金冉陽，楊永健

舒尼替尼是一種新型的腫瘤靶向治療藥物，自上市以來明顯延長轉(zhuǎn)移性腎透明細胞癌等多種惡性腫瘤患者的生存期[1-2]。但舒尼替尼治療過程中出現(xiàn)的腎損傷不僅會導(dǎo)致癌癥治療失敗，還會嚴(yán)重危及患者的健康和生命。目前，除了減少劑量或停止用藥外，尚無更好的干預(yù)措施[3]。研究顯示，舒尼替尼誘導(dǎo)的腎損傷主要與其本身的毒性作用以及其引起的腎臟炎癥密切相關(guān)[4]。而白黎蘆醇是一種主要存在于葡萄和紅酒中的天然多酚化合物，具有強大的抗炎作用，常被作為多種炎性疾病輔助療法的候選藥物[5]。體內(nèi)外多項研究表明，白黎蘆醇可以抑制核因子κB（NF-κB）等促炎因子的表達，減輕腎臟炎癥，對糖尿病腎病、順鉑引起的腎毒性等多種原因引起的腎損傷產(chǎn)生明顯的保護作用[6]。近幾十年累積證據(jù)表明，具有化學(xué)預(yù)防作用的飲食植物化學(xué)物質(zhì)也是有效的表觀遺傳調(diào)節(jié)劑。研究顯示，白黎蘆醇對體內(nèi)多種組蛋白乙?；图谆揎椌哂袕姶蟮恼{(diào)控作用[5]。近年來有關(guān)組蛋白修飾在炎癥中的作用逐漸引起了重視。其中，組蛋白甲基化修飾組蛋白第三亞基四號賴氨酸的三甲基化（H3K4me3）更是炎癥因子轉(zhuǎn)錄過程中重要的調(diào)控因素，它通過激活NF-κB 等多種促炎因子的轉(zhuǎn)錄影響體內(nèi)多種炎癥反應(yīng)[7]。就此推測，白黎蘆醇可能通過調(diào)控H3K4me3 抑制腎臟炎癥緩解舒尼替尼誘導(dǎo)的腎損傷。本研究擬探究白黎蘆醇對舒尼替尼誘導(dǎo)的腎損傷的保護作用及其與表觀遺傳學(xué)相關(guān)的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

舒尼替尼購于中國MedChemExpress（MCE）公司。白黎蘆醇購于中國麥克林公司。NF-κB、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）兔源性抗體購于美國Santa Cruz 公司。H3K4me3 兔源性抗體購于英國Abcam 公司。組蛋白H3，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）兔源性抗體購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。山羊抗兔I R Dye800 CW 二抗購于美國LI-CO R生物科技公司。肌酐、尿素氮生化檢測試劑盒購于南京建成生物科技公司。RIPA 裂解液、蛋白質(zhì)BCA 法定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。蘇木素伊紅（HE）購于美國Sigma 公司。戊巴比妥鈉、磷酸緩沖鹽溶液、多聚甲醛等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 模型分組及建立

清潔級8 周WKY 大鼠30 只，雄性，體質(zhì)量180～250 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。采用隨機數(shù)字法將WKY 大鼠分為三組：對照組（n=10），舒尼替尼組（n=10），舒尼替尼+白藜蘆醇組（n=10）。采用文獻[8]方法構(gòu)建舒尼替尼腎損傷大鼠模型，具體給藥方案見表1。

1.3 血壓測定

采用大鼠鼠尾無創(chuàng)測壓儀測量大鼠尾動脈血壓。動物清醒狀態(tài)下置于35 ℃保溫毯預(yù)熱10 min，放入固定裝置，使其處于安靜環(huán)境中測量血壓。每隔3 min 測1 次，連測5 次，取平均值。每3 d 檢測一次，記錄舒尼替尼處理后大鼠血壓變化。

表1 各組大鼠具體給藥方案

1.4 腎功能指標(biāo)檢查

按文獻[8]，予以舒尼替尼喂養(yǎng)28 d 后，鼠尾靜脈取血。應(yīng)用肌酐、尿素氮生化試劑盒，參照說明書加入相應(yīng)反應(yīng)體系，全波長酶標(biāo)儀檢測各組吸光度光密度（OD）值，計算血清尿素氮、肌酐水平。

1.5 腎組織學(xué)檢查

按文獻[8]，予以舒尼替尼喂養(yǎng)28 d 后，取大鼠腎臟進行制作石蠟切片，HE 染色觀察腎臟病理結(jié)構(gòu)改變。將腎組織脫水、透明、包埋，制作成4 μm 的切片，切片烘干行HE 染色，封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織形態(tài)的變化。

