滕衛(wèi)麗，李 悅，鄭立娜，郭志文，付 雪，王 博，董瑩瑩，韓英鵬，李文濱

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所，大豆生物學(xué)教育部重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150030）

硬實是因種皮結(jié)構(gòu)致密、抗?jié)B能力強、吸脹能力差而產(chǎn)生的保護機制，使種子處于休眠狀態(tài)并保持活力[1]，這種現(xiàn)象普遍存在豆科作物中。大豆在運輸和存儲過程中，種子硬實性有利于提高抵抗力，防止種子腐敗和病原體入侵[2-3]。種子硬實與種皮中鈣質(zhì)含量相關(guān)[4]，可為大豆食品提供附加營養(yǎng)價值。但硬實性導(dǎo)致大豆發(fā)芽率低，延后出苗，不利于田間管理，嚴重影響大豆產(chǎn)量，不便于食品加工[5-6]。種皮滲透性是豆科作物馴化過程關(guān)鍵特性之一，硬實性嚴重阻礙大豆育種進程[7]。因此探究大豆硬實性遺傳機制，挖掘硬實性相關(guān)QTL位點，對大豆種質(zhì)資源利用和品種改良具有重要意義。

在形態(tài)學(xué)上，種子硬實性主要與種皮滲透性有關(guān)[8]。由角質(zhì)層、柵欄層、皮下層等組成的復(fù)合多層種皮[9]是阻礙種子吸水關(guān)鍵因素，其中含有蠟質(zhì)、纖維素、果膠質(zhì)[10]及酚類化合物[11]，增強種皮抗?jié)B能力。種臍是大豆種子吸水主要部位，具有控制水分進出的結(jié)構(gòu)特性，結(jié)構(gòu)關(guān)閉時有效阻隔外界水分，造成種子硬實[12]。在遺傳學(xué)上，大豆硬實性受多基因調(diào)控[1]。早期研究中，Keim等在第2、3、6、8、19號染色體上獲得與大豆硬實性相關(guān)RFLP標記[13]。Liu等選擇以野生大豆品種為父本構(gòu)建RIL群體分析大豆硬實性QTL，在第2號染色體上獲得2個加性QTL，位于Satt459附近，貢獻率大于40%[14]。艾麗娟等研究獲得3個與大豆硬實性相關(guān)加性QTL位點，分別位于第2、6、14號染色體，其中第6號染色體上qHS-6-1位于標記區(qū)間Sat-402-Satt460之間[15]，與陳靜靜等檢測到野生大豆硬實QTL區(qū)間Sat-402-Satt557部分重疊[16]。Kebede等發(fā)現(xiàn)種皮抗?jié)B性為優(yōu)勢性狀，受一個單基因控制，定位于第2號染色體Sat-202-Satt459標記之間[17]。Ramakrishn等在第4、8、9、11、18、20號染色體獲得與種子滲透性相關(guān)基因組變異位點[18]。Sun等表示Glyma02g43700.1在編碼鈣調(diào)磷酸酶跨膜蛋白過程中，存在微效基因參與調(diào)控種皮滲透性[19]。由此可知，大豆硬實性遺傳機制較為復(fù)雜。目前，大豆硬實性相關(guān)QTL間上位性互作逐漸受到重視，但相關(guān)報道較少，因此探究QTL間上位性互作關(guān)系及效應(yīng)估值對明確大豆硬實性遺傳機制具有重要意義。

本研究利用東農(nóng)46與L-100構(gòu)建RIL群體分析硬實性相關(guān)性狀QTL定位及上位性互作，挖掘QTL新位點，為大豆分子輔助育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所選育東農(nóng)46和日本引進種質(zhì)L-100雜交衍生的包含127個家系重組自交系群體。將該群體F2:9（2017年）和F2:11（2019年）播種于向陽，F(xiàn)2:10（2018年）年分別播種于向陽（XDL）、呼蘭（HDL）和阿城（ADL）。田間采用隨機區(qū)組設(shè)計，壟長2 m，壟寬65 cm，株距6 cm，3次重復(fù)。籽粒完全成熟后收獲，手剝脫粒，避免機械損傷。

