藺 歡，王俊娟,2，孫振婷,2，朱偉東，葉武威，2，陰祖軍，2*

(1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 棉花研究所/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽(yáng) 455000； 2 鄭州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，鄭州 450000；3 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所，廣東深圳 518000)

植物細(xì)胞通過(guò)短距離和長(zhǎng)距離的通訊進(jìn)行細(xì)胞間的交流，從而調(diào)節(jié)生物過(guò)程來(lái)協(xié)調(diào)生長(zhǎng)和發(fā)育。為了確保正確的信號(hào)交流模式和功能調(diào)控，通過(guò)植物激素、移動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子、非編碼RNA和多肽信號(hào)分子等幾種信號(hào)分子的胞間通訊模式來(lái)實(shí)現(xiàn)這種需求[1-2]。植物激素從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行定向轉(zhuǎn)運(yùn)，具有特異性和方向性，這就為植物的胞間交流提供了一種特定的發(fā)育模式[3-5]。植物的胞間互作主要由激素類的親脂性小分子化合物完成，如生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、茉莉酸、乙烯和油菜素內(nèi)酯等, 這些激素存在于各個(gè)器官組織并參與植物的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段和復(fù)雜的脅迫應(yīng)激等生命過(guò)程，它們作為信號(hào)分子在胞間通訊和交流過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[6-7]。再者，轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors，TF)通過(guò)胞間連絲進(jìn)行直接同向轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)，這種胞間信號(hào)傳導(dǎo)方式也得到了廣泛的研究。轉(zhuǎn)錄因子是編碼特定轉(zhuǎn)錄因子蛋白的基因家族類型，它們的靶基因形成一種調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和非生物應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因的抑制和激活，如研究較為成熟的NAC基因家族主要參與調(diào)控植物的抗旱、耐寒和耐鹽堿[8-10]，煙草(Nicotianatabacum)植物中bZIP(basic leucine zipper)家族成員中的EcbZIP17，可以提高轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)芽率、生物量和存活率[11]。更有趣的是，microRNAs也被認(rèn)為是胞間信號(hào)分子，研究證實(shí)miRNA165/166可以在莖頂端分生組織和根尖分生組織短距離移動(dòng)，調(diào)控原生木質(zhì)部細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[12-13]。作為胞間通訊的信號(hào)肽分子在動(dòng)物體內(nèi)已經(jīng)被研究了很多年，然而在植物中，人們歷來(lái)對(duì)非肽類親脂性植物激素(如生長(zhǎng)素)的高度關(guān)注，卻使信號(hào)肽的重要性顯得相形見(jiàn)絀。近年來(lái)，大量的生化和遺傳研究表明, 植物信號(hào)肽同樣也參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程, 包括細(xì)胞增殖、維管束形成、自交不親和的識(shí)別、分生組織的細(xì)胞平衡和組織脫落、防御反應(yīng)等[5, 14-16]。此外，富亮氨酸重復(fù)受體樣激酶(LRR-RLKs)等一些受體的發(fā)現(xiàn)和鑒定，也進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了信號(hào)肽在植物發(fā)育中的重要性[16-17]。

1 植物小分子肽的發(fā)現(xiàn)

胰島素是人類在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)小分子肽，在動(dòng)物生理調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，隨后在此基礎(chǔ)上又發(fā)現(xiàn)了眾多的小分子肽，它們對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育和抵抗疾病方面都起著非常重要的作用[6]。而在植物體內(nèi)小分子肽的研究還未超過(guò)30年，Pearce等于1991年在番茄(Solanumlycopersicum)中發(fā)現(xiàn)了植物中的第一個(gè)小分子肽——系統(tǒng)素。成熟的系統(tǒng)素包含18個(gè)氨基酸殘基，由一種叫做原系統(tǒng)素酶的200個(gè)氨基酸前體加工而成，主要參與調(diào)控番茄對(duì)病蟲(chóng)害引起的傷害反應(yīng)[18-19]。

小分子肽是重要的胞間信號(hào)感應(yīng)分子，主要參與調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和應(yīng)答生物和非生物脅迫的應(yīng)激反應(yīng)。已有研究表明，肽信號(hào)在植物胞間通信過(guò)程中發(fā)揮了比預(yù)期更大的作用。一些信號(hào)肽在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起信號(hào)傳導(dǎo)作用，而另一些則參與防御反應(yīng)或共生過(guò)程[20-21]。大多數(shù)的小分泌肽蛋白前體都含有前體結(jié)構(gòu)域，需要經(jīng)過(guò)加工處理過(guò)程才能獲得具有生物活性的成熟肽。迄今為止，大多數(shù)具有特征的植物肽作為小信號(hào)肽或抗菌肽來(lái)源于較大的非功能性前體蛋白，該前體蛋白無(wú)生物活性，因此由 N 端信號(hào)肽序列引導(dǎo)蛋白進(jìn)入分泌途徑。這些新類型的信號(hào)肽進(jìn)一步增加了植物小肽研究的復(fù)雜性，盡管它們的數(shù)量仍然有限，但是人們對(duì)其研究發(fā)現(xiàn)的翻譯證據(jù)和功能特征還具有爭(zhēng)議[22-23]。目前被普遍承認(rèn)并可能起激素作用的植物小分子肽包括以下幾類：系統(tǒng)素(Hyp Sys)、CLAVATA3/胚胎周圍區(qū)域相關(guān)肽(CLE)、C端編碼肽(CEP)、植物磺化激動(dòng)素(PSK)、S位點(diǎn)富含半胱氨酸蛋白(SCR)、早期結(jié)瘤蛋白(ENOD40)、一類參與花器官脫落的多肽(IDA)、快速堿化因子(RALF)、表皮模式因子1和2(EPF1、EPF2)、根生長(zhǎng)因子(RGF)/GOLVEN(GLV)/CLEL肽、絨氈層決定因子(TPD1)、氣孔蛋白類肽9 (EPFL9)等[5-6, 23-24]。

