柏秋月，鄧百萬，解修超，張彩妮，劉蘭蘭，袁敏謙

(陜西理工大學 生物科學與工程學院/陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723001)

天麻(GastrodiaelataBl.)屬蘭科多年生草本植物，其塊莖具有較高的藥用及保健價值，是主產(chǎn)于中國的名貴中藥材[1]。近年來，市場對天麻的需求量日益增長，天麻產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展。陜西省漢中市是我國天麻最大的適生區(qū)和主產(chǎn)區(qū)之一，天麻種植是當?shù)剞r(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)。然而，漢中地處暖溫帶和亞熱帶氣候的過渡帶，降水量大且持續(xù)時間長，導致天麻病害加重[2]。研究表明，天麻病害主要由真菌、細菌、病毒等引起[3]，植物內(nèi)微生物群落組成變化也可影響植物的健康。熊城[4]對天麻內(nèi)生真菌進行了初步分離鑒定，柳靖婷[5]對天麻內(nèi)生菌與病原菌之間的相互作用進行了分析，研究均表明，植物內(nèi)微生物群落組成發(fā)生變化可影響天麻的健康，而病原微生物是導致天麻病害發(fā)生的重要原因。迄今為止，尚未有預防和控制天麻病害發(fā)生的有效方法[6]。馮嘉云[7]對植物內(nèi)的微生物群落進行了分析，結(jié)果表明，當植物體內(nèi)的有益真菌數(shù)量減少時，植物更容易受到雜菌的侵染從而發(fā)生病害；當有益菌菌群種類和數(shù)量保持穩(wěn)定時，植物能夠健康生長，說明植物體內(nèi)真菌群落結(jié)構(gòu)的組成對植物的正常生長和健康狀態(tài)具有重要作用。因此，研究天麻內(nèi)真菌群落結(jié)構(gòu)對預防天麻病害、實現(xiàn)天麻綠色栽培十分必要。

近年來，主要依靠傳統(tǒng)的可培養(yǎng)方法對引起天麻病害的微生物進行研究，但傳統(tǒng)培養(yǎng)法受培養(yǎng)條件和營養(yǎng)供給等方面的限制[8]，存在培育的物種較少[9]等缺點，無法全面揭示病株天麻內(nèi)微生物群落組成。隨著微生物培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，高通量測序在微生物菌群研究方面表現(xiàn)出越來越突出的優(yōu)勢，其可以直接在分子層面進行測序，檢測出植物組織中難以培養(yǎng)的菌屬[10-12]，全面揭示植株內(nèi)微生物群落的組成。鑒于此，基于傳統(tǒng)培養(yǎng)法和高通量測序技術(shù)，對采集于漢中市鎮(zhèn)巴縣的紅稈健株天麻和病株天麻的塊莖進行真菌菌群結(jié)構(gòu)和多樣性研究，旨在揭示天麻病害發(fā)生的原因，為天麻病害防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

天麻樣品于2019年4月采集于陜西省鎮(zhèn)巴縣白河村(108°02′E、32°48′N，海拔1 244 m)。樣品分為2組：①無黑斑、無腐爛、表面光潔的天麻塊莖(健株,如圖1a所示，編號記為JK1、JK2、JK3)，②出現(xiàn)黑斑，腐爛的天麻塊莖(病株,如圖1b所示，箭頭指向病害部位，編號記為ZB1、ZB2、ZB3)。

1.2 傳統(tǒng)培養(yǎng)分析方法

1.2.1 天麻樣品可培養(yǎng)真菌的分離純化 取健株和病株天麻塊莖，超純水沖洗30 min，洗凈泥沙，放入超凈工作臺進行無菌操作。在75%乙醇溶液中浸泡30 s后，無菌水沖洗3～4次，放于無菌濾紙上吸干塊莖表面多余的水分，再于0.1%的氯化汞溶液中浸泡5 min，無菌水沖洗5～6次，置于墊有滅菌濾紙的平皿上。用解剖刀將天麻塊莖切成厚度約2 mm、長寬各約5 mm的薄片，接種于PDA平板,每皿接種1片，置于28 ℃條件下培養(yǎng)[13]。

1.2.2 天麻樣品可培養(yǎng)真菌的形態(tài)學鑒定 將純化的菌株轉(zhuǎn)接到察氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d，采用棉蘭染色法在光學顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)和大小，并參考《真菌鑒定手冊》[14]對其進行基本的分類鑒定。