1.6 腎組織腎小管病理損傷評分（paller 評分）

每張切片在400 倍光鏡下隨機選取10 個視野進行觀察，每個視野隨機選取10 個腎小管，按100個腎小管記分。paller 評分標(biāo)準(zhǔn)：腎小管明顯擴張，細胞扁平計1 分；刷狀緣損傷計1 分，脫落計2 分；細胞質(zhì)空泡計1 分；間質(zhì)水腫計1 分；腎小管腔內(nèi)有脫落的壞死細胞，未形成管型或碎片計1 分，形成管型或碎片計2 分。

1.7 免疫印跡法檢測H3K4me3、NF-κB、TNF-α、MCP-1 蛋白水平

提取腎組織總蛋白，二喹啉甲酸法（BCA 法）測定蛋白質(zhì)濃度[9]。將變性好的蛋白進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，H3K4me3、NF-κB、TNF-α、MCP-1 受體抗體（1 ∶400）4 ℃孵育過夜，TBST 緩沖液（1×TBS 含0.1%的吐溫-20）洗滌3 次，羊抗兔IgG（1：5 000）室溫孵1 h，TBST 洗 滌，掃 膜 顯 色，Quantity One（1-D Analysis Software Version4.4，Bio-Bad inc，美國）軟件分析計算H3K4me3、NF-κB、TNF-α、MCP-1 灰度比值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組獨立樣本間的比較用t檢驗，三組及三組以上樣本的比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 法。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠尾動脈血壓測量結(jié)果（圖1）

大鼠鼠尾測壓結(jié)果顯示，舒尼替尼處理6 d后，舒尼替尼組大鼠血壓較對照組明顯升高[（121.53±2.31）mmHg vs.（113.3±2.45）mmHg，1 mmHg=0.133 kPa，P＜0.05];9 d后，舒尼替尼+白藜蘆醇組血壓與舒尼替尼組相比明顯降低[（126.3±1.75）mmHg vs.（133.5±2.12）mmHg，P＜0.05]。提示白黎蘆醇降低舒尼替尼誘導(dǎo)的高血壓。

圖1 各組大鼠尾動脈血壓測量結(jié)果（各組n=10）

2.2 各組大鼠血清肌酐和尿素氮水平的變化（圖2）

與對照組相比，舒尼替尼組大鼠血清肌酐和尿素氮水平均明顯升高[（0.59±0.04）mg/dl vs.（0.47±0.05）mg/dl；（21.10±0.47）mg/dl vs.（17.34±0.59）mg/dl，P均＜0.05]；而 舒 尼 替尼+白藜蘆醇組大鼠血清肌酐和尿素氮水平均較舒尼替尼組大鼠明顯降低[（0.50±0.03）mg/dl vs.（0.59±0.04）；（18.21±0.51）mg/dl vs.（21.10±0.47）mg/dl，P均＜0.05]。提示白黎蘆醇緩解舒尼替尼導(dǎo)致的腎功能損傷。

圖2 各組大鼠血清肌酐和尿素氮水平的變化（各組n=10）

2.3 各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)變化（圖3、表2）

光鏡下觀察腎組織病理結(jié)構(gòu)，舒尼替尼組大鼠腎小管結(jié)構(gòu)破壞，局部近曲小管上皮細胞腫脹、固縮死亡和炎性細胞浸潤。舒尼替尼+白黎蘆醇組大鼠腎結(jié)構(gòu)損傷及炎性浸潤均明顯減輕。腎小管paller 評分結(jié)果與光鏡下一致，舒尼替尼組paller 評分較對照組高[（39.12±1.91）分vs.（10.92±0.86）分，P＜0.05]，舒尼替尼+白藜蘆醇組paller 評分較舒尼替尼組低[（23.40±1.38）分 vs.（39.12±1.61）分，P＜0.05]。提示白黎蘆醇可以減輕舒尼替尼導(dǎo)致的腎損傷以及炎癥浸潤。

圖3 光鏡下觀察各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)變化（各組n=10）

表2 各組大鼠paller 評分的變化（n=10）

2.4 各組大鼠腎臟NF-κB，TNF-α，MCP-1 蛋白表達的變化（圖4）

圖4 免疫印跡實驗檢測各組大鼠腎臟 NF-κB、TNF-α、MCP-1 表達的變化（n=10）

舒尼替尼組大鼠腎臟NF-κB、TNF-α、MCP-1 蛋白表達水平均較對照組明顯升高（1.09±0.19 vs.0.49±0.05；0.92±0.02 vs.0.32±0.01；0.85±0.06 vs.0.47±0.04，P均＜0.05）；與舒尼替尼組相比，舒尼替尼+白藜蘆醇 組 大 鼠 腎 臟NF-κB、TNF-α、MCP-1 蛋 白表達水平均明顯降低（0.81±0.11 vs.1.09±0.19；0.4 2±0.0 4 v s.0.9 2±0.0 2；0.6 3±0.0 3 v s.0.85±0.06，P均＜0.05）。提示白黎蘆醇減輕了舒尼替尼誘導(dǎo)的腎臟炎癥。