2 植物小分子肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與系統(tǒng)分類

成熟的肽段很小，通常由20個(gè)氨基酸殘基組成，極少數(shù)前體的全長(zhǎng)會(huì)超過(guò)120個(gè)氨基酸殘基，并且在植物體內(nèi)通常以很低的生理濃度存在，但是成熟肽段在同源基因之間具有極高的保守性，這對(duì)家族成員的挖掘提供了方便[20]。由于信號(hào)肽在生物體內(nèi)的表達(dá)水平極低，因此對(duì)小肽的挖掘和研究進(jìn)一步復(fù)雜化，這對(duì)研究者們將是一個(gè)非常大的挑戰(zhàn)[25]。

肽信號(hào)可分為分泌型多肽和非分泌型多肽。Matsubayashi等[26]將分泌型肽信號(hào)分為兩類:一類是通過(guò)復(fù)雜的翻譯后修飾，然后進(jìn)行廣泛的蛋白水解過(guò)程而產(chǎn)生的，被稱為翻譯后修飾小肽；另一類以存在多個(gè)分子內(nèi)二硫鍵為特征，并且此類信號(hào)肽中一些經(jīng)歷蛋白水解過(guò)程，一些不經(jīng)歷蛋白質(zhì)水解過(guò)程，但都被統(tǒng)一定義為富含半胱氨酸多肽[5, 19]。華春等[27]在2015年又將所有植物的多肽信號(hào)根據(jù)是否分泌、是否存在N端信號(hào)、胞外還是胞內(nèi)起作用分為四大類: 胞外起作用的翻譯后修飾分泌型小肽、胞外起作用的富含半胱氨酸分泌型多肽、胞外起作用的非分泌型多肽和胞內(nèi)起作用的非分泌型多肽[5, 18, 28-29]，所包括的基因及其功能如表1所示。

在某些情況下，非分泌型多肽既可通過(guò)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞功能，也可從受傷的細(xì)胞中釋放出來(lái)直接參與植物的防御反應(yīng)等[27]。系統(tǒng)素屬于胞外起作用的非分泌型多肽，是一種從番茄葉片發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)為18個(gè)氨基酸的肽，它主要在受傷部位釋放信號(hào)。這類肽能夠引起懸浮液培養(yǎng)細(xì)胞的堿化，誘導(dǎo)防御蛋白酶抑制劑蛋白的合成，并系統(tǒng)地發(fā)出信號(hào)，激活整個(gè)植物的防御基因[18-19]。早期結(jié)節(jié)蛋白因子ENOD40是胞內(nèi)非分泌型多肽的代表之一，該基因的顯著特征是存在短的開(kāi)放閱讀框ORF(少于100個(gè)氨基酸)，在多種豆科植物中都高度保守，主要是編碼的短肽發(fā)揮功能[30]。先前的研究發(fā)現(xiàn)，ENOD40基因的一些功能可能是由編碼的RNA結(jié)構(gòu)決定，主要在根瘤器官的形成和生長(zhǎng)中具有重要作用，并參與調(diào)控豆科植物與細(xì)菌或真菌的共生，在非共生植物發(fā)育過(guò)程中也普遍發(fā)揮作用[31-33]。最新的一項(xiàng)研究也支持了該結(jié)論，定位于核小體的RNA結(jié)合蛋白1 (RBP1)首次在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中被鑒定，作為一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)，它可與早期結(jié)瘤基因ENOD40 (EARLYNODULIN40)相互作用，重新轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)參與蒺藜苜蓿共生結(jié)瘤的形成[30]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)中與RBP1進(jìn)化關(guān)系最近的兩個(gè)同源物被稱為核小體RNA結(jié)合蛋白(nuclear speckle RNA-binding proteins, NSRs)，它們被鑒定為mRNA的特異可變剪接調(diào)節(jié)因子，并在體內(nèi)識(shí)別其他長(zhǎng)鏈非編碼RNA剪接競(jìng)爭(zhēng)因子，從而調(diào)節(jié)側(cè)根的形成[34]。雖然ENOD40似乎具有多種功能，但其活性分子的調(diào)控路徑和表達(dá)機(jī)制尚不清楚。

