張澤宇 張 芯

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

近年來，我國高血壓病的患病率不斷上升［1］，2017年美國心臟協(xié)會(huì)將高血壓的標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整為≥130/80 mmHg，按此標(biāo)準(zhǔn)，我國成年人高血壓的患病率或?qū)⑦_(dá)到46.4%，患病人數(shù)可能超過5億人［2］。半夏配伍夏枯草常用于高血壓病、失眠和甲狀腺功能亢進(jìn)等病癥的治療［3-5］。相關(guān)研究表明，半夏具有抗炎和保護(hù)血管內(nèi)皮的作用［6］，夏枯草可通過降低血管緊張素Ⅱ和內(nèi)皮素-1等含量發(fā)揮降壓活性，且作用持久［7］。但中藥多成分多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，仍然是系統(tǒng)研究半夏-夏枯草藥對(duì)藥效物質(zhì)和作用機(jī)制的一大困難。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，可以分析出中藥的成分與疾病多靶點(diǎn)之間的相互作用，從而在整體上預(yù)測(cè)其活性成分及作用機(jī)制［8］。分子對(duì)接技術(shù)是通過計(jì)算機(jī)模擬，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與藥物分子之間的結(jié)合模式與親和力的一種方法［9］。本文將通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，篩選出半夏-夏枯草藥對(duì)的作用靶點(diǎn)，通過聚類分析預(yù)測(cè)其核心化合物，進(jìn)而使用分析軟件對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行信號(hào)通路分析與分子對(duì)接研究，預(yù)測(cè)治療高血壓的作用機(jī)制，為其治療高血壓的臨床和實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 半夏-夏枯草藥對(duì)活性成分和作用靶點(diǎn)獲取 利用 TCMSP 數(shù) 據(jù) 庫（http：//tcmspw.com/tcmspsearch.php），以“半夏”“夏枯草”作為關(guān)鍵詞，設(shè)置口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，篩選半夏-夏枯草藥對(duì)所含化合物成分并獲取其作用靶點(diǎn)。

1.2 半夏-夏枯草藥對(duì)高血壓相關(guān)靶點(diǎn)的收集 通過 genecards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/），以“Hypertension”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，將所得靶點(diǎn)根據(jù)Relevance score值降序排列，選取前400個(gè)作為疾病靶點(diǎn)。并用Venn工具將其與半夏-夏枯草藥對(duì)作用靶點(diǎn)進(jìn)行交集比對(duì)，得到“藥物-疾病”共同作用靶點(diǎn)。

1.3 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，將其作用關(guān)系進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析并可視化。以靶點(diǎn)度值（Degree）和中介中心度（betweenness centrality）評(píng)價(jià)半夏-夏枯草藥對(duì)有效成分及靶點(diǎn)的重要程度，從而探究半夏-夏枯草藥對(duì)中所含化合物的藥理作用機(jī)制。

1.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 用UniProt（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫將“藥物-疾病”共同作用靶點(diǎn)的靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)換為基因名稱，并將基因名稱上傳至STRING11.0（https：//string-db.org/），輸出PPI蛋白互作網(wǎng) 絡(luò) 圖（protein protein interaction network，PPI net?work），根據(jù)分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)靶點(diǎn)蛋白關(guān)聯(lián)頻次，獲取蛋白互作信息進(jìn)行研究，篩選出核心靶點(diǎn)。

1.5 KEGG通路富集分析 利用Bioconductor數(shù)據(jù)庫（https：//www.bioconductor.org/）對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Enclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析并將結(jié)果可視化。

1.6 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接 將靶點(diǎn)蛋白和化合物分子的pdb文件用AutoDockTools處理后保存為pdbqt格式的文件備用。將處理好的化合物與靶點(diǎn)蛋白，載入AutoDock Vina進(jìn)行對(duì)接，使用Pymol，Ligplus軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析與可視化。

1.7 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 取KEGG通路富集分析結(jié)果中排名前20的通路，結(jié)合文獻(xiàn)，篩選出7條與高血壓相關(guān)的通路。將活性成分、靶點(diǎn)、通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，得到“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 半夏-夏枯草藥對(duì)活性成分的篩選結(jié)果 見表1。根據(jù)設(shè)置的篩選條件，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選出半夏的活性成分11個(gè)，夏枯草的活性成分11個(gè)。β-谷甾醇，植物甾醇為兩者共同活性成分。

