武小霞，崔一凡，謝建國，趙雅彬，李佳鵬，井紅鈺，趙 瑩

（東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030）

大豆（Glycine maxL.Merr.）是世界重要糧油作物，也是人類攝入植物蛋白質(zhì)主要來源。貯藏、結(jié)構和防御相關的三類蛋白是大豆中蛋白存在主要形式，其中貯藏類蛋白在大豆蛋白中約占70%[1]。按照蛋白質(zhì)沉降系數(shù)為分類標準，可將大豆中蛋白質(zhì)分為4個組分，即2S、7S、11S和15S組分，其中7S與11S球蛋白含量最豐富[2]。7S與11S球蛋白在加工特性與營養(yǎng)品質(zhì)方面具有顯著差異，因此，兩者也共同決定大豆蛋白制品功能特性以及營養(yǎng)價值[3]。種子中7S和11S球蛋白含量差異影響大豆營養(yǎng)品質(zhì)及加工特性。

7S球蛋白由多種蛋白共同組成，其最主要成分為β-伴大豆球蛋白，另外還包括堿性7S球蛋白以及γ-伴大豆球蛋白，由α'、α和β亞基組成[4]。7S球蛋白可用于降低肥胖癥患者內(nèi)臟脂肪及血脂血糖[5]。11S球蛋白主要由酸性亞基A和堿性亞基B組成，其中酸性亞基有增強胰島素功能[6]。11S球蛋白含硫氨基酸含量較高，是7S球蛋白含硫氨基酸含量5～6倍[7]。Kita等發(fā)現(xiàn)11S球蛋白中氨基酸含量顯著高于7S球蛋白[8]。這與Coates等發(fā)現(xiàn)β-伴大豆球蛋白β-亞基無含硫氨基酸顯著降低，導致7S球蛋白中氨基酸含量降低一致[9]。

QTL定位利用分子標記與基因連鎖關系控制數(shù)量性狀基因，是挖掘功能基因主要方法，目前關于大豆11S/7S球蛋白研究多為利用種質(zhì)資源群體分析11S/7S球蛋白比值對大豆加工特性的影響。與QTL定位相關大豆蛋白研究大部分基于蛋白質(zhì)含量。目前國內(nèi)外已開展大量有關大豆蛋白含量及組分QTL定位研究[10-11]，對于蛋白中11S/7S球蛋白比值相關QTL定位及相關基因分析研究較少。本研究以野生大豆ZYD00006為供體，以栽培大豆綏農(nóng)14為輪回親本構建全基因組導入系，對大豆11S/7S球蛋白比值作QTL定位并分析候選基因，為大豆分子輔助育種提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 植物材料與種植方法

本研究將野生大豆ZYD00006作為供體親本，經(jīng)雜交與回交導入輪回親本栽培大豆綏農(nóng)14中，構建一個野生大豆全基因組導入系群體。于2018年及2019年將該群體種植于黑龍江省哈爾濱市香坊區(qū)東北農(nóng)業(yè)大學實驗實習與示范向陽基地（北緯45°450 N，東經(jīng)126°380 E）。每行80株，行長與株距分別為5 m和0.06 m，按區(qū)收獲并脫粒，籽粒留作后期分析使用。

1.2 11S/7S球蛋白比值測量

2018年、2019年導入系植株各181份材料，每份材料隨機取100粒磨成豆粉，稱量0.1 g，加入1 mL提取緩沖液（10%NaCL溶液）65℃水浴40 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，與Loading Buffer 2∶1混合備用。參考姜振峰等方法[12]。采用濃度10%分離膠和5%濃縮膠測定7S與11S球蛋白各亞基含量。SDS-PAGE電泳后，置于考馬斯亮藍G-250中染色2 h，反復脫色至膠條上條帶清晰可見。凝膠脫色后掃描儀掃描，用Quantity one（4.6.2）分析凝膠照片，計算11S/7S球蛋白比值。

1.3 統(tǒng)計與分析

利用SPSS 17.0軟件對兩年內(nèi)大豆11S/7S球蛋白比值作統(tǒng)計分析。所用分子標記信息參照文獻[13]，QTL分析采用ICIMapping 4.1中“CSL”模塊，采用完備區(qū)間作圖法和單標記分析法檢測QTL。若似然函數(shù)比值對數(shù)值（Logarithm of odds，LOD）≥2則認為QTL存在，QTL最終命名采用q+性狀名稱+LG或LG編號+“-”+QTL編號方式[14]。

