方碧煙 ，甘均龍，史軍杰 ，彭麗華，陳煒璇，成金樂(lè)*

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源科學(xué)與工程研究中心，廣東 廣州 510006；2. 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥破壁飲片技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)研究室，中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東 中山 528437；3. 嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州中醫(yī)藥大學(xué)），廣東 廣州 510006； 4. 國(guó)家中成藥工程技術(shù)研究中心南藥研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006）

紅景天為景天科植物大花紅景天Rhodiola crenulata (Hook. f. et Thoms.) H. Ohba 的干燥根和根莖，可益氣活血、通脈平喘，主治氣虛血瘀、胸痹心痛、中風(fēng)偏癱、倦怠氣喘等癥[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紅景天及其有效成分紅景天苷具有抗疲勞、抗抑郁、增強(qiáng)免疫力、清除活性氧自由基、抗腫瘤、護(hù)肝等作用，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等系統(tǒng)疾病具有一定治療作用[2]。紅景天破壁飲片是將其傳統(tǒng)飲片，經(jīng)現(xiàn)代超微粉碎技術(shù)加工至D90 小于45 μm（300 目以上）的破細(xì)胞壁粉體，經(jīng)不添加成型劑專利技術(shù)制成的30 ～ 100目干燥顆粒狀飲片[3-4]。由于經(jīng)破細(xì)胞壁工藝處理，破壁飲片已失去傳統(tǒng)飲片的外觀性狀和顯微鑒別特征，需引入可反映中藥整體成分信息的HPLC 指紋圖譜技術(shù)作為其質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一[5-7]。

本研究通過(guò)建立紅景天傳統(tǒng)飲片、破壁粉體及破壁飲片的HPLC 指紋圖譜，對(duì)三者間的化學(xué)成分相關(guān)性進(jìn)行分析，以評(píng)價(jià)紅景天破壁飲片制備工藝過(guò)程中的成分傳遞信息以及批間成分一致性情況；進(jìn)一步通過(guò)化學(xué)識(shí)別模式快速區(qū)分物質(zhì)基礎(chǔ)差異大的不同產(chǎn)地紅景天樣品[8-9]，為紅景天破壁飲片的原料、中間體及成品質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695/2988 型高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；明澈TM-D24UV 型純水系統(tǒng)（美國(guó)Milipore 公司）；KQ-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

紅景天苷（批號(hào)：110818-201507，99.4%）、酪醇（批號(hào)：111676-200602，100%）、沒(méi)食子酸（批號(hào)：110831-201605，90.8%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；水為自制超純水；乙腈、甲醇均為色譜純，購(gòu)于安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司；其余試劑為分析純，購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠。

10 批紅景天藥材均從西藏和四川的不同區(qū)域采集，經(jīng)中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司賈世清中藥師鑒定為景天科植物大花紅景天Rhodiola crenulata（Hook. f. et Thoms.）H.Ohba 的干燥根和根莖。紅景天藥材按傳統(tǒng)方法制成紅景天傳統(tǒng)飲片，并以此為原料，按破壁飲片制備工藝規(guī)程分別制備成對(duì)應(yīng)批次的紅景天破壁粉體及破壁飲片（均由中山市中智中藥飲片有限公司制備），樣品信息見(jiàn)表1。

表1 紅景天樣品信息Tab. 1 Sample information of Rhodiolae Crenulatae Radix et Rhizoma

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Shiseido CAP Cell C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0 ～ 25 min，5% ～ 15%A；25 ～ 45 min，15% ～ 23%A；45 ～ 70 min，23% ～ 28%A）；流速：0.6 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm；柱溫：30 ℃；供試品溶液進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取紅景天樣品0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入25 mL 70%甲醇，稱重，浸潤(rùn)30 min，超聲提取45 min，取出，冷卻至室溫，補(bǔ)重，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

