彭志鋒，黃 慧，張曉戰(zhàn)，蔣增海，史洪濤，喬宏興，邊傳周

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)引起的一種急性呼吸道傳染病[1]。我國多個(gè)地區(qū)均發(fā)生和流行過PCP，每年造成養(yǎng)豬業(yè)重大損失[2-4]。近年來，APP分離率及傳染性胸膜肺炎的發(fā)病率呈上升趨勢[2,5]。同時(shí)，由于我國養(yǎng)豬業(yè)長期大量使用抗菌藥，導(dǎo)致細(xì)菌多重耐藥現(xiàn)象普遍，嚴(yán)重危害到人類健康。為此，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部194號公告規(guī)定，自2020年7月1日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料。因此，限制抗生素使用情況下如何養(yǎng)好豬成為行業(yè)熱點(diǎn)。APP細(xì)菌血清型眾多，且不同地區(qū)菌株的耐藥性差異較大，因而持續(xù)性監(jiān)測致病菌的流行及藥物敏感性，對于減少抗菌藥物的使用、為PCP防控的精準(zhǔn)用藥提供科學(xué)依據(jù)是非常必要的。為此，分離鑒定APP，并在藥敏試驗(yàn)基礎(chǔ)上對四環(huán)素耐藥基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，以豐富APP的耐藥性現(xiàn)狀，并為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)，以利于更好地控制PCP。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

從河南省信陽、商丘、安陽、洛陽、許昌五地區(qū)臨床表現(xiàn)猝死、口鼻流血色泡沫的病死豬的肺臟中分離菌株；藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株APP ATCC27090和大腸桿菌ATCC25922購自中國普通微生物菌種保存中心。

1.2 試劑

TSA、TSB購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；2×TaqMasterMix、DL2000 DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收純化試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；NAD、瓊脂糖、Ⅰ型GoldView購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；生化反應(yīng)管和藥敏片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 菌株分離

用無菌棉拭子采集豬肺臟分泌物。將棉拭子涂布于巧克力瓊脂平板上，在37 ℃下恒溫培養(yǎng)12～24 h后觀察菌落。挑取疑似菌落劃線接種到含有NAD的TSA瓊脂平板上培養(yǎng)，挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。

1.4 NAD依賴性與生化鑒定

將疑似APP菌落分別接種于不含和含有NAD的TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12～24 h，觀察液體培養(yǎng)基渾濁度；將NAD依賴性疑似菌分別接種于微量生化鑒定管中，每管加入1 μL NAD(200 g/L)，37 ℃下培養(yǎng)18～24 h，觀察生化反應(yīng)結(jié)果。

1.5 PCR鑒定

參考BOSSE等[6]設(shè)計(jì)通用型APP檢測引物APP-F：5′-TTATCCGAACTTTGGTTTAGCC-3′，APP-R：5′-CATATTTGATAAAACCATCCGTC-3′。預(yù)期擴(kuò)增條帶大小為418 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。分別用APP ATCC27090和大腸桿菌ATCC25922作為陽性對照和陰性對照。煮沸法提取分離菌株的核酸。反應(yīng)體系(25 μL)：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 1 min，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。取8 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物純化后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6 APP分離菌株藥物敏感性分析

參照CLSI2009規(guī)定的方法，采用K-B法檢測APP分離菌株對氧氟沙星(OFL)、左氧氟沙星(LEV)、氨芐青霉素(AMP)、青霉素(PEN)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢曲松(CTR)、慶大霉素(GEN)、卡那霉素(KAN)、阿米卡星(AKI)、環(huán)丙沙星(CIP)、多西環(huán)素(DOX)、四環(huán)素(TET)、磺胺甲噁唑(SMZ)、多黏菌素B(PB)和甲硝唑(MTR)15種抗菌藥物的敏感性，用質(zhì)控菌株進(jìn)行質(zhì)控。

1.7 四環(huán)素耐藥基因檢測

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，將耐四環(huán)素APP分離菌株接種于含NAD的TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒；選擇APP ATCC27090作為四環(huán)素耐藥基因陰性對照菌株。參照文獻(xiàn)[7—9]設(shè)計(jì)檢測四環(huán)素耐藥基因引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用多重PCR方法檢測tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tetK、tetL、tetM和tetO，引物和退火溫度見表1。采用50 μL反應(yīng)體系：2×TaqMaster Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 80 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。取8 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒純化后由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 PCR擴(kuò)增四環(huán)素耐藥基因引物Tab.1 PCR primers of tetracyline-resistant genes

2 結(jié)果與分析

2.1 5株APP菌株的分離鑒定

分離菌株在巧克力瓊脂平板上培養(yǎng)后呈灰白色、半透明、針尖大小、中間微微凸起、表面光滑的圓形或橢圓形菌落(圖1A)。分離菌株在含NAD的TSA瓊脂平板上的菌落呈散在的、大小不均、單個(gè)黃白色圓點(diǎn)狀。相對于巧克力瓊脂平板上的菌落，培養(yǎng)相同時(shí)間后，TSA瓊脂平板上的菌落較大(圖1B)。革蘭氏染色的分離菌株呈散在的、紅色、大小均勻的短桿菌(圖1C)，形態(tài)特征與APP相符。分離菌株在不含NAD的TSB液體培養(yǎng)基中不生長。5株分離菌株均可發(fā)酵葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖產(chǎn)酸，不發(fā)酵山梨醇，靛基質(zhì)、V-P試驗(yàn)、MR試驗(yàn)均為陰性(表2)，生化反應(yīng)結(jié)果與APP生化特性一致。