1.4 基因注釋

將目標區(qū)間內(nèi)基因比對到GO數(shù)據(jù)庫（https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/）與KEGG數(shù)據(jù)庫（https://www.KEGG.jp/）作基因注釋。采用信息學分析方法，將同源基因信息、顯著富集的代謝通路信息、編碼蛋白信息整合，預測區(qū)間內(nèi)候選基因功能，初步篩選與11S/7S球蛋白比值性狀相關候選基因。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

以輪回親本綏農(nóng)14為對照，以90%分位數(shù)和10%分位數(shù)分別作為篩選高低表型極端材料閾值，低于10%分位數(shù)11S/7S球蛋白比值材料作為低表型極端備選材料，高于90%分位數(shù)11S/7S球蛋白比值材料作為高表型極端備選材料，將兩年得到各極端備選材料取交集得到實時定量材料。

Trizol法提取種子RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。為確定候選基因在不同材料中轉(zhuǎn)錄水平，使用LightCycler480系統(tǒng)和Primer 5軟件設計引物作qRT-PCR分析。通過Primer 5軟件設計6個候選基因特異性引物，內(nèi)參基因為GmActin4（GenBank No：AF049106），引物序列見表1。退火溫度范圍為55.8～59.1℃，試驗溫度為57℃。候選基因轉(zhuǎn)錄水平根據(jù)2-ΔΔct計算。為保證試驗準確性和可靠性，每個樣品3次重復。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers of qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 CSSL群體兩年表型數(shù)據(jù)分析

2018以及2019年CSSL群體11S/7S球蛋白比值表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計情況見表2。兩年間CSSL群體11S/7S球蛋白比值差異較大，范圍為0.22～5.90。2018年群體11S/7S球蛋白比值平均值為1.52，標準差為0.66，峰度為1.72，偏度為1.33。2019年群體11S/7S球蛋白比值平均值為2.23，標準差為1.23，峰度為0.19，偏度為0.85。CSSL群體底莢高度呈近似正態(tài)分布，適用于QTL定位（見圖1）。

2.2 大豆11S/7S球蛋白比值性狀QTL分析

利用單標記分析，在J連鎖群上定位到1個QTL，該位點位于16號染色體上，起始位置為1 046 637 bp，終止于1 170 661 bp，全長124 024 bp，命名為q11S/7S-J-16。加性效應為0.3299，表型貢獻率為6.49%。

利用完備區(qū)間作圖法，在3個連鎖群上發(fā)現(xiàn)3個大豆11S/7S球蛋白QTL（見表3）。其中，在J連鎖群上定位到QTL與單標記分析檢測到QTL位置相同（見圖2）。

表2 兩年CSSL群體11S/7S球蛋白比值表型數(shù)據(jù)參數(shù)Table 2 Phenotypic data parameters of 11S/7S globulin ratio of CSSL population in two years

圖1 CSSL群體11S/7S球蛋白比值表型數(shù)據(jù)頻率分布Fig.1 Frequency distribution of phenotypic data of 11S/7S globulin ratio in CSSL population

表3 ICIM法對大豆11S/7S球蛋白比值相關QTL分析Table 3 Analysis of QTL related to soybean 11S/7S globulin ratio by ICIM

圖2 CSSL群體11S/7S球蛋白比值QTL在連鎖群上分布Fig.2 Distribution of QTLs for 11S/7S globulin ratio in CSSL population on linkage group

由表3可知，所有QTL表型貢獻率最大值為6.10%，最小值為4.93%，LOD在2.00～2.49內(nèi)浮動。通過2018年數(shù)據(jù)檢測到一個QTL位點q11S/7S-K-1，表型貢獻率為4.93%，加性效應為0.4016。2018年數(shù)據(jù)檢測到一個QTL位點q11S/7SO-1，該位點表型貢獻率最大為6.10%，加性效應為0.3222。2019年檢測到q11S/7S-J-1表型貢獻率為5.08%，加性效應為0.9879。所有加性效應均為正值，說明控制大豆11S/7S球蛋白有利基因來自于綏農(nóng)14。

2.3 QTL區(qū)間基因注釋

對QTL區(qū)間作基因注釋，共得到46個候選基因（見表4）。參考Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#）網(wǎng)站基因時空表達量數(shù)據(jù)，結(jié)合基因注釋信息分析方法，篩選出與蛋白性狀相關候選基因6個。其中，Glyma.09G014400被描述為功能性抑制劑、脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白、種子存儲2S蛋白白蛋白超家族蛋白，疏水種子蛋白。Glyma.09G014700被描述為ADP-核糖基化因子GTP酶激活蛋白AGD11相關，Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白。Glyma.09G015100被描述為磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白SEC14和相關蛋白。Glyma.16G034700被注釋為與任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復合物。Glyma.16G036200被注釋為60S核糖體蛋白L7，大亞基核糖體蛋白L7e。Glyma.16G036300被注釋為陽離子相關的陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白，氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白。

