陳肖宏，聞曉波，冉旭華

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

輪狀病毒（Rotavirus，RV）是一種引起嬰幼兒及多種幼齡動(dòng)物腸道感染的病原，致死率高，給人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展造成巨大危害[1]。RV 屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬成員，電鏡觀察下為一個(gè)無(wú)包膜的二十面體“車輪狀”顆粒，基因組由11 個(gè)分節(jié)段的雙鏈RNA（dsRNA）組成，共編碼6 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～VP4，VP6 和 VP7）、5 或 6 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP1～NSP5 和/或 NSP6）[2]。具有感染性的完整 RV粒子為三層衣殼結(jié)構(gòu)（triple-layered particle，TLP），最內(nèi)層衣殼由VP2 蛋白及少量VP1 和VP3 構(gòu)成，中間層由VP6 構(gòu)成，最內(nèi)層和中間層構(gòu)成具有轉(zhuǎn)錄活性的雙層衣殼結(jié)構(gòu)（double-layered particle，DLP），DLP 外包裹纖突蛋白VP4 和糖蛋白VP7 構(gòu)成了完整的具有感染性的RV 粒子。依據(jù)血清學(xué)分類方法，目前所鑒定出的RV 毒株可分為RVA～RVJ 至少10個(gè)群[3]，其中A 群是引起嬰幼兒和幼齡動(dòng)物發(fā)生嚴(yán)重腹瀉和脫水的主要病原。血清型由外衣殼蛋白VP7和 VP4 決定，RV 根據(jù)其 VP7 和 VP4 的抗原性分為G 血清型（glycoprotein）和 P 血清型（protease-sensitive）[4]。迄今為止，已鑒定出 32 種 G 型和 47 種 P 型可感染人類和動(dòng)物[5]。

RV 經(jīng)胞吞作用入侵細(xì)胞，在感染期間，病毒基因組復(fù)制和初生DLP 組裝均發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的病毒質(zhì)樣結(jié)構(gòu)（viroplasm-like structure，VLS）中。有研究表明，在缺乏所有其他病毒蛋白的細(xì)胞中，NSP2 與NSP5 的共表達(dá)可形成 VLS[6]，但 NSP2 或 NSP5 的單獨(dú)表達(dá)都不足以形成VLS，因此，NSP2 和NSP5 被認(rèn)為是VLS 形成的最小組合。NSP2 蛋白在VLS 形成中起關(guān)鍵作用，在RV 感染的細(xì)胞中，使用RNAi 干擾技術(shù)或胞內(nèi)抗體沉默NSP2 或NSP5 的表達(dá)可抑制VLS 形成[7-9]?，F(xiàn)已證明NSP2 和NSP5 的相互作用對(duì)VLS 成核和病毒復(fù)制都是至關(guān)重要的[10]，但關(guān)于這兩種蛋白如何啟動(dòng)病毒質(zhì)組裝以及NSP2 在病毒質(zhì)形成中的具體作用，目前尚不清楚。NSP2 蛋白由RV 基因組中第 8 基因片段編碼，A 群 NSP2 蛋白全長(zhǎng)1 059 bp，共編碼317 個(gè)氨基酸，是一個(gè)相對(duì)分子量約為35 kDa 的堿性蛋白。從RV 感染細(xì)胞中分離出的具有復(fù)制活性的復(fù)制中間體，在非許可溫度下利用 SA11 tsE（1400）突變體沉默 NSP2，雙鏈 RNA 合成幾乎完全缺失[11]。X 射線晶體分析表明，NSP2 蛋白常以八聚體形式存在，其總體結(jié)構(gòu)是高度保守的[12]。NSP2 蛋白具有多種酶活性，在基因組復(fù)制過(guò)程中起關(guān)鍵作用。NSP2 蛋白可與單鏈RNA（ssRNA）非特異性結(jié)合且具有ATP 解螺旋活性[13]，NSP2 蛋白還具有Mg2+依賴的核苷三磷酸酶（NTPase）活性和核苷二磷酸（NDP）激酶活性[14]。除了它的酶功能外，NSP2 還可與多種蛋白相互作用，例如NSP5、VP1 和微管蛋白[15]。