用APP通用型引物進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期相符(圖2)。培養(yǎng)試驗(yàn)、生化試驗(yàn)和PCR鑒定結(jié)果均表明成功地分離了5株APP菌株，分別命名為APP-XY、APP-SQ、APP-AY、APP-LY、APP-XC。

表2 APP分離菌株生化反應(yīng)結(jié)果Tab.2 Results of biochemical tests for isolated APP strains

2.2 5株APP分離菌株的耐藥表型

按照K-B法測定的5株APP分離菌株耐藥表型見表3。APP菌株對四環(huán)素(5/5，100%)、氨芐青霉素(3/5，60%)、青霉素G(3/5，60%)、甲硝唑(3/5，60%)耐藥；5株APP分離菌株均對氧氟沙星、左氧氟沙星、頭孢噻肟、頭孢曲松、磺胺甲噁唑、多黏菌素B敏感。

表3 APP分離菌株對不同抗菌藥的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of susceptibility test of APP strains

2.3 5株APP分離菌株的四環(huán)素耐藥基因檢測

5株APP分離菌株擴(kuò)增的目的條帶與預(yù)期的tetB和tetA擴(kuò)增長度符合(圖3)，且測序結(jié)果表明，5株APP分離菌株均含有四環(huán)素耐藥基因tetB和tetA；而5株APP分離菌株中均未檢測出四環(huán)素耐藥基因tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tetK、tetL、tetM和tetO。

3 結(jié)論與討論

APP是感染豬呼吸系統(tǒng)的主要致病菌之一，常與支原體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌混合感染，造成豬群嚴(yán)重傷亡。由于沒有明確的鑒別培養(yǎng)基，且APP對營養(yǎng)要求苛刻，其分離鑒定需要采用不同的方法依次進(jìn)行。本研究首先利用巧克力瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)出疑似菌株，選取NAD依賴性菌株進(jìn)行生化鑒定。不同地區(qū)APP菌株的生化反應(yīng)存在一定差異。本研究中，APP河南分離菌株與四川分離菌株均能發(fā)酵蔗糖產(chǎn)酸，但尿素酶反應(yīng)結(jié)果不同[10-11]，而且APP河南分離株與天津分離株蔗糖反應(yīng)結(jié)果也不同。這些生化反應(yīng)的差異反映出不同地區(qū)APP分離菌株的生物學(xué)特性不完全一致。

APP菌株四環(huán)素耐藥性普遍。我國新疆、四川、天津、河南等多個(gè)地區(qū)APP分離菌株均表現(xiàn)出較強(qiáng)的四環(huán)素耐藥性[11-14]。本研究中，APP分離菌株表現(xiàn)出的四環(huán)素耐藥性再次反映了當(dāng)前APP流行菌株對四環(huán)素普遍不敏感。為預(yù)防和治療病原菌引起的呼吸道感染，在養(yǎng)殖過程中通過飲水、飼料或肌肉注射使用了大量β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類藥物，病原菌長期接觸抗菌藥物產(chǎn)生抗藥性[15-16]。APP菌株普遍的四環(huán)素抗性與農(nóng)場長期使用四環(huán)素類藥物有密切關(guān)系。

不同地區(qū)APP菌株耐藥譜存在差異。2016年，李海利等[14]報(bào)道河南省APP分離菌株對磺胺甲噁唑和磺胺甲噁唑/甲氧芐啶均耐藥；2017年，余波等[17]報(bào)道貴州等地分離出的31株APP菌株均對磺胺二甲嘧啶鈉耐藥；2018年，王申森[18]報(bào)道APP對磺胺異噁唑的耐藥率為100%。而本研究中，5株APP分離菌株對磺胺甲噁唑、左氧氟沙星、氧氟沙星、頭孢曲松、頭孢噻肟均敏感。這一方面可能與不同地區(qū)的用藥習(xí)慣有一定關(guān)系；另一方面，不同地區(qū)流行的菌株不同，不同菌株攜帶的耐藥基因存在差異。

四環(huán)素類抗菌藥通過干擾氨?；?tRNA與細(xì)菌核糖體的結(jié)合來抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成發(fā)揮抑菌作用，而革蘭氏陰性細(xì)菌對四環(huán)素的耐藥機(jī)制之一是利用外排作用有效降低胞內(nèi)四環(huán)素濃度。2006年，BLANCO等[19]報(bào)道，四環(huán)素APP西班牙分離菌株中tetB、tetO、tetH檢測率分別為70%、17%、4%；而在耐四環(huán)素APP澳大利亞分離菌株中tetB的檢出率更高(92.5%)，僅有1株耐四環(huán)素APP檢測到tetH，其他四環(huán)素耐藥基因均未檢測到[9]。本研究中，耐四環(huán)素APP菌株全部檢測到編碼外排泵蛋白的tetB(5/5，100%)和tetA(5/5，100%)，沒有檢測到其他四環(huán)素耐藥基因，與上述報(bào)道一致。tetB和tetA的檢出提示，APP藥物敏感度下降、四環(huán)素抗性與外排泵蛋白的藥物外排作用有關(guān)[20]。四環(huán)素耐藥基因通常在可接合的質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子上，使得四環(huán)素耐藥基因可以在菌株間水平傳播[20]。加拿大和西班牙APP菌株中均曾檢測到tetH[19,21]，盡管鮮有國內(nèi)APP菌株檢出tetH的報(bào)道，加強(qiáng)其監(jiān)測對于了解四環(huán)素耐藥基因傳播仍非常有意義。綜上，APP河南分離株具有多重耐藥性，且其四環(huán)素耐藥性主要由藥物外排機(jī)制介導(dǎo)。