2.4 候選基因表達模式分析

上述6個基因在2個高表型、2個低表型及對照中相對表達量如圖3所示。

由圖3可知，Glyma.09G015100在低表型及高表型材料中相對表達量均高于對照材料，說明該基因在球蛋白表達中有促進作用，還可看出，在高表型材料R31/R190中相對表達量顯著高于低表型材料R33/R153，初步說明，該基因?qū)?1S蛋白正調(diào)控。其余5個基因，在低表型及高表型材料中相對表達量均低于對照，對球蛋白負調(diào)控。認為Glyma.09G015100更具有研究價值，可在今后深入研究其功能。

表4 候選基因功能注釋Table 4 Function annotation of the candidate genes

圖3 候選基因在不同表性材料中相對表達量Fig.3 Relative expression levels of candidate genes in different surface materials

3 討論與結(jié)論

研究表明，11S球蛋白對營養(yǎng)品質(zhì)及加工特性影響優(yōu)于7S球蛋白。11S球蛋白含量上升同時導致7S球蛋白含量下降，因此，可通過適當調(diào)整11S/7S球蛋白比值，實現(xiàn)大豆營養(yǎng)品質(zhì)與加工特性改良。11S球蛋白含量有利于提高豆腐質(zhì)構特性，與豆腐質(zhì)構指標之間均呈正相關。Poysa等研究發(fā)現(xiàn)11S球蛋白中A3亞基對豆腐品質(zhì)影響最大，A4亞基則對豆腐品質(zhì)有負影響[15]。Nishinari等認為缺失11SA 5'端球蛋白大豆制成的豆腐品質(zhì)更好[16]。Fukushima認為11S球蛋白中亞基與大豆蛋白凝膠速度和透明性密切相關[17]。Saio等認為11S球蛋白加熱后形成的凝膠富有保水性，有較高拉應力及剪切力，在制成豆腐時凝膠硬度、彈性較好[18]。Kitamura等分析1 700份大豆種子蛋白亞基含量得出，一般大豆11S/7S比值為1.12[19]。劉香英等利用聚丙烯酰胺凝膠分析黑吉遼內(nèi)蒙古四省163個大豆品種，發(fā)現(xiàn)11S/7S比值為1.3～3.32，平均值為1.97[20]。劉順湖等鑒定我國138份野生豆、409份地方品種以及國內(nèi)148份育成品種發(fā)現(xiàn)，11S/7S比值平均分別為1.4、2.0和2.7[21]。姜振峰等采用線性梯度SDS-PAGE法鑒定442份黑龍江省內(nèi)大豆資源，結(jié)果表明11S/7S比值為0.93～2.77，平均值為1.7[22]。

關于大豆蛋白QTL定位研究較多，CSSL可用作QTL分析重要材料，因其在基因組中僅包含較少供體親本片段，且遺傳背景高度一致。鑒于這種材料的優(yōu)越性，近年來已在水稻[23]、玉米[24]、大豆等農(nóng)作物中廣泛使用。野生和半野生資源包含稀有基因，具有抗逆性、抗病性和抗蟲性。本研究以野生大豆ZYD00006為供體親本，以栽培大豆SN14為輪回親本構建CSSL群體。經(jīng)多代回交后代，后代CSSL個體僅包含較少導入野生資源。大多數(shù)遺傳背景恢復到SN14。野生資源特有優(yōu)良基因被保留在個體中，不良特性被去除。通常，CSSL種群可作為創(chuàng)新資源直接或間接用于育種研究。將擬南芥同源基因功能信息（https://www.arabidopsis.org）與基因注釋信息相結(jié)合，共同分析并篩選與11S/7S球蛋白比值性狀相關候選基因。通過qRT-PCR分析，Glyma.09G015100可能是影響大豆11S/7S球蛋白比值的功能基因。Glyma.09G015100屬于磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白（sec14p）家族[24]，該家族主要定位在高爾基體中，高爾基體是蛋白質(zhì)主要合成加工運輸場所，參與來自高爾基體中各復合產(chǎn)物蛋白運輸，可能影響大豆球蛋白中各亞基形成，進而影響7S/11S球蛋白比值，故將Glyma.09G015100作為影響大豆11S/7S球蛋白比值候選基因。本研究將為大豆11S/7S球蛋白比值分子標記輔助育種及相關基因克隆提供理論指導。