wěn)定期時OD 可達到1.463 7；酵母膏為氮源時，菌液達穩(wěn)定期時OD 值為1.456 1，但差別并不顯著；牛肉膏為氮源時，菌液達穩(wěn)定期時OD 值為1.384 2，且較上述兩者差異顯著，而從該生長曲線同樣可看出，該菌的生長速率也較慢（圖 9）。

圖9 不同氮源條件下FCX2 菌株的生長情況Fig.9 Growth of FCX2 strain under different nitrogen sources

碳源培養(yǎng)試驗結(jié)果表明：以葡萄糖為碳源時，F(xiàn)CX2 菌株生長速率較快，而牛肉膏為碳源時，雖然生長速率略低于葡萄糖，但FCX2 菌株在穩(wěn)定期OD值卻可以達到最大的1.493 1，但以淀粉為碳源時，無論生長速率還是穩(wěn)定期OD 值均要比前三者三種碳源低，綜合考慮認為葡萄糖為最適碳源，淀粉最不適于作為FCX2 的碳源（圖10）。

圖10 不同碳源條件下FCX2 菌株的生長情況Fig.10 Growth of FCX2 strain under different carbon sources

3 討論

玉米作為氟磺胺草醚敏感作物，可用來檢測氟磺胺草醚的降解能力，試驗表明：10 d 苗齡玉米苗的長勢隨氟磺胺草醚殘留量的增加而下降，當殘留量達到0.30 mg·kg-1時，玉米苗基本枯死，與高世杰等[15]、白杰等[16]在氟磺胺草醚的對玉米毒害作用研究相比，雖然方法有所不同，但具有相同的變化規(guī)律，可作為氟磺胺草醚降解能力的生物檢測手段，在檢測氟磺胺草醚的降解能力的同時，也檢測出FCX2 菌株及其代謝物是對玉米生長特性的綜合影響，通過生物檢測試驗，加有FCX2 菌株的處理上玉米苗的鮮重比未加菌的高出了11.36%，證明FCX2 菌株及其代謝物對玉米苗的藥害有顯著的改善作用，使玉米苗長勢得到顯著恢復(fù)，這與以往僅僅通過高效液相色譜分析檢測而獲得氟磺胺草醚降解菌，單一追求降解率不同[8-14]，利用生物檢測法篩選氟磺胺草醚降解菌，充分考慮了其菌株在生長代謝過程中可能產(chǎn)生的大量未知的代謝成分和菌體本身對檢測生物的整體效應(yīng)，使所獲降解菌株更具應(yīng)用前景。盡管生物檢測法有著諸多優(yōu)點，但生物檢測手段的干擾因素較多，比如FCX2 菌株本身或其代謝成分對玉米苗生長的影響，并不能準確的反映出FCX2 降解率，需要利用高效液相色譜檢測，測得5 d 降解率達44.86%，與大多數(shù)的已獲得的氟磺胺草醚降解菌相比[8-14]，這樣的結(jié)果并不是很高，但其發(fā)酵液對玉米苗藥害的改善明顯，可用作為氟磺胺草醚降解菌。通過FCX2 菌株發(fā)酵液對玉米種子萌發(fā)試驗，發(fā)現(xiàn)其促生能力顯著，亦可作為玉米促生菌來使用，但其發(fā)酵液pH 為9.7，會導(dǎo)致玉米發(fā)芽率顯著下降，應(yīng)用時要注意控制使用比例或調(diào)節(jié)pH，這一點與胡凱鳳等[23]的研究規(guī)律也基本保持了一致性。研究FCX2 菌株生長特性發(fā)現(xiàn)，其最適生長溫度為30 ℃，但無論在20 ℃，還是40 ℃都能很好的生長，表明對溫度的適應(yīng)能力較強；其最適pH 為8，在pH5 的環(huán)境幾乎停止生長，但在pH6～pH9 的環(huán)境是可以正常生長的，這說明FCX2 菌株適于一些中性或偏堿的土壤；生長營養(yǎng)特性的試驗表明，最適碳源為葡萄糖，這與葡萄糖為單糖便于利用也相符[17]，而最適氮源為蛋白胨，是比較適合作為FCX2 菌株氮的來源，為了更有效的發(fā)揮其降解功能，還需進一步的研究FCX2 菌株應(yīng)用的條件優(yōu)化、預(yù)防菌體產(chǎn)堿作用對作物的影響，以便最大程度發(fā)揮其能力。