NSP2 蛋白在輪狀病毒RNA 的復(fù)制、基因組的包裝及雙層衣殼結(jié)構(gòu)裝配的初始階段發(fā)揮重要作用[16]，近年來(lái)，對(duì)于NSP2 蛋白的研究主要集中于蛋白表達(dá)、結(jié)構(gòu)與功能及其免疫學(xué)等方面的研究[17]，但其在VLS 形成中的具體作用及其關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域?qū)Σ《举|(zhì)形成的影響目前尚不清楚。利用Kanai 等[18]開(kāi)發(fā)的14質(zhì)粒的RV 反向遺傳操作系統(tǒng)，通過(guò)替換或缺失NSP2 蛋白關(guān)鍵位點(diǎn)或關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，來(lái)研究其對(duì)病毒質(zhì)形成的影響，抑制RV 復(fù)制，可為RV 致弱提供突變位點(diǎn)，為弱毒疫苗研發(fā)提供新方法。研究通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)NSP2 蛋白，經(jīng)免疫豚鼠制備NSP2 多克隆抗體，為進(jìn)一步研究NSP2 蛋白結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

E.coli BL21（DE3）、E.coli DH5α 和 pET-28a（+）載體均由實(shí)驗(yàn)室保存。pT7-NSP2 質(zhì)粒購(gòu)自Addgene公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

兩只8 周齡清潔級(jí)體重約200 g 的雌性豚鼠購(gòu)于哈爾濱動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地，飼養(yǎng)于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物房。

1.1.3 主要試劑

質(zhì)粒小提、膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA 公司；限制性內(nèi)切酶BamH I、HindIII、連接試劑盒購(gòu)自Takara公司；Go Taq Green?Master Mix、預(yù)染彩虹蛋白Marker 購(gòu)自Promega 公司；小鼠抗His Taq 抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 購(gòu)自北京博奧森有限公司；DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自天根生物科技有限公司；3，3-二氨基苯胺四氫鹽酸（DAB）底物顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Micro BCATMProtein Assay Kit 購(gòu)自 Thermo 公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗豚鼠IgG 購(gòu)自KPL 公司；TMB 顯色液購(gòu)自北京Solarbio 公司。

1.2 方法

1.2.1 pET-28a-NSP2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

參照NCBI GenBank 收錄的輪狀病毒SA11 株NSP2（GenBank 登錄號(hào)：LC178571.1）基因組序列及pET-28a（+）載體圖譜，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增SA11 株NSP2 編碼區(qū)全序列，分別在上下游5′端添加BamH I和Hind III 酶切位點(diǎn)（下劃線表示）。引物序列如下：SA11-NSP2-F：5′-CGCGGATCCATGGCTGAGCTAGCTTGCTTTTG-3′；SA11-NSP2-R：5′-CCCAAGCTTAAACGCCAACTTGAGAAACTTCGTC-3′，擴(kuò)增片段大小為954 bp，引物委托北京華大基因公司合成。

以pT7-NSP2 質(zhì)粒為模板，利用SA11-NSP2-F和SA11-NSP2-R 進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，共 35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸 10 min；對(duì) PCR 產(chǎn)物電泳后進(jìn)行切膠回收。將回收的目的基因和原核表達(dá)載體 pET-28a（+）分別用 BamH I 和 Hind III 進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳切膠回收后以T4 DNA Ligase 進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性單克隆，搖菌提質(zhì)粒后經(jīng)PCR、雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒送至北京華大科技有限公司測(cè)序，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-28a-NSP2。

1.2.2 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)

將 pET-28a-NSP2 轉(zhuǎn)化至 E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性單克隆接種至3 mL 含終濃度為 50 μg·mL-1卡那抗性的 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)，待菌液渾濁后以1∶100 的比例將菌液轉(zhuǎn)接至終濃度為50 μg·mL-1卡那抗性LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 rpm 培養(yǎng)至 OD600≈0.6。取出1 mL 菌液作為未添加誘導(dǎo)劑的對(duì)照，剩余部分加入終濃度為1 mM 的IPTG 誘導(dǎo)劑。將添加和未添加誘導(dǎo)劑的菌液，37 ℃，200 rpm 繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取誘導(dǎo)培養(yǎng)物1 mL 離心棄上清，用PBS 洗滌菌體3 次后重懸于500 μL 的PBS 中，置于冰水浴中，超聲破碎至液體清亮；4 ℃，12 000×g 離心 20 min，分別收集上清液和沉淀。加入5×Loading buffer，煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE 分析檢驗(yàn)。同時(shí)，將未加入誘導(dǎo)劑的空載體pET-28a（+）轉(zhuǎn)化后的表達(dá)產(chǎn)物作為對(duì)照。