1.2.3 天麻樣品可培養(yǎng)真菌的ITS分子鑒定 將PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的真菌菌絲體利用CTAB法提取DNA，并采用真菌通用引物ITS-1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS-4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行擴增。PCR反應體系(50 μL):2×TaqMaster Mix 25 μL，10 μmoL/L上、下游引物各2 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補至50 μL。PCR反應條件: 94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，36個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。4 ℃保存，備用[15]。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果進行BLAST比對，并提交至NCBI，利用Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。

1.3 天麻樣品內(nèi)真菌的高通量測序分析

1.3.1 天麻樣品內(nèi)真菌總DNA提取及高通量測序 采用上海生工生物工程有限公司的OMEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建的文庫利用Qubit定量和檢測合格后，利用Illumina Miseq測序平臺對真菌翻譯間隔序列ITS1—ITS2區(qū)進行雙末端測序[17]。

1.3.2 高通量測序數(shù)據(jù)分析 將得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識別(Base calling)分析轉(zhuǎn)化為原始數(shù)據(jù)，使用Usearch去除序列中的非擴增區(qū)域序列，而后對序列進行錯誤校正，并調(diào)用Uchime鑒定嵌合體，隨后與數(shù)據(jù)庫進行對比檢測并去除嵌合體序列[18-19]，得到有效數(shù)據(jù)(Clean reads)。將得到的有效數(shù)據(jù)按照序列間的距離進行聚類，通常以97%的一致性將序列聚類成為OTUs(Operational tabxonomic units)，最后用Mothur等軟件對OTUs序列進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 天麻樣品中可培養(yǎng)真菌的分離與鑒定

通過可培養(yǎng)法共分離55株菌，其中從健株天麻塊莖樣品分離得到19株真菌，病株天麻塊莖樣品分離得到36株真菌，利用分子生物學方法進行鑒定，以ITS1和ITS4引物進行擴增，得到長度約為800 bp的擴增片段，測序后提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中，進行序列分析和相似性比較，取相似性大于99%的序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹以確定所分離菌株的系統(tǒng)分類地位[20]。結(jié)果如圖2和圖3所示，健株與病株天麻塊莖內(nèi)真菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，健株分離得到的19株真菌屬于2個門6個目8個屬，病株分離得到的36株真菌屬于3個門7個目10個屬。

對分離的不同菌屬的菌株結(jié)合形態(tài)學方法進行觀察，結(jié)果如表1所示，從健株和病株天麻塊莖中分離的真菌歸為3門14屬，其中肉座菌屬(Hypocrea)、毛殼屬(Cheatomium)、木霉屬(Trichoderma)、莖點霉屬(Phoma)只在健株天麻中分離到，且其所有菌屬的菌株數(shù)量相差很小，分布較均勻；而枝孢屬(Cladosporium)、鏈格孢屬(Alternaria)、孢盤菌屬(Botrytis)、多孔菌屬(Pycnoporus)、栓菌屬(Trametes)只在病株天麻中分離得到，且病株的優(yōu)勢菌屬為鐮刀菌屬(Fusarium)，占比高達44.4%。根據(jù)國輝[21]、翟鳳艷等[22]研究可知，枝孢屬、鏈格菌屬、鐮刀菌屬均為植物致病菌，說明天麻發(fā)生病害后病株中致病真菌數(shù)量增加，真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

表1 天麻真菌種類及形態(tài)學特征Tab.1 Species and morphological characteristics of endophytic fungi in Gastrodia elata

續(xù)表1 天麻真菌種類及形態(tài)學特征Tab.1(Continued) Species and morphological characteristics of endophytic fungi in Gastrodia elata