1.2 方法

1.2.1 大豆硬實率測定及種子類型劃分

從親本東農(nóng)46和L-100中隨機選取20粒表面光滑飽滿無病斑種子，置于培養(yǎng)皿中并加入20 mL蒸餾水，3次重復(fù)，室溫下浸泡處理24 h，每隔2 h統(tǒng)計硬實種子數(shù)（種子體積未變化且無皺縮現(xiàn)象記為硬實），計算硬實率，觀察親本硬實率變化趨勢，確定群體硬實率調(diào)查時間。采用與親本相同浸種法，分別在3、6、12和24 h時，測定RIL群體127個家系硬實率，并劃分RIL群體硬實性。

硬實率（%）=未吸脹種子/供試種子數(shù)×100%。硬實型：硬實率≥80%；中間型：20%＜硬實率＜80%；吸脹型：硬實率≤20%[19]。

1.2.2 大豆種子吸水量測定

采用與測定硬實率相同浸種法，在浸泡處理3、6、12和24 h時，將培養(yǎng)皿中蒸餾水倒出，吸水紙將種子表面水珠擦干，萬分之一天秤稱量種子重量，稱量完成后將種子放回培養(yǎng)皿中，加入20 mL蒸餾水繼續(xù)浸泡。計算4個時間點種子吸水量。

吸水量（g）=吸水時間段后種子質(zhì)量（g）-吸水時間前種子質(zhì)量（g）[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2016處理數(shù)據(jù)，SPSS 25.0軟件包統(tǒng)計分析2017～2019年大豆硬實率和種子吸水量。

1.4 QTL定位

本研究所用遺傳連鎖圖譜由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所大豆分子設(shè)計及全基因組編輯實驗室利用全基因組重測序技術(shù)構(gòu)建完成，圖譜總長3 672.52 cM，共4 004個標記，分布于20條染色體，每條染色體上含有124～295個標記，各染色體圖距126.29～286.25 cM[21]。利用QTL IciMapping 4.1軟件中完備區(qū)間作圖法（ICIM）作硬實性相關(guān)性狀加性及上位性QTL定位分析，LOD閾值分別為2.5和4.0。采用McCouch等命名方式[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆種子硬實性相關(guān)性狀表型數(shù)據(jù)分析

由圖1可知，在浸種處理24 h內(nèi)，隨時間增加，親本東農(nóng)46種子表皮皺縮，體積明顯增大，硬實率逐漸下降，且浸種2 h時硬實率為0，6 h時種子均達到完全吸脹狀態(tài)；而L-100硬實率在浸種處理24 h內(nèi)無明顯變化，16 h時出現(xiàn)少數(shù)完全吸脹種子。根據(jù)親本表型差異，確定劃分群體硬實性調(diào)查時間為6 h。由圖2可知，RIL群體種子以6 h時硬實率為標準可分為3種類型，不同類型間數(shù)量差異明顯，吸脹型＞中間型＞硬實型。

圖1 親本硬實率變化情況Fig.1 Change of parent hard seededness rate

圖2 RIL群體浸種6 h種子類型分布情況Fig.2 Distribution of seed types in RIL populations at 6 h

2017～2019年5個環(huán)境下親本及RIL群體表型分析結(jié)果如表1～2所示，在4個浸種時間條件下，東農(nóng)46硬實率為0，種子吸水量為2.26～6.71 g，L-100硬實率為83.33%～100%，種子吸水量為0～0.77 g，兩個性狀在親本間均存在顯著差異，為QTL定位分析奠定基礎(chǔ)。

在三年五點條件下，RIL群體硬實率平均值隨時間逐漸減小，種子吸水量平均值隨時間逐漸加大。浸種12 h時，硬實率平均值減量達最大，種子吸水量平均值增量達最大。由此可知，浸種0～12 h，群體種子處于急速吸水階段；浸種12～24 h，群體種子處于緩慢吸水階段。4個浸種時間段，群體硬實率為0～100%，變異系數(shù)為33.29%～83.13%，該性狀在群體中分離程度較大，存在超親分離，結(jié)合圖3可知，群體硬實率表型值呈連續(xù)性變異，多環(huán)境下變化趨勢相同，群體硬實率主要分布在0～10%；群體種子吸水量為0～6.71 g，變異系數(shù)為31.48%～61.53%，偏度絕對值均＜1，除個別數(shù)值外，浸種3 h條件下表現(xiàn)為正值右偏分布，且峰度絕對值＜1，浸種6、12和24 h條件下表現(xiàn)為負值左偏分布，峰度值為-0.43～3.03。結(jié)合圖4可知，群體種子吸水量均呈近似正態(tài)連續(xù)性變異，且頻率分布在5個環(huán)境下具有一致性，浸種3和6 h時，群體種子吸水量主要分布范圍分別為1.0～1.5、2.0～2.5 g，浸種12和24 h時，主要分布范圍為2.5～3.0 g，表明浸種12 h時群體中大部分種子達到完全吸脹狀態(tài)。

