李永軍李蘭娟

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家感染性疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心,杭州 310003)

無(wú)菌動(dòng)物(germ-free,GF)是指身體任何部位及生活環(huán)境中均檢測(cè)不出任何活的細(xì)菌、真菌、病毒及寄生蟲的動(dòng)物[1]。無(wú)菌動(dòng)物來(lái)源于剖腹產(chǎn)和胚胎移植,通過(guò)人工飼養(yǎng),維護(hù)在正壓無(wú)菌隔離器中的動(dòng)物[2]。所有的飼料、墊料及水均經(jīng)滅菌處理,檢測(cè)無(wú)菌后方可傳入無(wú)菌隔離器內(nèi)。維持無(wú)菌動(dòng)物需要嚴(yán)格的無(wú)菌操作技術(shù)和定期的無(wú)菌檢測(cè)。由于不攜帶任何可檢測(cè)的微生物,可排除背景微生物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾,獲得高重復(fù)性,高敏感度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這種動(dòng)物可以有選擇性的接種多菌和單菌,來(lái)研究菌種對(duì)宿主的作用[3]。無(wú)菌動(dòng)物不是絕對(duì)無(wú)菌,而是相對(duì)無(wú)菌。在現(xiàn)有的無(wú)菌檢測(cè)技術(shù)下檢測(cè)不到任何微生物[4]。

1928年到1980年,Reyniers 等[5-6]與Knight等[7]證實(shí)了哺乳動(dòng)物、鳥、魚、昆蟲等可在無(wú)菌條件下飼養(yǎng)和維持。也是他們建立了第一代無(wú)菌大鼠和無(wú)菌小鼠。1945年美國(guó)圣母大學(xué)Lobund 實(shí)驗(yàn)室的Reyniers 等[5]首次培育出能連續(xù)傳代的無(wú)菌大鼠,接著Gustafsson[8]也成功培育無(wú)菌大鼠。Gilbert等[9]通過(guò)去除動(dòng)物中不同微生物的方法來(lái)研究其與宿主的關(guān)系。Kirk[10]對(duì)微生物與宿主的關(guān)系做了詳細(xì)的闡述。

微生物的質(zhì)量控制成為無(wú)菌動(dòng)物培育中至關(guān)重要的技術(shù)。從過(guò)去到現(xiàn)在,細(xì)菌、真菌的培養(yǎng)和革蘭染色鏡檢仍然是最常用的方法[11-13]。但在人工培養(yǎng)基上,由于條件限制,有些微生物不能生長(zhǎng),這就導(dǎo)致了無(wú)菌檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。為此有些實(shí)驗(yàn)室增加了分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)PCR,利用16S rRNA 進(jìn)行細(xì)菌的鑒定,用以彌補(bǔ)上述兩種檢測(cè)方法中的不足[13]。本文將結(jié)合國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn),對(duì)無(wú)菌動(dòng)物無(wú)菌檢測(cè)方法及影響因素進(jìn)行簡(jiǎn)要探討。

1 微生物培養(yǎng)

1.1 采樣

1.1.1 糞便標(biāo)本的采集

選取無(wú)菌隔離器內(nèi)健康成年無(wú)菌大鼠,抓取尾巴,讓糞便自然排出,棄去第一粒糞便。收取第二粒新鮮糞便裝于無(wú)菌小試管中。按照無(wú)菌操作程序從隔離器中傳出,并盡快接種完畢,防止在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中細(xì)菌死亡。

1.1.2 隔離器內(nèi)環(huán)境標(biāo)本的采集

將無(wú)菌隔離器內(nèi)滅菌棉簽用無(wú)菌水浸濕,擦拭水瓶口、進(jìn)出通風(fēng)口、隔離器內(nèi)壁、籠具表面、動(dòng)物毛發(fā)、手套等。裝于無(wú)菌小試管中,按照無(wú)菌操作程序從隔離器中傳出。棉簽必須使用高壓蒸汽滅菌,干熱滅菌會(huì)使脫脂棉產(chǎn)生殺菌物質(zhì),影響細(xì)菌的檢出。

1.1.3 飼料、墊料及水標(biāo)本的采集

將無(wú)菌隔離器內(nèi)飼料、墊料、水均取適量裝于無(wú)菌小試管中,按照無(wú)菌操作程序從隔離器中傳出。

1.2 細(xì)菌、真菌培養(yǎng)