分泌型多肽包括翻譯后修飾小肽和富含半胱氨酸多肽，主要通過(guò)自由擴(kuò)散方式分泌到胞外空間，對(duì)相鄰細(xì)胞的命運(yùn)起決定性作用[27]。一些翻譯后修飾小肽的特征是結(jié)構(gòu)上存在由特定修飾酶介導(dǎo)的翻譯后修飾，如酪氨酸硫酸化(PSK、PSY和RGF)、脯氨酸羥基化(現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的小肽中除了PSK沒(méi)有脯氨酸殘基,其他所有翻譯后修飾小肽都有羥脯氨酸殘基)和羥脯氨酸阿拉伯糖基化(PSY1、CLV3、CLE2、CLE9和CLE-RS2)以及連續(xù)的蛋白水解過(guò)程，這些修飾可能會(huì)在構(gòu)象上改變肽的活性或非活性狀態(tài)。它們的成熟肽段很短，一般少于20個(gè)氨基酸，是蛋白質(zhì)水解過(guò)程中的結(jié)果[27, 35]。這些多肽最初翻譯成具有N端分泌信號(hào)的約100個(gè)氨基酸殘基的前體多肽，然后通過(guò)翻譯后修飾化及位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中的加工酶的作用，形成具有特殊生物功能的成熟多肽[27, 35]。另一個(gè)分泌型信號(hào)肽是富含半胱氨酸多肽，它的特點(diǎn)是在整個(gè)肽段中存在偶數(shù)個(gè)半胱氨酸(Cys)殘基并形成分子內(nèi)二硫鍵。富含半胱氨酸多肽通常要比翻譯后修飾的小肽(少于160個(gè)氨基酸)大得多，帶正電荷，大約含4～16個(gè)半胱氨酸殘基。這些殘基對(duì)成熟肽的正確構(gòu)象折疊是不可或缺的。與翻譯后修飾小肽不同的是，目前并沒(méi)有研究證實(shí)富含半胱氨酸多肽存在翻譯后修飾過(guò)程[28]。而與翻譯后修飾小肽類似的是，富含半胱氨酸多肽同樣包含一個(gè)保守的 N 端信號(hào)肽，通過(guò)分泌途徑引導(dǎo)多肽到達(dá)正確的細(xì)胞位置，并且它們C端的成熟肽段也高度保守[36-37]。

3 植物小分子肽的功能

3.1 翻譯后修飾小肽

全長(zhǎng)mRNA前肽進(jìn)入分泌通路后，N端疏水信號(hào)肽被信號(hào)肽酶剪切。翻譯后修飾小肽(PTM)和富含半胱氨酸多肽(Cys-rich peptides)會(huì)通過(guò)不同的途徑產(chǎn)生成熟的活性肽。到目前為止，在植物中發(fā)現(xiàn)，所有翻譯后修飾小肽都?xì)v經(jīng)三種翻譯后修飾方式的其中一種或多種：絡(luò)氨酸(Tyr)硫酸化(黃色)，脯氨酸(Pro)羥基化(紅色)和/或羥脯氨酸(Hyp)-阿拉伯糖基化(綠色)，激活從前體蛋白序列中裂解修飾的肽段，從而得到一個(gè)不超過(guò)20種氨基酸殘基的翻譯后修飾小肽(PTM)[23](圖1)。許多參與植物發(fā)育、防御反應(yīng)、細(xì)胞識(shí)別和胞間通訊的肽家族都屬于這個(gè)亞家族[26]，這些肽作為信號(hào)分子被特定的受體感知。雖然PTM肽下游在分子和生理活動(dòng)方面已經(jīng)取得了進(jìn)展，但具體的作用模式和調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。

圖1 翻譯后修飾小肽和富含半胱氨酸多肽的加工修飾過(guò)程[5]Fig.1 Processing and modification of post translationally modified small peptides and Cys-rich peptides[5]

C端編碼的多肽CEPs(C-terminally encoded peptides)，是由15個(gè)氨基酸殘基組成的肽段，其中有2～4個(gè)脯氨酸殘基可能被羥基化，從而影響細(xì)胞的生物活性[51-52]。擬南芥中CEP1的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致根系生長(zhǎng)停滯[51]，并且在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中發(fā)現(xiàn)CEP1的過(guò)表達(dá)或應(yīng)用外源合成的CEP1均可抑制側(cè)根的形成，增強(qiáng)根瘤的形成，誘導(dǎo)根周期性的膨大[52-53]。CEP5表達(dá)水平的改變也會(huì)影響擬南芥在地上組織的生長(zhǎng)發(fā)育[54]。此外，Tabata等[71]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了CEP基因的兩個(gè)受體EPR1和CEPR2。迄今為止，CEP多肽在序列、長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)和翻譯后修飾上的變化已經(jīng)被鑒定，并且證明了通過(guò)CEP受體(CEPRs)控制氮(N)的需求信號(hào)，參與豆科植物的根瘤形成和側(cè)根發(fā)育[55]。