2.5 各組大鼠腎臟 H3K4me3 表達的變化（圖5）

與對照組相比，舒尼替尼組大鼠腎臟H3K4me3水平明顯升高（1.04±0.10 vs.0.55±0.04，P＜0.05）；舒尼替尼+白藜蘆醇組大鼠腎臟H3K4me3 水平較舒尼替尼組顯著降低（0.70±0.04 vs.1.04±0.10，P＜0.05）。提示白黎蘆醇預(yù)處理，可以抑制舒尼替尼損傷大鼠腎臟H3K4me3，減輕腎臟炎癥，緩解腎損傷。

圖5 免疫印跡實驗檢測各組大鼠腎臟 H3K4me3 表達的變化（各組n=10）

3 討論

為了探究白黎蘆醇是否對舒尼替尼誘導(dǎo)的腎損傷具有保護作用，我們參照文獻[8]中相關(guān)指標(biāo)，檢測了舒尼替尼處理后大鼠血清肌酐和血尿素氮水平以及腎臟病理結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果顯示，大鼠血清肌酐和尿素氮水平明顯升高，腎臟腎小管結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，局部近曲小管上皮細胞腫脹、固縮死亡，炎性細胞浸潤，與文獻結(jié)果一致。而白黎蘆醇干預(yù)后，大鼠血清肌酐和尿素氮水平較舒尼替尼組明顯下降，腎小管結(jié)構(gòu)破壞，局部近曲小管上皮細胞腫脹、固縮死亡，炎性細胞浸潤明顯減輕。這表明白黎蘆醇對舒尼替尼誘導(dǎo)的腎損傷具有明顯的保護作用。NF-κB，TNF-α，MCP-1 是炎癥損傷的標(biāo)志性蛋白[10]。本研究表明，與舒尼替尼組相比，舒尼替尼+白藜蘆醇組大鼠腎臟NF-κB，TNF-α，MCP-1 等促炎因子的表達降低，提示白黎蘆醇通過減輕腎臟炎癥緩解舒尼替尼誘導(dǎo)的腎損傷。腎臟是維持水鈉平衡的主要器管[11]，腎臟損傷是高血壓發(fā)生發(fā)展的重要原因，腎臟炎癥會導(dǎo)致壓力尿鈉變鈍從而促進高血壓發(fā)展[12]。實驗過程發(fā)現(xiàn)舒尼替尼干預(yù)后大鼠血壓明顯上升，與文獻結(jié)果一致；而白黎蘆醇干預(yù)后，大鼠血壓明顯下降，這可能與其減輕腎臟炎癥緩解腎臟損傷有關(guān)。

H3K4me3 是真核生物中活性基因轉(zhuǎn)錄起始位點的普遍的組蛋白修飾，在炎癥轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮著重要作用[7，13]。既往研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB，TNF-α，MCP-1 等促炎基因的啟動子區(qū)域的H3K4me3 積累對其轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要[14-15]。白藜蘆醇是一種天然的二苯乙烯結(jié)構(gòu)多酚，具有較強的抗炎和抗氧化活性，被作為多種炎性疾病的輔助療法的候選藥物[16-17]。白藜蘆醇干預(yù)可明顯減輕舒尼替尼誘導(dǎo)的腎臟炎癥細胞浸潤，抑制腎臟促炎因子NF-κB，TNF-α，MCP-1 蛋白表達。近幾十年累積證據(jù)表明，具有化學(xué)預(yù)防作用的飲食植物化學(xué)物質(zhì)也是有效的表觀遺傳調(diào)節(jié)劑。而白藜蘆醇是一種強有效的表觀遺傳修飾劑[5]，對多種組蛋白甲基化均具有較強的調(diào)控作用[18]。研究報道，在去氧皮質(zhì)酮（DOCA）鹽誘導(dǎo)的高血壓模型中，白藜蘆醇可以抑制DOCA 介導(dǎo)的主動脈組蛋白H3K27 三甲基化（H3K27me3）[5]。本研究顯示，舒尼替尼喂養(yǎng)可明顯增加大鼠腎臟H3K4me3 水平，而白藜蘆醇干預(yù)后腎臟H3K4me3水平較舒尼替尼組明顯降低。提示白黎蘆醇對舒尼替尼誘導(dǎo)的腎損傷具有良好的保護作用；且其保護作用可能與抑制H3K4me3，減輕腎臟炎癥有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)白黎蘆醇對舒尼替尼誘導(dǎo)的腎損傷具有明顯的保護作用，且其保護作用可能與抑制腎臟H3K4me3 水平減輕腎臟炎癥有關(guān)。這提示白黎蘆醇可能是一種治療舒尼替尼導(dǎo)致腎損傷的新方法。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突