如表3所示，分析多環(huán)境不同時間段群體硬實率和種子吸水量相關(guān)性。結(jié)果表明，在種子吸水過程中，硬實率與種子吸水量呈極顯著負相關(guān)，硬實率越高，種子吸水量越低。

2.2 大豆硬實性QTL定位

利用完備區(qū)間作圖法，對5個環(huán)境，浸種不同時間大豆硬實率和種子吸水量性狀作QTL定位和加性效應(yīng)分析，如表4所示。

表1 親本及RIL群體硬實率表型分析Table 1 Phenotypic analysis of hard seededness rate of soybean parents and RIL populations

表2 親本及RIL群體種子吸水量表型分析Table 2 Phenotypic analysis of seed water absorption of soybean parents and RIL population

續(xù)表2

圖3 RIL群體硬實率頻率分布直方圖Fig.3 Histogram of hard seededness rate frequency distribution of soybean RIL population

圖4 RIL群體種子吸水量頻率分布直方圖Fig.4 Histogram of seed water absorption frequency distribution of soybean RIL population

表3 RIL群體表型間相關(guān)性分析Table 3 Analysis of correlation between different phenotypes of RIL populations

表4 大豆硬實率QTL分析Table 4 QTL mapping analysis of hard seededness rate in soybean

由表4可知，大豆硬實率性狀共檢測到35個QTL位點，主要分布于第2、4、6、13、16、17、20號染色體。其中有6個QTL位點在不同時間段和環(huán)境下多次重復(fù)檢測，分布于第2、4、13、16、17染色體。在2號染色體上定位到兩個鄰近QTL，qHS-2-1重復(fù)檢測9次，貢獻率為5.93%～32.28%，標記區(qū)間Block534～Block535；qHS-2-2重復(fù)檢測7次，貢獻率為18.70%～47.31%，標記區(qū)間Block535～Block536。在4號染色體上定位到兩個鄰近QTL，qHS-4-1重復(fù)檢測6次，貢獻率為10.20%～14.13%；qHS-4-2緊鄰qHS-4-1，貢獻率9.66%。在13號染色體上，qHS-13-1重復(fù)檢測4次，貢獻率為6.37%～12.81%。在16號染色體上，qHS-16-1重復(fù)檢測3次，貢獻率為5.29%～16.77%。在17號染色體上，qHS-17-1重復(fù)檢測3次，貢獻率為8.71%～10.27%。在6號和20號染色體上，分別各檢測到1個QTL位點，qHS-6-1貢獻率為16.07%，qHS-20-1貢獻率為10.12%，均大于10%。加性效應(yīng)為-0.15～0.28，其中25個QTL加性效應(yīng)為正值，增效等位基因來源于L-100，與其具有較高硬實率一致，分布于第2、6、13、16、20號染色體，10個QTL加性效應(yīng)為負值，增效等位基因來源于東農(nóng)46，分布于第4、17號染色體，重復(fù)QTL位點加性效應(yīng)具有一致性。

大豆種子吸水量QTL分析如表5所示。

表5 大豆種子吸水量QTL分析Table 5 QTL mapping analysis of seed water absorption in soybean seed

大豆種子吸水量性狀共檢測到42個QTL位點，主要分布于第2、3、4、6、12、13、16、17、18號染色體。其中有6個QTL位點在不同時間段和環(huán)境下多次重復(fù)檢測，分布于第2、3、16、17、18號染色體。在2號染色體上定位到兩個鄰近QTL，qWAS-2-1和qWAS-2-2分別重復(fù)檢測2次和17次，貢獻率分別為16.22%～20.32%、14.04%～41.88%。在3號染色體上，qWAS-3-1重復(fù)檢測2次，貢獻率為7.05%～8.42%。在16號染色體上，qWAS-16-1重復(fù)檢測3次，貢獻率為9.27%～11.77%。在17號染色體上，qWAS-17-1檢測4次，貢獻率為6.37%～11.71%。在18號染色體上，qWAS-18-1重復(fù)檢測4次，貢獻率為10.01%～14.47%。在4號染色體上檢測到3個QTL，2018年阿城3 h時定位出qWAS-4-3貢獻率最高，為24.16%。在6號染色體上檢測到3個QTL，2018年阿城12 h時定位出qWAS-6-2貢獻率最高，為11.87%。在12號染色體上檢測到1個QTL，貢獻率為21.58%。在13號染色體上檢測到4個QTL，2018年向陽24 h時定位出qWAS-13-4貢獻率最高，為11.13%。加性效應(yīng)為-0.89～0.41，其中8個QTL加性效應(yīng)為正值，增效等位基因來源于L-100，分布于第4、6、13、17號染色體，34個QTL加性效應(yīng)為負值，增效等位基因來源于東農(nóng)46，與其具有較高種子吸水量一致，分布于第2、3、4、6、12、13、16、18號染色體，重復(fù)QTL位點加性效應(yīng)具有一致性。