CLE[CLAVATA3 (CLV3)/胚胎周圍區(qū)域]家族是PTM 肽中研究最早且最深入的小分子肽[38]。在擬南芥中，CLV3肽通過(guò)維持莖頂端分生組織的干細(xì)胞數(shù)量，發(fā)揮調(diào)節(jié)莖頂端分生組織的作用。自從發(fā)現(xiàn)了CLV3基因，隨后在雙子葉植物、單子葉植物、苔蘚和藻類中也逐漸發(fā)現(xiàn)了CLE家族的存在，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明該家族在植物的不同發(fā)育過(guò)程和特異性組織中發(fā)揮重要作用，包括莖頂端分生組織和根頂端分生組織的發(fā)育、種子發(fā)育、維管束形成、結(jié)節(jié)形成、胚胎和胚乳的發(fā)育、根系結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)以及形成層中的干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的調(diào)控等方面[24, 39, 72]。此外，還發(fā)現(xiàn)CLE基因在植物應(yīng)對(duì)環(huán)境刺激的反應(yīng)中也發(fā)揮各種生物學(xué)作用[73]。更重要的是，CLE家族作為一種肽配體，與多種受體的關(guān)系也多種多樣，一個(gè)受體激酶可以作為不同肽的受體，一個(gè)肽也可以被不同的受體識(shí)別。例如，在韌皮部和鄰近細(xì)胞中表達(dá)的TDIF/CLE41/CLE44肽可被原形成層細(xì)胞質(zhì)膜上的富含亮氨酸重復(fù)受體樣激酶(LRR-RKs)TDR/PXY受體識(shí)別，并調(diào)控原形成層細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育[72]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CLV1不僅是CLE2的受體，也是CLV3的受體，前者配體-受體模塊主要系統(tǒng)地調(diào)節(jié)豆科植物根瘤的數(shù)目，后者主要在莖頂端分生組織維持期間發(fā)揮功能[74-75]。

植物中發(fā)現(xiàn)的含硫酸酪氨酸1 (PSY1)肽是一種含有18個(gè)氨基酸殘基的糖肽，SY1和PSK在納摩爾濃度下促進(jìn)細(xì)胞顯著增殖和擴(kuò)張。擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)編碼PSY1前體同源物的基因，它們?cè)诒Ｊ氐腜SY1結(jié)構(gòu)域內(nèi)具有顯著的相似性，并參與蛋白水解過(guò)程中堿性氨基酸殘基的調(diào)控[44]。近期研究發(fā)現(xiàn)PSYR1為PSY的受體，它們都可通過(guò)調(diào)節(jié)水楊酸鹽和茉莉酸鹽參與植物的防御反應(yīng)[76-77]。再者，富含羥脯氨酸糖肽(HYPSYS)是由15～20個(gè)氨基酸組成并含有4～7個(gè)可能羥基化的前位殘基的另一種糖肽，主要存在于茄科植物中[78]。HYPSYS信號(hào)肽可以激活蛋白酶抑制劑，在防御昆蟲(chóng)等食草動(dòng)物方面發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)該信號(hào)肽在煙草中過(guò)度表達(dá)時(shí)，可以增強(qiáng)植物對(duì)棉蚜幼蟲(chóng)的抗性[79]。此外，根生長(zhǎng)因子(RGF/CLEL/GLV)肽段長(zhǎng)為13～18個(gè)氨基酸，該成熟肽是通過(guò)具有C-端保守基序的前體蛋白進(jìn)行蛋白水解裂解而產(chǎn)生[57, 80]。調(diào)控花序脫落的IDA(inflorescence deficient in abscission)也是一種多肽信號(hào)，在花器官中正向調(diào)節(jié)花器官脫落，它和另外5個(gè)同源基因IDA-like (IDLs)共同享有一個(gè)C端附近的保守區(qū)域，這個(gè)保守區(qū)域是一段很短的合成肽，功能與 IDA相似[56]。由此看來(lái)，信號(hào)肽在根的重力作用、根尖分生組織的維持，根毛、側(cè)根和芽的生長(zhǎng)和發(fā)育，以及花序脫落、應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫等方面都發(fā)揮著重要的作用[80-81]。

3.2 富含半胱氨酸多肽

富含半胱氨酸(Cys)的肽段，其特征是包含2～16個(gè)半胱氨酸殘基的功能結(jié)構(gòu)域。富含半胱氨酸多肽通常不需要前體蛋白的水解過(guò)程，但也有例外。富含半胱氨酸肽的激活是在保守的半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵時(shí)完成的，從而使肽具有活性構(gòu)象[5](圖1)。但它們的肽段長(zhǎng)度和原始蛋白序列在肽段和物種之間都存在很大的差異，每個(gè)富含半胱氨酸的肽類都有一個(gè)半胱氨酸殘基的數(shù)量特征和位點(diǎn)差異特征。位點(diǎn)差異會(huì)影響分子內(nèi)二硫鍵的形成，對(duì)適當(dāng)?shù)念愄禺愋源渭?jí)折疊和生物活性至關(guān)重要[23](圖1)。實(shí)驗(yàn)證明抗菌肽AMPs能夠減輕宿主的防御反應(yīng)，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生對(duì)病原體的持久抵抗。而大多數(shù)已發(fā)現(xiàn)的富含半胱氨酸的植物肽被認(rèn)為在植物與微生物的相互作用中發(fā)揮著和抗菌肽相似的作用，并且已經(jīng)從植物的根、葉、莖、花和種子中分離出來(lái)。

