田 佳，李 佳，孟清波，李中勇，徐繼忠

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071000)

溫度是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要環(huán)境因子[1]。近年來，蘋果種植面積和產(chǎn)量快速增長(zhǎng)[2]，成為農(nóng)民增加收入的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)。然而，全球變暖導(dǎo)致極端高溫事件的發(fā)生頻率明顯增加[3]，我國(guó)許多地區(qū)也不斷遭遇持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的高溫天氣[4]，甚至在有些地區(qū)還頻繁出現(xiàn)超過40 ℃的短期極端高溫天氣[5]。高溫脅迫已經(jīng)成為制約果樹產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的主要逆境之一[6]。

高溫脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響已有許多相關(guān)報(bào)道，包括脅迫后癥狀的發(fā)生、內(nèi)部生理生化變化等[7-16]。蘋果屬植物性喜冷涼，耐熱性較差[17]，以往關(guān)于蘋果的高溫研究大多集中在果實(shí)、果皮及蘋果相關(guān)基因方面[18-20]，關(guān)于蘋果葉片耐熱閾值及生理生化變化的研究較少。鑒于此，以王林、富士、嘎拉3個(gè)蘋果品種的新梢為試材，通過人工模擬高溫處理，研究不同蘋果品種葉片表面熱害情況及生理生化指標(biāo)的變化，探明王林、富士、嘎拉葉片的耐熱閾值溫度和高溫脅迫下蘋果葉片的生理生化變化，以期為蘋果熱害的深入研究及熱害預(yù)防措施的制定提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料為13年生的王林、富士、嘎拉3個(gè)蘋果品種的新梢,要求長(zhǎng)勢(shì)一致、無病蟲害，每個(gè)品種的基砧為八棱海棠，中間砧為SH40。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高溫季節(jié)樹冠內(nèi)溫度監(jiān)測(cè) 2019年6月15日—8月31日，在河北省順平縣南神南村河北農(nóng)業(yè)大學(xué)蘋果試驗(yàn)基地利用溫度記錄儀(精創(chuàng)GSP-6)監(jiān)測(cè)蘋果樹冠內(nèi)溫度變化，每15 min自動(dòng)記錄1次溫度。記錄儀2個(gè)探頭分別安放在樹冠中部主枝的外側(cè)和內(nèi)膛。

1.2.2 不同蘋果品種葉片耐熱閾值溫度的確定 剪取長(zhǎng)度20 cm左右且長(zhǎng)勢(shì)一致的王林、富士、嘎拉新梢，將其形態(tài)學(xué)下端插入盛水的100 mL三角瓶中，置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行不同溫度處理，溫度設(shè)計(jì)為36、38、40、41、42、43、44 ℃，分別于處理后0、3、6、9、12 h進(jìn)行熱害率和熱害指數(shù)的調(diào)查。每溫度處理重復(fù)3次，每次重復(fù)包括3個(gè)新梢。

熱害率和熱害指數(shù)參考馬寶鵬[16]、彭勇政等[21]熱害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合蘋果枝條在高溫脅迫下的形態(tài)變化,將熱害癥狀分為5個(gè)級(jí)別：0級(jí)，枝條葉片完好無癥狀；1級(jí)，枝條個(gè)別葉片的葉尖葉緣出現(xiàn)白化或黃褐色癥狀；2級(jí)，枝條1/4葉片葉尖葉緣及周圍表皮出現(xiàn)白化或褐色焦枯癥狀；3級(jí)，枝條上1/4～1/2葉片白化或褐色焦枯卷曲；4級(jí),1/2～3/4葉片白化或焦枯卷曲；5級(jí),枝條葉片3/4以上受害或全部干枯死亡。