2.2 基于高通量測序分析的天麻樣品內(nèi)真菌多樣性

2.2.1 天麻樣品真菌檢測及多樣性分析 在群落生態(tài)學中研究微生物多樣性，可以通過單樣品的多樣性分析(Alpha多樣性)反映微生物群落的豐度和多樣性[23]。本試驗采用稀釋曲線(Rarefaction curve)及多樣性指數(shù)(Diversity index)分析樣本的多樣性。稀釋曲線是采用對測序序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表的相應指數(shù)構(gòu)建曲線。當曲線趨于平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)只會產(chǎn)生少量新的OTUs。本試驗對天麻健株(JK)和病株(ZB)樣本所有有效序列計算后的Shannon指數(shù)稀釋曲線如圖4所示，隨著抽樣序列數(shù)的增多，健株天麻(JK)和病株天麻(ZB)的Shannon指數(shù)逐漸增加，最后趨于穩(wěn)定，說明2組樣本中真菌的文庫覆蓋率均較高，本次測序結(jié)果基本能代表樣本的真實情況。且由圖4可知，健株天麻的3個樣品香濃指數(shù)差異較小，病株天麻樣品ZB2和ZB3的香濃指數(shù)遠高于天麻健株的任意一樣品，而樣品ZB1香濃指數(shù)較低可能是由于取樣時未取到病害部位，從而使得其指數(shù)低于JK2。

利用軟件Usearch在97%相似度下將測序得到的序列進行聚類，6個樣品共產(chǎn)生1 692個OTUs，每個樣品測序得到的序列數(shù)量、OTUs數(shù)量及香濃指數(shù)見表2。Simpson指數(shù)反映天麻病害和健康狀態(tài)下真菌物種的多樣性，數(shù)值越小多樣性越高。Chao1和ACE指數(shù)反映天麻病害和健康狀態(tài)下真菌物種豐度，數(shù)值越大豐度越高[24]。由表2可知，健株天麻與病株天麻中真菌群落多樣性存在一定差異。其中，健株天麻的各樣品多樣性指數(shù)差異較小，病株天麻的各樣品多樣性指數(shù)相差較大。3個病株樣品的Simpson指數(shù)均較低，說明天麻病害狀態(tài)下的真菌物種多樣性均高于健康狀態(tài)下的天麻，病株樣品中ZB2樣品的OTUs數(shù)量最多，Chao1和ACE指數(shù)最高，表明所有樣品中ZB2真菌菌群最豐富，能最全面地代表天麻病株的群落結(jié)構(gòu)。

表2 天麻樣品的多樣性指數(shù)Tab.2 Diversity index of each Gastrodia elata sample

2.2.2 天麻內(nèi)真菌在門和屬水平上的群落組成 將上述聚類得到的1 692個OTUs的代表序列與NCBI數(shù)據(jù)庫代表序列進行BLASTn比對，進行物種注釋，共涵蓋49個屬(圖5)，選擇2組天麻豐度差異較大的8門33屬進行對比分析(表3)，由表3和圖5可知，從天麻中分離的真菌主要以子囊菌門(Ascomycota)為主，其次為擔子菌門(Basidiomycota)；健株天麻組和病株天麻組的菌屬類別相差較大，其中，除未分類真菌外，土赤殼屬(Ilyonectria)、木霉屬、鐮刀菌屬、被孢霉屬(Mortierella)、unclassifiedCercozoa在2組天麻樣品中均存在，且木霉屬菌株屬于生防菌，其在健株內(nèi)的豐度高于病株。鐮刀菌屬菌株屬于植物病原菌，其在病株中的豐度是健株的4.3倍，病株中的鐮刀菌屬菌株數(shù)量遠多于健株，這與傳統(tǒng)培養(yǎng)法的結(jié)果一致。而土赤殼屬在2種樣品中均為優(yōu)勢菌屬，豐度高達14%以上，但此菌屬菌株在傳統(tǒng)培養(yǎng)法中未分離出來，這可能是由于培養(yǎng)法所用的培養(yǎng)基無法提供其所需的營養(yǎng)，導致土赤殼屬菌株難以生長。而Trichocladium、Tetracladium、喬氏桿菌屬(Gyoerffyella)、未分類傘形霉屬(unclassifiedSordariomycetes)、地絲霉屬(Geomyces)、Macrocystidia等菌屬只在健株中分析到，且其中的優(yōu)勢菌屬有Macrocystidia，豐度高達17.01%，但該菌屬真菌不屬于植物生防菌；未分類柔膜菌屬(unclassifiedHelotiales)、Menispora、Dactylonectria、粉紅螺旋聚孢霉屬(Clonostachys)等菌屬只在病株中分析到， 其中未分類柔膜菌屬真菌豐度達到了9.81%，且未分類柔膜菌屬真菌為植物致病菌，因此，天麻病株所擁有的某些特有菌群可能具有一定的致病性，這些特有菌群可能是天麻發(fā)生病害的原因。