目前為止，植物防御素(PDFs)是研究最深入的富含半胱氨酸多肽，長(zhǎng)度為5 kD，該信號(hào)肽的主要特征是由1個(gè)螺旋形和1個(gè)三股的環(huán)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成，并由4個(gè)二硫鍵穩(wěn)定該結(jié)構(gòu)[23, 82]。PDFs廣泛存在于單子葉和雙子葉植物中，屬于致病相關(guān)的蛋白家族。相關(guān)實(shí)驗(yàn)認(rèn)為多種PDFs的外源過(guò)表達(dá)增加了模式植物和多種作物對(duì)不同真菌和細(xì)菌的抗性[83]。PDFs的其他相關(guān)活性酶也被報(bào)道，包括胰蛋白酶、α-淀粉酶、蛋白質(zhì)合成抑制劑和阻斷鈉通道因子。此外，研究表明一些PDFs似乎在花粉識(shí)別、非生物脅迫耐受和根生長(zhǎng)抑制等方面也發(fā)揮著重要作用[83]。

其次，硫蛋白(THIONINs)存在于單子葉和雙子葉植物中，屬于PR13(pathogenesis-related 13)家族，它們對(duì)細(xì)菌、真菌、酵母、昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等均產(chǎn)生毒性[84]。環(huán)肽(cyclotides)是一種特殊類型的打結(jié)肽，其特征是具有頭尾環(huán)化主干的長(zhǎng)約30個(gè)氨基酸殘基的肽段，因此是一種超穩(wěn)定肽。環(huán)肽具有廣泛的活性，包括在真菌、細(xì)菌、病毒、昆蟲(chóng)、軟體動(dòng)物、藤壺和線蟲(chóng)等體內(nèi)抑制生物活性[23, 85]。類HEVIN肽是含有6～10個(gè)半胱氨酸殘基的4 kD幾丁質(zhì)結(jié)合肽，來(lái)源于前體蛋白。目前為止，在單子葉和雙子葉植物中只檢測(cè)到少量的類HEVIN肽[86]。實(shí)驗(yàn)證明類HEVIN肽的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致植物對(duì)各種真菌和卵菌病原菌的抗性增強(qiáng)[87-88]。因此，基于其與幾丁質(zhì)的結(jié)合能力，提出了它們?cè)谥参锓烙^(guò)程可能發(fā)揮重要的作用[89]。

另外，分子量約為5 kD快速堿化因子(RALF)肽段來(lái)自于前體蛋白的C末端，是利用質(zhì)譜技術(shù)在煙草葉片中檢測(cè)到的。利用磷蛋白組學(xué)方法，野薔薇(RosamultifloraThunb.)RLK1類激酶(Cr-RLK1L)受體家族中的FER(feronia)被鑒定為RALF受體，隨后，提出了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的模型[90-91]。表皮模式因子(EPF)和與表皮模式因子類似的肽段(EPFL)，在C端成熟肽區(qū)包含6～8個(gè)保守的半胱氨酸殘基，長(zhǎng)度約為45～76個(gè)氨基酸，由前蛋白衍生而來(lái)[23]。研究發(fā)現(xiàn)EPF/EPFL基因存在于苔蘚、單子葉植物和雙子葉植物中，體外過(guò)表達(dá)EPF1、EPF2、EPFL4和EPFL5均會(huì)抑制氣孔的發(fā)育[65-66]。相反，EPFL9 的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致植物氣孔密度的增加，并且近期實(shí)驗(yàn)證實(shí)EPFL9 參與了氣孔通路的光響應(yīng)[36]。

4 CLE和RALF小分子肽的研究進(jìn)展

4.1 CLE小分子肽的研究背景和研究進(jìn)展

CLE(CLAVATA3/胚胎周圍區(qū)域)小肽作為翻譯后修飾小肽的代表，是近幾年植物信號(hào)肽中最熱門(mén)的研究課題之一，CLE基因編碼保守的C末端CLE基序的小分泌肽。成熟的CLE肽是CLE基序經(jīng)過(guò)翻譯后修飾(如羥基化和糖基化)，而后從其前體蛋白中分離出來(lái)的一段小肽[73, 92-93](圖1)。CLE基序是一個(gè)包含14個(gè)左右的保守氨基酸殘基的序列(KRXVPXGPNPLHNR)，稱為CLE基序或CLE結(jié)構(gòu)域，是許多植物細(xì)胞增殖和分化機(jī)制的重要調(diào)控因子[73, 94-95]。但也有報(bào)道指出CLE保守基序長(zhǎng)度為12～13個(gè)氨基酸殘基[96]。

