＊彭友 魏佳旭 衣爽 祖繼宏 趙雨竹

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 吉林 132101）

中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病目前常用的治療方法主要包括藥物、外科手術(shù)和細(xì)胞移植，然而這些方法效果并不理想，常伴有一定的副作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群組成和數(shù)量的改變對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療有著重要的作用，同時(shí)人體自身也能夠通過相應(yīng)的組織和器官對腸道的菌群進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而使腸道微生態(tài)達(dá)到平衡。嗜酸乳桿菌是益生菌中具有代表性的菌種之一，其在腸道、陰道、口腔等器官定殖。研究發(fā)現(xiàn)益生菌具有抗腫瘤，調(diào)節(jié)免疫等有益功效，補(bǔ)充益生菌還可以積極改善抑郁癥或焦慮等癥狀，因此這類細(xì)菌也被稱作精神性微生物。目前關(guān)于腸道細(xì)菌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的相互影響已有許多研究基礎(chǔ)，但對腸道菌群與神經(jīng)類細(xì)胞之間的研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)通過獲取嗜酸乳桿菌培養(yǎng)上清液來研究其對體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞增殖的影響。

1.實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)材料

(1)實(shí)驗(yàn)材料

RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，胎牛血清，PC12細(xì)胞株，嗜酸乳桿菌凍干菌體（保藏編號：ATCC 4356），MRS培養(yǎng)基，Cell Counting Kit 8（CCK-8）試劑盒。

(2)實(shí)驗(yàn)方法

①嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)。準(zhǔn)備蒸餾水100mL，同時(shí)準(zhǔn)備MRS粉末，用電子天平稱取6.62g。將稱好的粉末放入蒸餾水中溶解。隨后對液體進(jìn)行高壓滅菌處理，時(shí)間15min，恢復(fù)常溫后得到MRS液體培養(yǎng)基，隨后利用其進(jìn)行凍干菌體的復(fù)蘇，在輕微振蕩后將其溶解，溶解后進(jìn)行分裝。置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)24h。次日，準(zhǔn)備MRS液體培養(yǎng)基，取部分復(fù)蘇后的嗜酸乳桿菌加入到其中，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)24h，連續(xù)兩次分離培養(yǎng)。

②生長曲線測定。當(dāng)嗜酸乳桿菌的種子液OD600值為1時(shí)，以3%體積比將其加入100mLMRS液體培養(yǎng)基中。在37℃環(huán)境下靜置培養(yǎng)。每間隔2h要進(jìn)行取樣，每次取樣設(shè)置三個(gè)平行組，測量在600nm波長下的吸光值。隨后進(jìn)行生長曲線的繪制，縱坐標(biāo)為OD600的值，時(shí)間是橫坐標(biāo)。

③嗜酸乳桿菌上清液的制備。準(zhǔn)備MRS液體培養(yǎng)基，體積為100mL，向其中加入嗜酸乳桿菌種子液，體積比為3%，隨后進(jìn)行靜置培養(yǎng)，溫度為37℃，時(shí)間為28h。培養(yǎng)后對其進(jìn)行離心，時(shí)間為15min，轉(zhuǎn)數(shù)為8000r/min，離心后保留上清液將沉淀除去，隨后過濾，先后利用0.45μm和0.22μm孔徑的濾膜。把濾出的液體加到準(zhǔn)備好的MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行觀察，時(shí)間為一個(gè)星期，如果培養(yǎng)基上沒有出現(xiàn)細(xì)菌生長繁殖的情況，就可以對其進(jìn)行保存?zhèn)溆?，保存溫度?℃。

④細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響。PC12細(xì)胞懸液密度進(jìn)行調(diào)整至5×104cells/mL后接入96孔板，以100μL/孔培養(yǎng)。在經(jīng)過12h后將獲取的上清液分別以體積分?jǐn)?shù)2%、4%、6%加入孔板中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置不加上清液的對照組，每組設(shè)置三個(gè)平行組。2d后在顯微觀察生長情況并拍照記錄。

⑤細(xì)胞增殖影響。重復(fù)1.2.4的方法培養(yǎng)2d后，向每孔加入10μLCCK-8溶液，將96孔板放在培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h。后用酶標(biāo)儀測450nm處吸光度值，計(jì)算存活率。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。

2.結(jié)果與分析

(1)嗜酸乳桿菌的生長曲線

如圖1所示，嗜酸乳桿菌培養(yǎng)一共分為四個(gè)階段，其中0-7h處于遲緩期，7-20h為對數(shù)生長期，20-30h為穩(wěn)定期，30h后是衰亡期。因此，本實(shí)驗(yàn)所需上清液從培養(yǎng)時(shí)間28h左右的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中獲取。

圖1 嗜酸乳桿菌的生長曲線

(2)L.a.s對PC12細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響

如圖2所示，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞貼壁生長，此時(shí)為培養(yǎng)2d后的PC12細(xì)胞生長情況，且隨著上清液濃度增加，細(xì)胞密度也隨之增加，細(xì)胞形態(tài)沒有顯著變化。

圖2 PC12形態(tài)學(xué)圖片

(3)L.a.s對PC12細(xì)胞的增殖影響

如圖3所示，通過利用CCK-8法，發(fā)現(xiàn)隨著L.a.s體積分?jǐn)?shù)的增加，細(xì)胞存活率也隨之增加。其中，6%L.a.s處理組能夠使得細(xì)胞存活率發(fā)生很大變化。其主要表現(xiàn)為提升細(xì)胞的存活率，并且能夠提升至對照組的131.31±4.59%。

圖3 不同體積分?jǐn)?shù)L.a.s對PC12增殖情況

(4)L.a.s對PC12細(xì)胞熒光染色結(jié)果

如圖4所示，利用熒光顯微鏡觀察PC12細(xì)胞的染色情況。A為對照組，B、C、D組分別對應(yīng)為不同體積分?jǐn)?shù)的L.a.s處理組，相比于對照組，C1、C2和D1、D2組細(xì)胞數(shù)量更多，染色結(jié)果與顯微鏡下的觀察一致，說明細(xì)胞狀態(tài)正常。

圖4 PC12染色熒光圖片

3.結(jié)論

通過將培養(yǎng)時(shí)間為28h的L.a.s按不同體積分?jǐn)?shù)作用于PC12細(xì)胞，熒光染色和CCK-8細(xì)胞增殖檢測結(jié)果表明，PC12細(xì)胞能夠正常生長。而6%L.a.s處理組能夠?qū)C12細(xì)胞的存活率提高至未處理組的131.31±4.59%，說明一定濃度下的L.a.s具有促進(jìn)PC12細(xì)胞的作用。本研究并未對上清液中的具體有效成分進(jìn)行分析，后續(xù)可以考慮對其進(jìn)行詳細(xì)分析，篩選出對PC12細(xì)胞增殖促進(jìn)的主要成分，為進(jìn)一步研究其神經(jīng)保護(hù)作用打下基礎(chǔ)。