熱害率=(受害新梢數(shù)/處理總新梢數(shù))×100%；

熱害指數(shù)=∑(代表級(jí)值×新梢數(shù))/(最高級(jí)值×處理總新梢數(shù))×100。

1.2.3 高溫季節(jié)不同品種熱害情況調(diào)查 2019年8月初，選取王林、富士、嘎拉3個(gè)品種各20株進(jìn)行調(diào)查。在每棵蘋果樹的上、中、下部和外、中、內(nèi)部隨機(jī)均勻選取20個(gè)長(zhǎng)勢(shì)一致，無病蟲害的新梢，調(diào)查其熱害率和熱害指數(shù)。

1.2.4 高溫脅迫下蘋果葉片的生理生化變化 選擇20 cm左右且長(zhǎng)勢(shì)一致的王林、富士、嘎拉新梢，在恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行處理，溫度分別為王林41 ℃、富士43 ℃、嘎拉44 ℃，對(duì)照溫度均為27 ℃。每個(gè)溫度設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包括12個(gè)新梢。在處理后0、3、6、9、12 h取葉片樣，之后迅速用液氮冷凍，并置于-80 ℃保存。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Office 2010、Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和整理，利用DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫季節(jié)樹冠內(nèi)最高氣溫變化

由圖1可見，2019年6月15日—8月31日，試驗(yàn)地蘋果樹冠外側(cè)，日最高氣溫≥35 ℃的天數(shù)為50 d(占試驗(yàn)期間總天數(shù)的64.10%)，日最高氣溫≥37 ℃的天數(shù)為42 d(占53.85%)，日最高氣溫≥40 ℃的天數(shù)為27 d(占34.62%)；由于樹冠內(nèi)膛枝葉密度大，空氣中的熱量較為分散，以及其他環(huán)境因子(如風(fēng)速、空氣濕度等)的影響，樹冠內(nèi)膛溫度明顯低于樹冠外側(cè)溫度，樹冠內(nèi)膛日最高氣溫≥35 ℃的天數(shù)為13 d(占16.67%)；觀測(cè)時(shí)期內(nèi)最高氣溫出現(xiàn)在7月21日，高達(dá)45.1 ℃,當(dāng)日樹冠外側(cè)高溫持續(xù)時(shí)長(zhǎng)為6 h。從圖1還可看出，持續(xù)高溫時(shí)間在6月中下旬和7月居多。

2.2 不同蘋果品種葉片耐熱閾值溫度

隨著溫度的升高，不同蘋果品種葉片發(fā)生熱害的時(shí)間和程度不同(表1)。王林葉片在40 ℃以下溫度處理12 h均無受害癥狀；41 ℃處理6 h時(shí)出現(xiàn)了熱害癥狀,熱害率和熱害指數(shù)分別為 33.33% 和 6.67；隨著溫度的升高，王林葉片的熱害率和熱害指數(shù)表現(xiàn)出逐步升高的趨勢(shì)。富士和嘎拉葉片在36～42 ℃溫度處理12 h均無受害癥狀；43 ℃和44 ℃處理12 h均有熱害癥狀出現(xiàn)，不同的是，43 ℃處理下，富士葉片在9 h出現(xiàn)熱害癥狀，而嘎拉葉片在12 h出現(xiàn)熱害癥狀；43 ℃處理12 h時(shí),富士葉片的熱害率和熱害指數(shù)分別為33.33%和6.67，高于嘎拉葉片的熱害率(22.22%)和熱害指數(shù)(4.44)。根據(jù)表1中熱害出現(xiàn)的時(shí)間先后及對(duì)應(yīng)的溫度，初步確定王林、富士、嘎拉的耐熱閾值溫度分別為41、43、44 ℃。

表1 人工模擬環(huán)境下不同蘋果品種葉片的熱害率和熱害指數(shù)Tab.1 Heat injury rate and heat injury index of leaves of different apple varieties under artificial simulated environment

2.3 高溫季節(jié)不同蘋果品種熱害率和熱害指數(shù)比較

調(diào)查結(jié)果(表2)表明，王林葉片的熱害率和熱害指數(shù)最高，為53.50%和18.05；嘎拉葉片的熱害率和熱害指數(shù)最低，為5.36%和1.57；3個(gè)蘋果品種的熱害率和熱害指數(shù)均為王林顯著高于富士，富士顯著高于嘎拉。