2.3 大豆硬實性QTL上位性效應(yīng)分析

利用完備區(qū)間作圖法作上位性QTL定位分析，對不同浸種時間硬實率和種子吸水量性狀作QTL定位，分析QTL上位性互作對大豆硬實性影響，如表6所示。

表6 大豆硬實率上位性效應(yīng)分析Table 6 Epistatic effect analyze of QTLs for hard seededness rate in soybean

由表6可知，在三年五點環(huán)境下，不同時間段共檢測到27對硬實率上位性互作QTL。其中2號染色體上qHS-2-4與4號染色體上qHS-4-4、6號染色體上qHS-6-2、16號染色體上qHS-16-1發(fā)生上位性互作，且重復(fù)檢測，貢獻率為1.74%～6.61%；2號染色體上qHS-2-5與6號染色體上qHS-6-2、13號染色體上qHS-13-2、16號染色體上qHS-16-1發(fā)生上位性互作，貢獻率為1.35%～6.06%；4號染色體上qHS-4-3、6號染色體上qHS-6-2和qHS-6-3、17號染色體上qHS-17-2與16號染色體上qHS-16-1發(fā)生上位性互作，貢獻率為1.01%～2.72%。上述22對上位效應(yīng)值均為正值，表現(xiàn)為親本型大于重組型。2號染色體上qHS-2-3、qHS-2-4、qHS-2-5與17號染色體上qHS-17-2發(fā)生上位性互作，貢獻率為1.58%～6.88%；3號染色上qHS-3-1與16號染色體上qHS-16-2發(fā)生上位性互作，貢獻率為1.88%，上位效應(yīng)值均為負值，表現(xiàn)為重組型大于親本型。QTL位點qHS-2-4和qHS-16-1參與上位性互作次數(shù)較多，分別為14和12次，且qHS-2-4與qHS-2-1和qHS-2-2位點相鄰。

如表7所示，在三年五點環(huán)境下，不同時間段共檢測到24對種子吸水量上位性互作QTL，其中在浸種3 h時檢測到2對，6 h時檢測到7對，12 h時檢測到5對，24 h時檢測到11對，貢獻率為2.42%～8.40%。共有6對上位效應(yīng)值為正值，表現(xiàn)為親本型大于重組型。18對上位效應(yīng)值為負值，表現(xiàn)為重組型大于親本型，其中7號染色體上qWAS-7-2與20號染色體上qWAS-20-7發(fā)生上位性互作，重復(fù)檢測2次，貢獻率為4.16%和8.40%。13號染色體上qWAS-13-5和19號染色體上qWAS-19-1發(fā)生上位性互作，重復(fù)檢測2次，貢獻率為2.63%和4.35%。

表7 大豆種子吸水量上位性效應(yīng)分析Table 7 Epistatic effect analyze of QTLs for seed water absorption in soybean seed

3 討 論

前人多選用硬實率（或吸脹率）性狀作大豆硬實性QTL分析，本研究調(diào)查不同浸種時間硬實率和種子吸水量，兩個性狀間具有極顯著相關(guān)性。根據(jù)三年五點環(huán)境下表型數(shù)據(jù)分析大豆硬實率和種子吸水量QTL定位和加性效應(yīng)，探究大豆硬實性分子遺傳機制，共檢測到26個與大豆硬實性相關(guān)加性QTL，主要分布于第2、3、4、6、12、13、16、17、18、20號染色體。