1.2.3 重組蛋白的Western blot 鑒定

取適量誘導(dǎo)樣品及未誘導(dǎo)的空載體對(duì)照組樣品經(jīng)SDS-PAGE 分離后，從膠板上取下膠，切除多余部分，泡入轉(zhuǎn)膜液中。同時(shí)剪下大小適中的一張PVDF膜和2 張厚濾紙，將PVDF 膜泡入預(yù)冷的甲醇中1 min 后與厚濾紙一同泡入轉(zhuǎn)膜液中。按照濾紙、PVDF 膜、膠和濾紙的順序依次放置于電轉(zhuǎn)槽中央。半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜置于PBST 中漂洗3 次，然后浸潤(rùn)于5%脫脂乳中，4 ℃封閉過(guò)夜，洗膜后與1∶10 000 倍稀釋的小鼠抗His Tag 抗體于37 ℃孵育1 h，再次洗膜后與1∶5 000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 抗體室溫孵育2 h，再次洗膜，將配置好的DAB 顯色液混合均勻后滴加在膜上，等待幾分鐘后，目的條帶呈黃褐色，棄掉顯色液，用去離子水終止反應(yīng)。

1.2.4 重組蛋白的純化及定量

誘導(dǎo)條件同上，離心收集誘導(dǎo)后菌體，重懸于PBS 中，置于冰水浴中超聲破碎至菌液清亮，離心后收集沉淀，用4M 尿素重懸沉淀，冰浴20 min，離心后收集上清，4M 尿素重復(fù)洗脫蛋白3 次。將收集到的蛋白樣品裝入透析袋中過(guò)夜透析，以去除蛋白樣品中的尿素，使蛋白復(fù)性。將復(fù)性后的蛋白稀釋后用BCA 試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線確定蛋白的濃度。

1.2.5 抗體制備

用PBS 將復(fù)性后的蛋白樣品稀釋至400 μg·mL-1，分別取2 mL 稀釋后的蛋白和2 mL ISA206 佐劑，將蛋白樣品和佐劑放置于31 ℃水浴鍋中溫浴10 min。將裝有佐劑的小瓶放置于磁力攪拌器上以適當(dāng)轉(zhuǎn)速攪拌，攪拌的同時(shí)快速加入蛋白樣品，繼續(xù)攪拌乳化10 min，乳化液保存于 4 ℃。取 1 mL 含有 200 μg 重組蛋白的乳化液注射于豚鼠后肢肌肉，2 周后以同樣劑量加強(qiáng)免疫2 次，間隔2 周。在免疫前和免疫后2 周采血，4 ℃放置 2 h，5 000×g 離心 5 min 收集血清，通過(guò)間接ELISA 方法測(cè)定抗體效價(jià)，達(dá)到預(yù)期效價(jià)后，通過(guò)心臟采血收集血清，-20 ℃保存。

1.2.6 抗體效價(jià)的檢測(cè)

采用間接ELISA 法，用碳酸鹽緩沖液將重組NSP2 蛋白稀釋至 5 μg·mL-1后包被 96 孔板，100 μL·孔-1，4 ℃包被過(guò)夜。取出包被好的酶標(biāo)板，PBST 洗滌3 次，甩干孔內(nèi)液體，加入5%脫脂乳，300 μL·孔-1，37 ℃封閉 2 h。PBST 洗滌 3 次，將多克隆抗體倍比稀釋后加入孔中，每個(gè)梯度做2 個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照，100 μL·孔-1，37 ℃孵育 1 h。PBST 洗滌 3 次，加入 1∶5 000 倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗豚鼠IgG，100 μL·孔-1，37 ℃孵育1 h。PBST 洗滌3 次，加入TMB 顯色液，50 μL·孔-1，37 ℃避光孵育 15 min。加入 2M H2SO4終止顯色，50 μL·孔-1，在酶標(biāo)儀上讀取 OD450nm的數(shù)值，計(jì)算P/N 的值，P/N≥2.1 即為陽(yáng)性閾值。

2 結(jié)果

2.1 pET-28a-NSP2 重組質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒 pET-28a-NSP2 經(jīng) PCR 和 BamH I 與Hind III 雙酶切后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)954 bp 的目的條帶及約5.3 kb 的載體條帶，見(jiàn)圖1。將鑒定正確的菌液送至北京華大基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的片段序列一致。

2.2 重組蛋白SDS-PAGE 鑒定

將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-28a-NSP2 和空載體 pET-28a（+）轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌感受態(tài) BL-21（DE3）中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，破碎后分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE 驗(yàn)證，可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約為35 kDa 的NSP2 特異性條帶，且以包涵體形式大量表達(dá)，見(jiàn)圖2。