CLE信號(hào)肽廣泛存在于自然界中，其名稱最早起源于兩個(gè)家族成員：擬南芥的CLV3基因和玉米(Zeamays)的ESR基因家族[38, 96-97]。CLV3和ESR序列共享14個(gè)氨基酸殘基，是一段短而保守的蛋白質(zhì)序列，它們的結(jié)構(gòu)和功能相似但并不相關(guān)，ESR基因主要在玉米胚乳的胚芽周圍區(qū)域特異性表達(dá)，而CLV3主要控制莖尖分生組織中干細(xì)胞的命運(yùn)[38, 98]。CLE保守結(jié)構(gòu)域是CLE蛋白的功能域，因此含有CLV3 結(jié)構(gòu)域的蛋白序列均被定義為CLE基因家族[38, 92, 99]，而CLE蛋白由N端信號(hào)肽SP(Signal Peptide)、C端CLE保守基序和中間的可變區(qū)域組成。SP是一種疏水信號(hào)肽，可變區(qū)(相對(duì)于CLE基序的N端)編碼的蛋白通常沒(méi)有特定功能，可以用其他基因的核苷酸代替，CLE保守基序是重要的功能結(jié)構(gòu)域[41-42, 96]。分泌的信號(hào)肽就像激素一樣也被證明可以調(diào)節(jié)植物的生理反應(yīng)，參與植物細(xì)胞間的交流[100-101]。多細(xì)胞生物的生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)都依賴于細(xì)胞間的通訊，所有生物都利用細(xì)胞表面的受體來(lái)感知來(lái)自自身、非自身或修飾自我的胞外信號(hào)[73, 102]。而肽信號(hào)分子的級(jí)聯(lián)就是以配體-受體的方式將信號(hào)從一個(gè)細(xì)胞傳遞到另一個(gè)細(xì)胞。然而，信號(hào)肽配體-受體結(jié)合并不僅僅是一對(duì)一的單一作用，肽通過(guò)不同的受體激活多個(gè)下游信號(hào)肽，受體也會(huì)根據(jù)不同的信號(hào)肽傳遞不同的信號(hào)。例如，CLE1發(fā)揮功能在很大程度上依賴于CLV1，CLE11不那么依賴，而CLE22完全不依賴，并利用CLV1以外的受體發(fā)揮作用，表明這些CLE在受體靶點(diǎn)上存在相當(dāng)大的差異[103-104]。

近期一項(xiàng)研究首次表明，在植物孢囊線蟲(chóng)(cystnematodes)和叢枝菌根(Arbuscularmycorrhiza,AM)中也發(fā)現(xiàn)了CLE基因家族，并且許多基因包含高度保守的CLE結(jié)構(gòu)域[103-104]。Guo等從擬南芥孢囊線蟲(chóng)中分離到一類新的CLE肽，其功能與CLE41和CLE44基因編碼的B型CLE肽TDIF(管胞元素分化抑制因子)相似，并且進(jìn)一步證明了TDIF-TDR (TDIF受體)-WOX4通路促進(jìn)原形成層分生組織的細(xì)胞增殖，參與調(diào)控甜菜孢囊線蟲(chóng)的寄生關(guān)系[38, 42-43]。有證據(jù)表明，植物根組織中的線蟲(chóng)病原體也分泌類似植物CLE肽的配體，它們將選定的寄主細(xì)胞修飾成多核取食位點(diǎn)，并在功能上模仿一種植物肽，參與胞間信號(hào)傳導(dǎo)，以達(dá)到寄生的目的。叢枝菌根在真菌與植物共生中起重要作用，主要促進(jìn)菌根的發(fā)育，有利于植物根系更好地吸收養(yǎng)分[105-106]。

CLE信號(hào)肽也存在于多種植物中，一項(xiàng)研究表明在小立碗蘚(Physcomitrellapatens)中發(fā)現(xiàn)了15個(gè)CLE基因，隨后在擬南芥、水稻(OryzasativaL.)、楊樹(shù)(Populustrichocarpa)、大豆(Glycinemax)和其他多細(xì)胞植物中也逐步發(fā)現(xiàn)了CLE基因[105-108]。CLE家族在模式植物擬南芥中得到深入研究，32個(gè)基因成員可被分為A型和B型兩大類型，由于不同物種間的差異，如果將擬南芥的32個(gè)CLE成員和其他物種的CLE成員共同進(jìn)行進(jìn)化分析，分類情況可能會(huì)超過(guò)兩類[20]。由于CLV3發(fā)現(xiàn)最早，因此是A類型基因中研究最為深入和透徹的一個(gè)基因，在擬南芥中主要促進(jìn)根尖分生組織和莖尖分生組織的細(xì)胞分化[19]。B類型中最具典型特征和功能的CLE基因有4個(gè)(CLE41/TDIF/CLE44/CLE46)，主要促進(jìn)擬南芥維管束細(xì)胞增殖，延緩韌皮部和木質(zhì)部細(xì)胞群分化，調(diào)節(jié)維管干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。大量研究證明CLE分泌的肽在各種植物的信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用，如傷口反應(yīng)、花粉不親和性，特別是在莖尖分生組織和根尖分生組織中維持干細(xì)胞群穩(wěn)態(tài)期間發(fā)揮了重要作用[108-110](圖2)。此外，有少量研究發(fā)現(xiàn)小分子肽還參與植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫的過(guò)程。例如，擬南芥CLE25在維管組織中表達(dá)，并與BAM受體結(jié)合通過(guò)調(diào)控脫落酸的積累來(lái)誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，從而增強(qiáng)擬南芥對(duì)脫水脅迫的抵抗能力。因此CLE25-BAM通路可能在脫水反應(yīng)中作為長(zhǎng)距離信號(hào)分子之一發(fā)揮著重要的作用[106]。