Kebede等在標準發(fā)芽條件下調(diào)查種皮不透水率，劃分群體種皮類型，并在第2號染色體上獲得與種皮滲透性相關(guān)QTL，位于Sat_202-Satt459之間[17]，Liu等檢測到與大豆硬實相關(guān)QTL位點在Satt459附近[14]，二者結(jié)果一致。艾麗娟等[15]、陳靜靜等[16]分別以硬實率、吸脹率為表型性狀，通過分子標記技術(shù)獲得與大豆硬實性相關(guān)QTL位點，均在第2號和第6號染色體上檢測到QTL位點，且標記區(qū)間鄰近。本研究分別以硬實率和種子吸水量為表型性狀，以時間為單位細化表型變化，分析大豆硬實性QTL定位，在第2號染色體上多次重復(fù)獲得4個與大豆硬實性相關(guān)加性QTL，qHS-2-1和qWAS-2-1、qHS-2-2和qWAS-2-2標記區(qū)間重疊，在Block534～Block535、Block535～Block535之間，貢獻率平均值＞20%，在第6號染色體上獲得4個大豆硬實性加性QTL，其中qHS-6-1貢獻率為16.07%，定位在Block1822～Block1824之間。

Sun等研究發(fā)現(xiàn)GmHs1-1基因編碼鈣調(diào)磷酸酶跨膜蛋白，導(dǎo)致大豆種皮中鈣質(zhì)含量增多，種皮透水性差，出現(xiàn)硬實現(xiàn)象[19]。Jang等通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗證Glyma02g43680可促進柵欄細胞外層1,4-β-葡聚糖積累，改變種臍結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致種子吸水能力差，出現(xiàn)硬實現(xiàn)象[23]。由此可知，控制大豆硬實性基因較為復(fù)雜，并非單一基因調(diào)控。

Ramakrishn等通過對G.max和G.soja作全基因組重測序，發(fā)現(xiàn)與種皮滲透性相關(guān)基因組變異（SNPs和InDels），主要分布在4、8、9、11、18、20染色體[18]。本研究中，在第4號染色上獲得5個大豆硬實性加性QTL，其中qHS-4-2和qWAS-4-1標記區(qū)間重疊，第18號染色體上qHS-18-1 QTL位點重復(fù)檢測3次，且貢獻率均大于10%，第20號染色體上獲得qHS-20-1 QTL位點，貢獻率為10.12%。此結(jié)果與Ramakrishn等發(fā)現(xiàn)與種皮滲透性相關(guān)基因突變位點所在染色體一致[18]，增加3條染色體上大豆硬實性QTL新位點可信度。在多環(huán)境下不同浸種時間段，16、17號染色體上重復(fù)獲得4個大豆硬實性加性QTL，尚未見報道，4個新位點在大豆硬實性遺傳研究方面具有重要價值。

目前關(guān)于大豆硬實性上位性互作效應(yīng)研究較少。艾麗娟等檢測到4對與種子硬實相關(guān)QTL間的上位性互作效應(yīng)，其中第6號染色體上主效QTL與第2號染色體上的主效QTL及第9、12號染色體上次效QTL間發(fā)生上位性互作效應(yīng)，反映QTL所在基因位點間正向誘導(dǎo)表達或負向反饋抑制調(diào)控[15]。本研究獲得51對加性×加性上位性互作QTLs，分布于第2、3、4、6、7、8、9、10、13、16、17、18、19、20號染色體，可解釋表型變異率為1.01%～8.40%。其中qHS-2-4、qHS-4-4、qHS-6-2和qHS-16-1多次出現(xiàn)在QTL上位效應(yīng)互作對中，說明大豆硬實性復(fù)雜基因網(wǎng)中，QTL之間加性×加性上位性互作也發(fā)揮重要作用，為進一步探究大豆硬實性遺傳機制提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

a.大豆硬實率與種子吸水量兩個性狀呈極顯著負相關(guān)。

b.第2號染色體上多次重復(fù)定位得到4個與大豆硬實性相關(guān)QTL位點，其中qHS-2-1與qWAS-2-1定位區(qū)間重疊，貢獻率分別為5.93%～32.28%和16.22%～20.32%；qHS-2-2與qWAS-2-2定位區(qū)間重疊，貢獻率分別為18.70%～47.31%和14.04%～41.88%；且在4個時間段均被檢測到，說明以上4個大豆硬實性QTL新位點可信度更高。

c.共檢測到51對上位性互作QTL，可解釋表型變異率為1.01%～8.40%，多次重復(fù)檢測到3個QTL互作對，分別為qHS-2-4和qHS-4-4、qHS-2-4和qHS-6-2、qHS-2-4和qHS-16-1。