取沒(méi)食子酸、紅景天苷及酪醇3 種對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含沒(méi)食子酸1.0 mg、紅景天苷0.5 mg、酪醇0.2 mg 的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 取紅景天破壁飲片，供試品溶液及空白供試品溶液按“2.2”項(xiàng)下的方法制備，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示溶劑對(duì)樣品的HPLC 分析無(wú)影響，表明該方法專屬性良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取1 份紅景天破壁飲片，供試品溶液按“2.2”項(xiàng)下的方法制備，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。各譜圖相似度大于0.99；計(jì)算其它各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD 值（以1 號(hào)沒(méi)食子酸峰為參照峰），結(jié)果均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批紅景天破壁飲片6份，供試品溶液按“2.2”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣分析。各譜圖相似度大于0.99；計(jì)算其它各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD 值，結(jié)果均小于3%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1 份紅景天破壁飲片，供試品溶液按“2.2”項(xiàng)下的方法制備，并于制備后0、2、4、8、12、24 h 時(shí)進(jìn)樣分析。各譜圖相似度大于0.99；計(jì)算其它各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD 值，結(jié)果均小于5%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)較穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

取10 批次不同產(chǎn)地的紅景天傳統(tǒng)飲片及其對(duì)應(yīng)批次的破壁粉體和破壁飲片，按“2.2”項(xiàng)下的供試品制備方法制備相應(yīng)的供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄指紋圖譜。通過(guò)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 A 版）”軟件分別建立紅景天傳統(tǒng)飲片、破壁粉體、破壁飲片的指紋圖譜共有模式，計(jì)算10 批傳統(tǒng)飲片、10 批破壁粉體、10 批破壁飲片各自的相似度。結(jié)果顯示紅景天傳統(tǒng)飲片、破壁粉體及破壁飲片指紋圖譜均標(biāo)定了18 個(gè)共有峰，經(jīng)對(duì)照品指認(rèn)，1號(hào)峰為沒(méi)食子酸，2 號(hào)峰為紅景天苷，4 號(hào)峰為酪醇（見(jiàn)圖1）；10 批傳統(tǒng)飲片中編號(hào)1、2、3 間的相似度達(dá)0.96 以上，而與其它批次傳統(tǒng)飲片的相似度低于0.85；編號(hào)4、5、6、8、9 間的相似度達(dá)0.95 以上，而與其它批次傳統(tǒng)飲片的相似度低于0.90；編號(hào)4、7、10 間的相似度較高，而與其它批次傳統(tǒng)飲片的相似度低于0.85。10 批破壁粉體及10 批破壁飲片也隨著傳統(tǒng)飲片表現(xiàn)出相同規(guī)律。

圖1 混合對(duì)照品峰的指認(rèn)Fig. 1 Peak identification of hybrid reference substance

2.6 紅景天傳統(tǒng)飲片、破壁粉體、破壁飲片相關(guān)性分析

將10 批紅景天傳統(tǒng)飲片、破壁粉體及破壁飲片的指紋圖譜共有模式進(jìn)行相似度分析（見(jiàn)圖2 和表2），且分別將同批次的紅景天三態(tài)（傳統(tǒng)飲片、破壁粉體及破壁飲片）指紋圖譜進(jìn)行比較（見(jiàn)圖3）。結(jié)果均顯示紅景天傳統(tǒng)飲片、破壁粉體、破壁飲片之間的相似度極高（均大于0.99），說(shuō)明紅景天傳統(tǒng)飲片經(jīng)破壁粉碎技術(shù)及無(wú)添加成型技術(shù)制成破壁飲片成品的整個(gè)工藝流程中，成分傳遞好，有效成分整體概貌基本沒(méi)有發(fā)生改變。

圖2 紅景天傳統(tǒng)飲片、破壁粉體、破壁飲片指紋圖譜共有模式比較Fig. 2 Comparison of the mutual mode of HPLC fingerprint of decoction pieces, ultrafine powder and ultrafine granular powder of Rhodiolae Crenulatae Radix et Rhizoma