2.2.3 健株天麻與病株天麻真菌結(jié)構(gòu)的相似性分析 采用R軟件進行PCoA分析簡化數(shù)據(jù)，每個圖標(圖6)代表1個樣本，兩點之間距離越近，表明2個樣本之間的微生物群落結(jié)構(gòu)相似性越高，差異性越小，坐標軸括號中的百分比代表對應主成分所能解釋的原始數(shù)據(jù)中差異的比例。從圖6可知，第1坐標軸(PCoA1)的貢獻值為42.0%，第2坐標軸(PCoA2)的貢獻值為29.0%，第3坐標軸(PCoA3)的貢獻值為18.0%。病株天麻組3個樣本相似性較高，而與健株天麻組的距離較遠，說明2組的真菌群落相似性較低，這可能是由于天麻產(chǎn)生病害后改變了原有的微生物群落結(jié)構(gòu)，從而導致2組樣品的真菌群落相似性較低。

表3 健株與病株天麻中真菌屬級分類單元的豐度Tab.3 Abundance of fungal genus taxa in healthy and diseased Gastrodia elata

3 結(jié)論與討論

本研究綜合傳統(tǒng)培養(yǎng)法和高通量測序技術(shù)2種方法研究發(fā)現(xiàn)，健株與病株天麻塊莖中真菌群落組成存在顯著差異，兩者真菌群落結(jié)構(gòu)相似性低。傳統(tǒng)培養(yǎng)法結(jié)果表明，從不同健康狀態(tài)的天麻中共分離得到55株真菌，屬于14個屬，天麻中真菌多樣性表現(xiàn)為病株天麻組>健株天麻組，從健株天麻組中分離的每種真菌數(shù)量相差較小，菌群處于一個較平衡的狀況，而從病株天麻組中分離的各菌屬菌株數(shù)量不均勻，其中鐮刀菌屬、鏈格孢屬、青霉屬、枝孢屬菌株數(shù)量占比較大，鐮刀菌屬數(shù)量占比高達44.4%，為優(yōu)勢菌屬。沈清清等[25]研究表明，鐮刀菌屬是造成多種藥用植物根腐病的主要病原菌；王淑琴等[26]報道，鏈格菌屬能侵染植物，造成黑斑病。因此，推斷天麻內(nèi)各真菌種群豐度發(fā)生變化導致了天麻病害的發(fā)生。

與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，高通量測序更全面地展現(xiàn)了健株和病株天麻塊莖內(nèi)的真菌群落。結(jié)果顯示，從天麻中共分析得到49個屬，1 692個OTUs，但病株天麻組>健株天麻組，真菌結(jié)構(gòu)相似性較低，菌屬類別存在明顯差異。其中，除未分類真菌外，土赤殼屬、木霉屬等5個屬在2組樣品中均存在，土赤殼屬占比最大且屬于植物致病菌，此菌屬在病株中的豐度高出健株3.6個百分點，進一步證明天麻發(fā)生病害后致病菌豐度升高。柔膜菌屬(Helotiales)和鐮刀菌屬均為植物致病菌，本試驗中天麻病株中鐮刀菌屬真菌豐度是健株的4.3倍，未分類柔膜菌屬真菌只存在于病株中，且豐度達到了9.81%，這3個屬可能會導致天麻發(fā)生病害。因此，患病天麻內(nèi)真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變是天麻發(fā)生病害的重要特征。

研究天麻不同狀態(tài)下的真菌群落組成，可為探索天麻內(nèi)是否存在拮抗微生物提供新的線索。木霉屬真菌因其在生物防治中的應用潛力而備受關(guān)注，在本研究中，木霉屬真菌在病株天麻和健株天麻中的豐度分別為4.63%和6.01%，菌株數(shù)量差異明顯，進一步說明天麻發(fā)生病害與其真菌群落的組成有關(guān)，該研究結(jié)果有助于分離天麻內(nèi)的優(yōu)勢益生菌，通過添加益生菌可進一步驗證天麻患病的原因，為綠色防控天麻病害提供新思路。

本研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法和高通量測序技術(shù)結(jié)合的方式，更清楚地了解了健株天麻和病株天麻內(nèi)真菌群落的組成與差異，其中病株天麻塊莖內(nèi)真菌種群的豐度上升和致病菌屬相對豐度的增加，改變了天麻內(nèi)部原有的真菌群落結(jié)構(gòu)，從而導致了天麻病害的發(fā)生。因此，患病天麻植株內(nèi)的真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變是天麻發(fā)生病害的原因。