1.2.1 國(guó)內(nèi)無(wú)菌動(dòng)物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

污染無(wú)菌動(dòng)物的微生物主要是厭氧菌、需氧菌及真菌,可以通過(guò)不同的培養(yǎng)基、不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)環(huán)境對(duì)污染菌進(jìn)行檢測(cè)。目前我國(guó)無(wú)菌動(dòng)物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)主要根據(jù)GB/T 14926.41-2001《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)菌動(dòng)物生活環(huán)境及糞便標(biāo)本的檢測(cè)方法》,該標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定無(wú)菌檢測(cè)中所使用的培養(yǎng)基及試劑、檢測(cè)程序、操作步驟及結(jié)果報(bào)告等。3 種液體培養(yǎng)基為腦心浸液肉湯(brain heart infusion broth,BHI)、硫乙醇酸鈉肉湯(thioglycollate broth,TB)、大豆蛋白胨肉湯(tryptic soy broth,TSB),1 種固體培養(yǎng)基血瓊脂平板,試劑為無(wú)菌生理鹽水。標(biāo)本采集后,接種腦心浸液肉湯和硫乙醇酸鈉肉湯、大豆蛋白胨肉湯增菌培養(yǎng),放37℃培養(yǎng),分別以7、14 d 轉(zhuǎn)接血平板并革蘭染色鏡檢。轉(zhuǎn)接血平板后37℃培養(yǎng)48 h,觀察有無(wú)細(xì)菌、真菌生長(zhǎng),最終判斷是否存在細(xì)菌、真菌污染。此標(biāo)準(zhǔn)刪除了GB/T 14926.41-1994《無(wú)特定病原體動(dòng)物無(wú)菌動(dòng)物生活環(huán)境及糞便標(biāo)本的檢測(cè)方法》中的無(wú)特定病原體動(dòng)物生活環(huán)境及糞便標(biāo)本的檢測(cè)方法,保留了無(wú)菌動(dòng)物生活環(huán)境及糞便標(biāo)本的檢測(cè)方法。增加了硫乙醇酸鈉培養(yǎng)基在使用前需煮沸驅(qū)氧程序。再?gòu)囊后w培養(yǎng)基轉(zhuǎn)種血瓊脂平皿時(shí)增加了涂片染色鏡檢。以防止在轉(zhuǎn)種時(shí)細(xì)菌死亡而不能在平板培養(yǎng)基生長(zhǎng)而造成漏檢。GB/T14926.43-2001《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)、染色法、培養(yǎng)基和試劑》,該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)培養(yǎng)基的配制、分裝、高壓滅菌條件、儲(chǔ)藏條件及使用期限作了規(guī)定。

1.2.2 國(guó)內(nèi)無(wú)菌動(dòng)物檢測(cè)的優(yōu)缺點(diǎn)

國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)標(biāo)本采集數(shù)量、標(biāo)本稀釋程度、標(biāo)本存放及接種時(shí)間都未做詳細(xì)規(guī)定。檢測(cè)時(shí)未對(duì)需氧、厭氧培養(yǎng)進(jìn)行區(qū)分。對(duì)培養(yǎng)基的接種管數(shù)及陽(yáng)性對(duì)照菌未詳細(xì)規(guī)定。冷藏后培養(yǎng)基需怎樣處理后使用未做詳細(xì)規(guī)定。微生物培養(yǎng)方法被認(rèn)為是有一定局限性的,三種培養(yǎng)基不能培養(yǎng)所有微生物。好多哺乳動(dòng)物的腸道微生物在實(shí)驗(yàn)室里不容易培養(yǎng),主要缺乏合適的培養(yǎng)基和方法。培養(yǎng)鑒定微生物污染技術(shù)較繁瑣和困難。嚴(yán)格的厭氧菌培養(yǎng)需要特殊的設(shè)備和專業(yè)的操作。