表2 高溫季節(jié)不同蘋果品種葉片熱害率和熱害指數(shù)Tab.2 Heat injury rate and heat injury index of different apple varieties in high temperature season

2.4 高溫脅迫下蘋果葉片的生理生化響應(yīng)

2.4.1 葉片葉綠素含量 不同蘋果品種葉片葉綠素含量隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。在閾值溫度下，王林、富士、嘎拉葉片在處理0 h的葉綠素含量最高，分別為2.63、2.61、2.65 mg/g；高溫處理3 h后，3個(gè)品種蘋果葉片葉綠素含量均顯著低于對(duì)照(表3)。處理12 h時(shí)，王林、富士、嘎拉葉片的葉綠素含量最低，分別為1.96、2.06、1.87 mg/g，比對(duì)照分別下降了25.19%、21.07%、29.43%。

表3 不同高溫脅迫時(shí)間下不同蘋果品種葉片葉綠素含量 Tab.3 Chlorophyll content of leaves of different apple varieties under high temperature stress mg/g

表4 不同高溫脅迫時(shí)間下不同蘋果品種葉片超氧陰離子含量 Tab.4 Superoxide anion content of leaves of different apple varieties under high temperature stress μmol/g

3個(gè)蘋果品種葉片MDA含量隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)(表5)。在閾值溫度處理下，3 h時(shí)，富士和嘎拉葉片的MDA含量分別為15.67、17.03 μmol/g，顯著高于對(duì)照，是對(duì)照的1.10、1.03倍；王林、富士、嘎拉葉片的MDA含量均顯著高于對(duì)照，分別是對(duì)照的1.09、1.12、1.07倍。與處理0 h相比，處理12 h時(shí)，3個(gè)品種MDA含量分別增加了21.20%、26.36%、20.39%。

不同蘋果品種葉片相對(duì)電導(dǎo)率隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)均在增加(表6)。處理0 h時(shí)，王林、富士、嘎拉的葉片相對(duì)電導(dǎo)率最低，分別為15.21%、15.83%、16.44%；高溫處理后，3個(gè)品種葉片的相對(duì)電導(dǎo)率均顯著高于對(duì)照；處理12 h時(shí)，王林、富士、嘎拉的葉片相對(duì)電導(dǎo)率最高，分別為22.86%、23.77%、27.49%，是對(duì)照的1.54、1.49、1.64倍。

表5 不同高溫脅迫時(shí)間下不同蘋果品種葉片的丙二醛含量 Tab.5 Content of MDA of leaves of different apple varieties under high temperature stress μmol/g

表6 不同高溫脅迫時(shí)間下不同蘋果品種葉片的相對(duì)電導(dǎo)率 Tab.6 Relative conductivity of leaves of different apple varieties under high temperature stress %

2.4.3 葉片可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性 由表7可知，隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，3個(gè)蘋果品種葉片可溶性蛋白含量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。高溫處理6 h時(shí)，王林、富士、嘎拉葉片可溶性蛋白含量達(dá)到最大值，分別為28.41、22.52、22.25 mg/g，是對(duì)照的2.06、2.00、2.00倍。脅迫至9 h時(shí)，王林葉片可溶性蛋白含量(14.02 mg/g)與對(duì)照(13.92 mg/g)無顯著差異，富士葉片可溶性蛋白含量(16.34 mg/g)顯著高于對(duì)照(11.54 mg/g)，嘎拉葉片可溶性蛋白含量(8.48 mg/g)顯著低于對(duì)照(11.70 mg/g)。

表7 不同高溫脅迫時(shí)間下不同蘋果品種葉片的可溶性蛋白含量 Tab.7 Soluble protein content of leaves of different apple varieties under high temperature stress mg/g

隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，3個(gè)蘋果品種葉片SOD、POD活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)(表8、表9)。高溫處理6 h時(shí)，王林、富士和嘎拉葉片SOD、POD活性達(dá)到最高，SOD活性分別是對(duì)照的1.76、2.27、1.59倍，POD活性分別是對(duì)照的2.08、2.00、1.92倍。脅迫至9 h時(shí)，3個(gè)蘋果品種葉片POD活性均顯著高于對(duì)照；王林葉片SOD活性與對(duì)照無顯著差異，富士、嘎拉葉片的SOD活性分別為40.87、41.74 U/(g·min)，分別是對(duì)照的1.66、1.39倍。

表8 不同高溫脅迫時(shí)間下不同蘋果品種葉片的SOD活性Tab.8 SOD activity of leaves of different apple varieties under high temperature stress U/(g·min)

表9 不同高溫脅迫時(shí)間下不同蘋果品種葉片的POD活性 Tab.9 POD activity of leaves of different apple varieties under high temperature stress U/(g·min)

3 結(jié)論與討論

植物葉片形態(tài)特征的變化可直接反映高溫傷害程度和抗高溫脅迫能力[24]。本研究中，王林葉片在41 ℃處理6 h出現(xiàn)熱害癥狀，43 ℃處理下，富士葉片9 h出現(xiàn)熱害癥狀，而嘎拉葉片在12 h出現(xiàn)熱害癥狀，初步確定了王林、富士、嘎拉葉片耐熱閾值分別41、43、44 ℃。張建光等[25]對(duì)蘋果果實(shí)日灼閾值溫度的研究表明，紅富士果實(shí)的閾值溫度為(46.6±0.5)℃，嘎拉果實(shí)的閾值溫度為(47.5±0.5) ℃，可見不同蘋果品種的果實(shí)耐熱閾值高于其葉片的閾值溫度。本研究對(duì)3個(gè)蘋果品種葉片的田間熱害調(diào)查結(jié)果顯示，王林蘋果葉片受害最重，而嘎拉最輕，從另一側(cè)面也驗(yàn)證了不同蘋果品種葉片耐熱閾值溫度不同。

植物在受到高溫脅迫的同時(shí)，也會(huì)進(jìn)行自我保護(hù)。植物體產(chǎn)生的可溶性蛋白可以在一定程度上改善植物細(xì)胞滲透性并平衡細(xì)胞質(zhì)。但持續(xù)高溫會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性失活分解，從而使得細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白含量下降[21]。本試驗(yàn)中3個(gè)蘋果品種葉片的可溶性蛋白含量隨著高溫時(shí)間的延長(zhǎng)，表現(xiàn)出了先升高后降低的趨勢(shì)，且均在6 h時(shí)含量最高，說明在閾值溫度下,3個(gè)蘋果品種葉片在6 h時(shí)抗熱性達(dá)到了最大。同時(shí)，活性氧清除系統(tǒng)也是植物體重要的自我保護(hù)機(jī)制。高溫對(duì)POD活性有明顯的抑制作用,其活性的降低加速了高溫對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷[1]。SOD也是植物抗氧化防御系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶,可以提高植物組織的抗氧化能力。本研究中3個(gè)蘋果品種葉片的SOD、POD活性隨著高溫時(shí)間的延長(zhǎng)均出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢(shì)，且在6 h達(dá)到最大值，這與彭勇政等[21]的研究結(jié)果一致。而徐佳寧等[29]的研究顯示，不同番茄品種的葉片POD活性均隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降再上升的趨勢(shì),且大多數(shù)供試品種的POD活性在高溫脅迫12 h時(shí)達(dá)到最大值。可見,高溫脅迫下植物體內(nèi)保護(hù)酶活性可能會(huì)因溫度、物種等變化而有所不同。

綜上所述，王林、富士、嘎拉葉片的耐熱閾值溫度分別為41、43、44 ℃。隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，蘋果葉片葉綠素降解，膜脂過氧化加重，蘋果葉片抗氧化酶活性增加，蘋果葉片的生理代謝變化明顯。