表1 半夏-夏枯草藥對(duì)的活性成分

2.2 半夏-夏枯草藥對(duì)治療高血壓的靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用genecards數(shù)據(jù)庫對(duì)高血壓靶點(diǎn)進(jìn)行檢索和排序篩選，最終得到400個(gè)與高血壓相關(guān)的靶點(diǎn)，通過Venny工具與半夏-夏枯草藥對(duì)中活性成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行交集比對(duì)，得到半夏-夏枯草藥對(duì)治療高血壓的“藥物-疾病”共同作用靶點(diǎn)54個(gè)，即為半夏-夏枯草藥對(duì)治療高血壓的潛在靶點(diǎn)。圖1為“藥物-疾病”的韋恩圖；表2為靶點(diǎn)信息。

表2 半夏-夏枯草藥對(duì)治療高血壓的潛在靶點(diǎn)信息表

圖1 半夏-夏枯草藥對(duì)靶點(diǎn)與高血壓靶點(diǎn)的韋恩圖

2.3 “藥物-化合物-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò) “藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)總共含有454條邊和211個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中包括2個(gè)藥物節(jié)點(diǎn)、20個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)（其中β-谷甾醇，植物甾醇為共同活性成分）、189個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，如圖2所示。

圖2 半夏-夏枯草藥對(duì)“藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.4 潛在靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 基于蛋白與蛋白之間相互作用關(guān)系，利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建半夏-夏枯草藥對(duì)潛在靶點(diǎn)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖（見圖3）。得到的PPI網(wǎng)絡(luò)包含54個(gè)節(jié)點(diǎn)，741條邊，平均Degree為27.4。根據(jù)節(jié)點(diǎn)的Degree值大小繪制出30個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白節(jié)點(diǎn)的條形圖（見圖4）。其中白細(xì)胞介素-6（IL-6）、蘇氨酸蛋白激酶（Akt1）、腫瘤壞死因子（TNF）的度值（Degree=48/45/44）較其他靶點(diǎn)蛋白高，說明這3個(gè)靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，是連通網(wǎng)絡(luò)中其他靶點(diǎn)蛋白的橋梁。

圖3 半夏-夏枯草藥對(duì)潛在蛋白靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 半夏-夏枯草藥對(duì)治療高血壓的STRING網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點(diǎn)（排名前30）

2.5 分子對(duì)接結(jié)果與分析 利用AutoDock Vina軟件，對(duì)靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)中degree值最大的3個(gè)靶點(diǎn)蛋白（IL-6、Akt1、TNF）與半夏-夏枯草藥對(duì)中的4個(gè)相關(guān)活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)果見表4，最低結(jié)合能表示化合物與靶點(diǎn)蛋白具的結(jié)合能力，結(jié)合能越小，代表兩者結(jié)合的越好［10］。圖5表示3個(gè)靶點(diǎn)蛋白與其各自對(duì)應(yīng)活性化合物對(duì)接最好的組合，其中包括IL-6與 luteolin，Akt1與 luteolin，TNF與 quercetin。對(duì)接結(jié)果說明了半夏-夏枯草藥對(duì)中活性成分和靶點(diǎn)蛋白之間具有良好的結(jié)合能力。

表3 靶點(diǎn)蛋白與活性化合物的對(duì)接結(jié)果

圖5 IL-6與luteolin，Akt1與luteolin，TNF與quercetin的結(jié)合模式

2.6 KEGG通路富集結(jié)果與分析 利用Bioconductor數(shù)據(jù)庫對(duì)“藥物-疾病”共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析并將分析結(jié)果轉(zhuǎn)化為氣泡圖。KEGG通路富集分析（圖6）提示，糖尿病并發(fā)癥中晚期糖基化終產(chǎn)物-糖基化終產(chǎn)物受體信號(hào)通路（AGE-RAGE signal?ing pathway in diabetic complications），流體剪切力與動(dòng)脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis），腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway），白細(xì)胞介素-17信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）等信號(hào)通路與高血壓的聯(lián)系更為密切。