圖1 重組質(zhì)粒PCR、雙酶切鑒定Fig.1 PCR and restriction enzyme analysis of recombinant plasmid pET-28a-NSP2

圖2 重組蛋白pET-28a-NSP2 的SDS-PAGE 分析Fig.2 The Glycine-SDS-PAGE analysis of recombinant protein pET-28a-NSP2

2.3 重組蛋白Western blotting 驗(yàn)證

檢測(cè)結(jié)果表明包涵體形式的重組蛋白能與抗His 標(biāo)簽的單抗發(fā)生特異性反應(yīng)，在相對(duì)分子量約35 kDa 處可見(jiàn)特異性黃褐色條帶，見(jiàn)圖3，進(jìn)一步證明NSP2 重組蛋白可在E.coli BL-21（DE3）感受態(tài)內(nèi)大量表達(dá)。

2.4 純化后重組蛋白的SDS-PAGE 鑒定

純化的重組蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE 分析，純化后的蛋白條帶大小與重組蛋白鑒定結(jié)果一致，可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約35 kDa 的目的條帶，見(jiàn)圖4，并用Micro BCATMProtein Assay Kit 測(cè)定蛋白濃度，重組蛋白濃度約 2.09 mg·mL-1。

圖3 Western blotting 鑒定NSP2 重組蛋白的表達(dá)Fig.3 Western blotting analysis of recombination protein NSP2

圖4 SDS-PAGE 鑒定純化的NSP2 重組蛋白的表達(dá)Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein NSP2

2.5 多克隆抗體效價(jià)

采用間接ELISA 法檢測(cè)表明，豚鼠血清中NSP2蛋白的多克隆抗體效價(jià)大于1∶5 000。

3 討論

在全球范圍內(nèi)，輪狀病毒幾乎感染每一個(gè)5 歲以下兒童，每年造成的死亡人數(shù)超過(guò)20 萬(wàn)[1]，但目前尚未開(kāi)發(fā)出針對(duì)RV 的特異性藥物，接種疫苗是世界公認(rèn)的預(yù)防RV 性腸胃炎暴發(fā)的最有效手段。盡管現(xiàn)有的商品化減毒活疫苗在發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)預(yù)防RV 性腸胃炎非常有效，但仍存在散毒風(fēng)險(xiǎn)及潛在安全性等問(wèn)題，畜牧業(yè)目前尚無(wú)商品化RV 疫苗，也無(wú)特異性治療藥物，臨床上也只是對(duì)癥治療。以豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，PoRV）為例，豬輪狀病毒是導(dǎo)致世界范圍內(nèi)仔豬腹瀉的主要原因之一，該病潛伏期短，傳染性強(qiáng)，多呈地方性流行，主要感染7 日齡仔豬，發(fā)病仔豬以腹瀉、嘔吐和脫水為特征，病死率高達(dá)80%～100%，成年豬多數(shù)呈隱性感染，一般表現(xiàn)為消瘦、食欲不振和發(fā)育停滯等特點(diǎn)，嚴(yán)重?fù)p害養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，阻礙養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[19-20]。目前國(guó)內(nèi)豬輪狀病毒感染率逐年遞增，一旦暴發(fā)，很難凈化，各種疫苗免疫也不能完全預(yù)防感染，因輪狀病毒基因組的特殊性，常發(fā)生重配、重排，大大增加了防控此病和開(kāi)發(fā)疫苗的難度。對(duì)于新生兒、免疫缺陷患者、前往高危地區(qū)旅行的成年人、以及畜牧業(yè)來(lái)說(shuō)開(kāi)發(fā)廣譜抗RV 的藥物和疫苗都是迫切的。RV 初次感染嬰幼兒后，可在其體內(nèi)檢測(cè)到抗NSP2 蛋白的特異性血清IgG 和IgA，其抗體水平可維持100～150 d，當(dāng)再次感染RV 時(shí)，其抗體水平可維持150 d[21]。另外，在初次感染后，在十二指腸液和糞便提取物中均可檢測(cè)到抗NSP2 蛋白的IgA。血清中抗NSP2 的抗體水平可能是RV 感染和再感染的敏感指標(biāo)?？筃SP2 的抗體在再次感染后限制病毒復(fù)制的潛力值得進(jìn)一步研究[21]。有研究表明即使在相距較遠(yuǎn)的RV 血清群之間，NSP2 蛋白總體結(jié)構(gòu)也是高度保守的[22]。2009 年范耀春[23]將 RV A 群 TB-Chen 株 NSP2 蛋白（Gen－Bank：AY787648）克隆至 pETL 載體中，表達(dá)并純化了NSP2 蛋白，免疫豚鼠制備了抗重組NSP2 蛋白的血清抗體，經(jīng)Western Blot 檢測(cè)，結(jié)果表明血清抗體可特異性識(shí)別重組NSP2 自身蛋白，也可交叉識(shí)別SA11 株和Wa 株感染MA104 細(xì)胞中的NSP2 蛋白，在間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證明了這一結(jié)果，表達(dá)的TB-Chen 株NSP2 具有良好的免疫原性?，F(xiàn)有研究已證明重組NSP2 蛋白免疫兔子、豚鼠及小鼠均可獲得抗 NSP2 的高免血清[6，17，24-25]。將 NSP2 蛋白作為開(kāi)發(fā)新型疫苗和藥物的靶蛋白，以期降低RV 感染對(duì)人類和畜牧業(yè)的危害。