表2 紅景天傳統(tǒng)飲片、破壁粉體、破壁飲片的相似度Tab. 2 Similarity of decoction pieces, ultrafine powder and ultrafine granular powder of Rhodiolae Crenulatae Radix et Rhizoma

2.7 主成分分析（PCA）和聚類分析（HCA）

以18 個(gè)共有峰的峰面積為變量，分別采用SIMCA 14.1 軟件、SPSS 26.0 軟件對(duì)上述各10 批紅景天傳統(tǒng)飲片、破壁粉體及破壁飲片樣品進(jìn)行PCA、HCA 分析。結(jié)果顯示：三個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為84.16%，從PCA 得分圖可知（見(jiàn)圖4），30 個(gè)紅景天樣品明顯分為3 類，其中樣品編號(hào)為1、2、3 的傳統(tǒng)飲片及其制備的破壁粉體、破壁飲片為一類；編號(hào)為4、7、10 的傳統(tǒng)飲片及其制備的破壁粉體、破壁飲片為一類；編號(hào)為5、6、8、9 的傳統(tǒng)飲片及其制備的破壁粉體、破壁飲片為一類；從HCA 樹(shù)狀圖可知（見(jiàn)圖5），當(dāng)平方歐式距離為5 時(shí)，不同產(chǎn)地紅景天樣品的分類結(jié)果與PCA 結(jié)果一致。

3 討論

本研究分析了不同產(chǎn)地的10 批紅景天傳統(tǒng)飲片及以其為原料所制備的破壁粉體、破壁飲片的HPLC指紋圖譜。以HPLC 指紋圖譜的相似度對(duì)紅景天破壁飲片、破壁粉體及傳統(tǒng)飲片進(jìn)行成分相關(guān)性分析時(shí)，表現(xiàn)出極高的相似度，表明紅景天破壁飲片的整個(gè)制備過(guò)程中，未出現(xiàn)成分種類的新增或消失，整體概貌未變化，具有同質(zhì)性。且所采集的不同產(chǎn)地紅景天藥材，其傳統(tǒng)飲片圖譜相似度差異較大，并將成分差異進(jìn)一步延續(xù)至破壁飲片中間體和成品。其PCA、HCA 分析也非常清晰地將HPLC 指紋圖譜相似度高的樣品歸為一類，而差異大的歸為其它兩類，進(jìn)一步佐證了指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果。結(jié)果提示，產(chǎn)地的生態(tài)環(huán)境對(duì)紅景天藥材生長(zhǎng)過(guò)程中的成分富集影響較大，為保證以其為原料的中藥成品質(zhì)量穩(wěn)定、一致，應(yīng)對(duì)紅景天藥材的產(chǎn)地及加工方法進(jìn)行控制和要求。HPLC 指紋圖譜技術(shù)雖然克服了單一成分信息量不全的缺點(diǎn)，能較全面、整體反映成分概貌，但具有一定的模糊性，不能清晰反映成分的含量變化情況。為反映破壁飲片與其傳統(tǒng)飲片的“同量性”，后續(xù)還將進(jìn)一步通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)篩選飲片中的質(zhì)量標(biāo)志性成分，并對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，分析破壁飲片與其傳統(tǒng)飲片的含量相關(guān)性情況，更全面地表征由傳統(tǒng)飲片加工成破壁飲片的成分傳遞信息。

圖4 PCA 得分圖Fig. 4 Score plot of PCA

圖5 HCA 圖Fig. 5 HCA dendrogram

4 結(jié)論

本研究所建立的HPLC 指紋圖譜分析方法穩(wěn)定、可靠，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)，可用于評(píng)價(jià)紅景天傳統(tǒng)飲片、破壁粉體及破壁飲片的批次間成分一致性、穩(wěn)定性，進(jìn)而延伸應(yīng)用至原料的質(zhì)量控制、破壁飲片加工過(guò)程的工藝穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，為破壁飲片產(chǎn)品的質(zhì)量控制和質(zhì)量追溯提供參考。