可見(jiàn)，植物中CLE信號(hào)肽主要調(diào)控莖尖分生組織和根尖分生組織及器官在靜止中心(QC)周圍的干細(xì)胞數(shù)量和大小的穩(wěn)定性，而植物干細(xì)胞的增殖分化是各種器官和組織的主要來(lái)源[93, 111]。因此，與植物激素類似，肽信號(hào)也是植物生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫的重要信號(hào)通路。

4.2 RALF小分子肽的研究背景和研究進(jìn)展

RALF(快速堿化因子)是一種大小約為5 kD的小分子肽，首次在煙草葉片提取物中發(fā)現(xiàn)，能夠引起煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基的快速堿化，同時(shí)激活細(xì)胞內(nèi)有絲分裂原活化蛋白激酶。隨著各個(gè)物種全基因組測(cè)序的基本完成，在多個(gè)物種中都發(fā)現(xiàn)有該基因的存在，最近在紫花苜蓿和番茄中也發(fā)現(xiàn)了RALF基因[60-61, 112]?？焖賶A化因子(RALFs)是植物界廣泛存在的富含半胱氨酸的多肽，盡管比翻譯后修飾小肽(CLE、CLV3和RGF等)更大，但它們?nèi)匀缓苄?小于160個(gè)氨基酸)[113]。獲得N端肽序列之后從煙草葉片文庫(kù)中分離出一個(gè)前體cDNA，該前體編碼了一個(gè)大小為115個(gè)氨基酸殘基的蛋白序列，其C端包含一個(gè)RALF保守結(jié)構(gòu)域，而大小為49個(gè)氨基酸殘基的活性肽就是從保守的C端釋放出來(lái)的，N端信號(hào)肽序列也是相對(duì)保守的，中間序列基本沒(méi)有顯著特征。此外，C端保守結(jié)構(gòu)域中含有豐富的半胱氨酸，通常含有4～6個(gè)半胱氨酸殘基，相鄰兩個(gè)殘基之間會(huì)形成分子內(nèi)二硫鍵[28, 40]。

圖2 CLE在成熟擬南芥不同組織中的表達(dá)示意圖[23]Fig.2 The schematic representations of CLE expressed in the various tissues of a mature Arabidopsis plant[23]

通過(guò)對(duì)EST數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索發(fā)現(xiàn)，RALF基因廣泛存在于雙子葉植物、單子葉植物和裸子植物中，如擬南芥、楊樹(shù)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、番茄等其他茄科(Solanaceae)植物[28, 112, 114]。擬南芥中已經(jīng)鑒定出了40個(gè)編碼RALF和RALF-like (RALFL)基因，并在不同器官和組織中表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式[115](圖3)。研究表明，AtRALF1和AtRALF23在根中特異性表達(dá)，其在擬南芥中的過(guò)表達(dá)表現(xiàn)出幼苗的根細(xì)胞減小，生長(zhǎng)緩慢[116-117]，另外的研究還發(fā)現(xiàn)了擬南芥的兩個(gè)受體BUPS1和BUPS2及其肽配體RALF4和RALF19均在花粉管中表達(dá)，參與花粉管的生長(zhǎng)發(fā)育，維持花粉管的完整性，表明RALF4和RALF19的功能依賴于調(diào)控花粉表達(dá)的富亮氨酸重復(fù)擴(kuò)增酶(LRX)蛋白，因此該蛋白在細(xì)胞壁的發(fā)育中也具有重要作用，但是其作用方式尚不清楚[117-118]。研究進(jìn)一步證明，RALF4作為肽配體，其N端信號(hào)肽區(qū)域(包括YISY結(jié)構(gòu)域)對(duì)其生物學(xué)功能至關(guān)重要，C端的保守功能域能夠與受體LLG結(jié)合，但與LLGs的作用較弱而與BUPS-ANX受體的相互作用較強(qiáng)[119]。其次，番茄的RALF基因也表現(xiàn)出花粉特異性表達(dá)，它在特定的發(fā)育期內(nèi)抑制花粉管的伸長(zhǎng)，但不影響花粉活力、水化或早期萌發(fā)[61, 112]。另外，前人從楊樹(shù)cDNA文庫(kù)中也分離到了兩種獨(dú)特的楊樹(shù)RALF肽的cDNAs：PtdRALF1和PtdRALF2。實(shí)驗(yàn)研究表明，PtdRALF1在楊樹(shù)莖端、葉柄、葉、莖、根、芽、樹(shù)皮中都有不同程度的表達(dá)水平；相比之下，PtdRALF2在大多數(shù)組織中也都有表達(dá)，但在幼葉和成熟葉中卻幾乎沒(méi)有表達(dá)或者表達(dá)水平極低。然而，研究也顯示在外源茉莉酸甲酯(MeJa)處理后，楊樹(shù)體內(nèi)的RALF表達(dá)量明顯降低，尤其是PtdRALF2[112]。