重組NSP2 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)可見(jiàn)特異性蛋白條帶以包涵體形式大量表達(dá)，分子大小約35 kDa，NSP2蛋白以單體形式表達(dá)。但上清以及pET-28a（+）空載體中均存在與特異性蛋白條帶大小相似的條帶，經(jīng)Western blotting 對(duì)其進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果表明NSP2 蛋白以包涵體形式大量表達(dá)，其余相似蛋白可能為大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)自身蛋白。重組蛋白大量表達(dá)后收集菌體，超聲破碎收集沉淀，首先采用Ni-NTA 純化系統(tǒng)對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，發(fā)現(xiàn)重組蛋白未能和填料良好的結(jié)合，過(guò)早出現(xiàn)在前期的洗脫液中，可能是蛋白本身標(biāo)簽暴露不充分等因素導(dǎo)致與填料作用力弱，具體原因丞待研究。在后續(xù)試驗(yàn)中將超聲破碎后的沉淀依次用 1、2、4、6、8 M 尿素重懸以洗脫蛋白，冰浴20 min 離心后收集上清，取適量上清 SDS-PAGE 檢測(cè)，結(jié)果表明 1、2 M 和 4 M 尿素溶液中均含有大量重組蛋白，6M 和8M 尿素溶液中重組蛋白量較少，4 M 尿素可較好洗脫蛋白。純化后總蛋白濃度可達(dá)2 mg·mL-1，重組蛋白含量占總蛋白的95%以上，結(jié)果表明未經(jīng)Ni-NTA 純化系統(tǒng)單純用尿素洗脫的方法也可獲得純化效果較好的重組蛋白，利用4 M 尿素溶液純化蛋白不僅降低了試驗(yàn)成本，也減少了試驗(yàn)的復(fù)雜程度。RV 可感染嬰幼兒及許多哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類，其中包括試驗(yàn)常用的家兔和小鼠，感染后的動(dòng)物體內(nèi)可產(chǎn)生抗RV 的抗體，可能對(duì)后續(xù)試驗(yàn)產(chǎn)生影響，豚鼠不感染RV，可作為試驗(yàn)動(dòng)物制備多克隆抗體。因豚鼠對(duì)弗氏佐劑較為敏感[26]，免疫中易造成死亡，故而采用ISA206 佐劑，其乳化方法簡(jiǎn)單易操作且造價(jià)低廉。

研究成功構(gòu)建了pET-28a-NSP2 重組表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸埃希菌BL21（DE3）中高效表達(dá)了全長(zhǎng)NSP2 蛋白，純化后的蛋白免疫豚鼠制備了多克隆抗體。利用抗NSP2 的高免血清通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)可對(duì)RV 感染宿主細(xì)胞后不同時(shí)期NSP2 蛋白的表達(dá)及其分布進(jìn)行檢測(cè)。下一步將制備的抗NSP2 多克隆抗體作為一抗，進(jìn)行間接免疫熒光與激光共聚焦試驗(yàn)，在感染RV 的宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)NSP2 蛋白進(jìn)行定位，進(jìn)一步研究NSP2 蛋白影響病毒質(zhì)形成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域、病毒自身復(fù)制和致病機(jī)制。輪狀病毒侵入宿主細(xì)胞后的復(fù)制機(jī)制尚不明確，研究輪狀病毒侵入宿主細(xì)胞后的復(fù)制機(jī)制可為輪狀病毒新型藥物和疫苗的研發(fā)提供借鑒。