圖6 半夏-夏枯草藥對(duì)潛在靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

2.7 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將半夏-夏枯草藥對(duì)治療高血壓的活性成分，靶點(diǎn)蛋白，分析篩選出的相關(guān)信號(hào)通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，將3者的關(guān)系可視化（見圖7）。圖中共有51個(gè)節(jié)點(diǎn)，149條邊?！俺煞?靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖體現(xiàn)了中藥治療疾病，具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，作用機(jī)制復(fù)雜。

圖7 半夏-夏枯草藥對(duì)“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

3 討論

中醫(yī)學(xué)將高血壓歸于“眩暈”的范疇。朱丹溪在歷代醫(yī)家認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上提出“無痰不作?！钡牟C(jī)理念，指出“眩暈屬痰者居多，蓋無痰不能作眩也”［11］。高血壓的證候研究結(jié)果顯示其證候以肝陽上亢為主，兼夾痰濁、痰熱、血瘀等［12］。半夏化痰散結(jié)，夏枯草清熱瀉火、化痰散結(jié)，兩藥配伍共奏清熱、化痰、散結(jié)之功效，與高血壓的主要證候良好契合。

本研究搜集了半夏-夏枯草藥對(duì)治療高血壓的活性成分共計(jì)20個(gè)，其中槲皮素、山柰酚等具有治療高血壓的相關(guān)作用。根據(jù)文獻(xiàn)記載，槲皮素能夠抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性，改善內(nèi)皮血管舒張［13］，山柰酚可以增強(qiáng)血管內(nèi)皮的非依賴性和依賴性舒張［14］。

PPI網(wǎng)絡(luò)顯示，半夏-夏枯草藥對(duì)的活性成分主要通過作用于IL-6、Akt1、TNF 3個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮治療高血壓的作用。靶點(diǎn)蛋白IL-6在血管內(nèi)的炎癥反應(yīng)與免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵的介導(dǎo)作用，能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞DNA的合成及增殖，與原發(fā)性高血壓有著密切的關(guān)系［15］。在特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓中，Akt1信號(hào)聯(lián)級(jí)參與遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移增強(qiáng)，具有無效Akt1編碼基因的小鼠患有肺動(dòng)脈高壓的概率很低，Akt1活性強(qiáng)弱影響著特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)?。?6］。在原發(fā)性高血壓的發(fā)病機(jī)制中，TNF-α通過細(xì)胞毒作用，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，TNF-α影響著機(jī)體對(duì)血壓的控制［15-17］。分子對(duì)接結(jié)果顯示，半夏-夏枯草藥對(duì)的活性成分與IL-6、Akt1、TNF有很好的親和力，半夏-夏枯草藥對(duì)所含化合物治療高血壓的生物活性需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

通過分析預(yù)測(cè)出的靶點(diǎn)和通路發(fā)現(xiàn)半夏-夏枯草藥對(duì)治療高血壓，主要是通過影響晚期糖基化終產(chǎn)物-糖基化終產(chǎn)物受體（AGEs、RAGE）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路等發(fā)揮作用。AGE與RAGE的相互作用，可能通過影響血管平滑肌細(xì)胞的增殖誘導(dǎo)血管肥厚，進(jìn)而導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生［18］。文獻(xiàn)記載，較高的血流剪切力利于維持正常的血管內(nèi)皮功能，減少內(nèi)皮損傷因子分泌，保護(hù)血管內(nèi)膜，有效防止高血壓的發(fā)生［19］。腫瘤壞死因子可引起血管內(nèi)皮損傷、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)IL-6的表達(dá)和釋放，在高血壓的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色［20］。有研究證明，IL-17的過表達(dá)將誘導(dǎo)全身內(nèi)皮功能障礙與動(dòng)脈高壓［21］。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法，預(yù)測(cè)分析半夏-夏枯草藥對(duì)的活性化合物、抗高血壓的分子機(jī)制并發(fā)掘了潛在的治療靶點(diǎn)，以期為下一步實(shí)驗(yàn)研究提供參考。