圖3 RALF在成熟擬南芥不同組織中的表達(dá)示意圖[122]Fig.3 The schematic representations of RALF expressed in the various tissues of a mature Arabidopsis plant[122]

此外，眾多的相關(guān)研究均發(fā)現(xiàn)，RALF作為一種小肽更可能參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程而不是防御反應(yīng)。例如，RALF信號(hào)肽能抑制番茄植株的根系生長(zhǎng)，但不能誘導(dǎo)抗草食動(dòng)物蛋白酶抑制劑的產(chǎn)生[28]；其次，RALF肽在果實(shí)成熟的某一階段有中度甚至高度表達(dá)水平，但在防御信號(hào)通路的表達(dá)量并不顯著；最后，對(duì)含有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的植物進(jìn)行非生物脅迫處理后，這些基因的mRNA水平并無(wú)顯著變化[28, 114]。但是2013年的一項(xiàng)研究表明，AtRALFL8在根中被多重脅迫所誘導(dǎo)，但在擬南芥中過(guò)表達(dá)時(shí)，又增加了擬南芥在干旱脅迫和線蟲(chóng)感染下的敏感性。因此，AtRALFL8的誘導(dǎo)說(shuō)明植物通過(guò)不同激素信號(hào)通路使細(xì)胞發(fā)生復(fù)雜的生理變化，從而產(chǎn)生保護(hù)它們免受脅迫的生理機(jī)制[120]。該研究結(jié)果表明，在同時(shí)存在的生物和非生物脅迫的環(huán)境下，植物可以產(chǎn)生類似于AtRALFL8這樣的信號(hào)肽來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞壁重塑以應(yīng)對(duì)多種外界壓力。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果推翻了先前的RALF堿化因子僅參與植物生長(zhǎng)發(fā)育而不是防御反應(yīng)的結(jié)論。然而，最新的研究又發(fā)現(xiàn)，在病原體觸發(fā)植物免疫反應(yīng)后，RALF23及其同源蛋白R(shí)ALF33通過(guò)蛋白水解酶激活，從而抑制了植物的免疫反應(yīng)[121]。由此得知，大量物種的RALF信號(hào)通路和基因功能都還沒(méi)有得到證實(shí)，本文的概述為未來(lái)快速堿化因子RALF的研究提供了一個(gè)重要的方向。

5 總結(jié)與展望

植物信號(hào)肽分子是一種小肽，作為信號(hào)分子，正如傳統(tǒng)植物激素一樣，往往起到“四兩撥千斤”的作用。多種植物小分子肽的研究表明，小分子肽是由前體蛋白加工而成的一種多肽，廣泛存在于多種植物中，包括裸子植物、單子葉植物、雙子葉植物、苔蘚和藻類等植物，并且在植物的多種器官中都有不同水平的表達(dá)，參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育等許多生物學(xué)過(guò)程，說(shuō)明它們?cè)谥参矬w內(nèi)具有重要的調(diào)控作用。雖然植物信號(hào)肽的研究已經(jīng)取得一些進(jìn)展，但由于功能肽段很短，在植物體內(nèi)的表達(dá)水平極低，因此該方面研究仍具有巨大的挑戰(zhàn)。近10 年來(lái)，各種組學(xué)技術(shù)日新月異，尤其是近年來(lái)基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)相關(guān)研究已從模式植物擬南芥、水稻等成功延伸到各種經(jīng)濟(jì)作物。越來(lái)越多的已知植物信號(hào)肽激素的同源物被發(fā)現(xiàn)和鑒定，特別是一些物種特異性和環(huán)境適應(yīng)性的信號(hào)肽也得到進(jìn)一步發(fā)掘和鑒定。但是如何驗(yàn)證眾多的小分子肽的生物學(xué)功能并在生產(chǎn)中充分利用是未來(lái)研究的一個(gè)重要方向和巨大挑戰(zhàn)。植物小肽是一個(gè)極具前景的研究領(lǐng)域，但其數(shù)量多、生物學(xué)功能研究難度大，加上目前植物小分子肽的研究技術(shù)手段也還不夠成熟，給植物小分子肽的研究增加了難度，但同時(shí)也為植物多肽的研究提供了更大的契機(jī)。如若將小分子肽成功應(yīng)用到生產(chǎn)中，就可以減少農(nóng)藥化肥等的施用量，起到減肥增效的效果，還能提高經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。