腦心浸液肉湯適合細(xì)菌的增菌培養(yǎng),大部分需氧菌、兼性厭氧菌都能生長(zhǎng),如糞性鏈球菌、大腸埃希菌及苛養(yǎng)菌的培養(yǎng)。硫乙醇酸鈉肉湯適合需氧菌、厭氧菌、兼性厭氧菌的培養(yǎng),主要用于厭氧菌的培養(yǎng)。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基在2000年、2005年及2015年版中國(guó)藥典中被用作無(wú)菌檢查培養(yǎng)基,歐洲藥典(EP)、日本藥典(JP)、英國(guó)藥典(BP)、美國(guó)藥典(USP)無(wú)菌檢查也均采用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基,配方一致,用于需氣菌、兼性厭氧菌、厭氣菌的培養(yǎng)。雖然硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基被各國(guó)用作無(wú)菌檢查,但它自身也存在一定的局限性[14]:(1)一些苛養(yǎng)菌或強(qiáng)致病菌較難檢出;(2)刃天青對(duì)微生物有抑制作用、與專門的厭氧菌培養(yǎng)方法如厭氧缸法、 厭氧袋 (bio-bag )、 厭氧手套箱(anaerobieglovebox)、厭氧盒等相比較,其厭氧環(huán)境有限。

革蘭染色鏡檢也存在各種干擾因素,如飲食中的蔬菜纖維、糞便中的各種物質(zhì)、食物中留下的死菌。無(wú)法鑒別是死菌或活菌,需要培養(yǎng)方法來(lái)確認(rèn)[15]。革蘭染色陽(yáng)性細(xì)菌相對(duì)容易檢出和觀察,而體積較小的革蘭陰性球菌則較難觀察到。革蘭染色鏡檢的檢出限量約109CFU/g 糞便[16]。對(duì)于無(wú)菌動(dòng)物來(lái)說(shuō),污染初期腸道中微生物是比較少的,易受到糞便中的殘?jiān)?、碎屑等因素的干擾。對(duì)于有經(jīng)驗(yàn)的觀察者來(lái)說(shuō)也是非常極具挑戰(zhàn)性的,極易造成漏檢?？傊?革蘭染色鏡檢的確定是對(duì)檢測(cè)靈敏度較低、易造成漏檢,優(yōu)點(diǎn)時(shí)即時(shí)出結(jié)果、速度較快、操作簡(jiǎn)便、成本較低。

1.2.3 中國(guó)藥典(2015 版)無(wú)菌檢查

相較于國(guó)內(nèi)動(dòng)物無(wú)菌檢測(cè),中國(guó)藥典無(wú)菌檢測(cè)方法相對(duì)比較全面,但僅適用醫(yī)藥用品。目前,美國(guó)、歐盟、日本等國(guó)家或組織無(wú)菌檢查法已協(xié)調(diào)一致[17]。相比于2010 版中國(guó)藥典,2015 版中國(guó)藥典對(duì)無(wú)菌檢測(cè)法的的檢測(cè)范圍及環(huán)境要求、培養(yǎng)體系、方法適用性、檢查方法等做了進(jìn)一步完善,接近國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)。2015版中國(guó)藥典中規(guī)定了無(wú)菌檢查必須在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)環(huán)境必須達(dá)到無(wú)菌的要求。培養(yǎng)基主要使用硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基主要用于厭氧菌的培養(yǎng);胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基主要用于需氧菌和真菌的培養(yǎng)。這與國(guó)內(nèi)無(wú)菌動(dòng)物檢測(cè)采用的培養(yǎng)基相同。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的PH=(7.3 ± 0.2),接近中性,適用于需氧菌和真菌的培養(yǎng)[18-20]。藥典規(guī)定了培養(yǎng)基PH 測(cè)定的溫度應(yīng)在25℃。細(xì)菌培養(yǎng)的溫度在20 ～25℃和30～35℃,符合了大部分微生物的需求。規(guī)定了微生物的培養(yǎng)時(shí)間[21]。規(guī)定了培養(yǎng)基的接種管數(shù),對(duì)陽(yáng)性對(duì)照菌的選擇做了細(xì)化。

1.2.4 國(guó)外無(wú)菌動(dòng)物無(wú)菌檢測(cè)

國(guó)外無(wú)菌檢測(cè)所使用的培養(yǎng)基各不相同,培養(yǎng)時(shí)間和方法也不統(tǒng)一。國(guó)外無(wú)菌小鼠無(wú)菌檢測(cè)使用培養(yǎng)基有LB 培養(yǎng)基(LB)、沙保培養(yǎng)基、腦心浸液(brain heart infusion broth,BHI)、MRS 瓊脂培養(yǎng)基、ML 瓊脂培養(yǎng)基[22]。取1 mL 標(biāo)本懸液接種在BHI、MRS、ML、LB 培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)72 h,沙保培養(yǎng)基22℃培養(yǎng)3周。標(biāo)本懸液直接涂片鏡檢。

也有報(bào)道使用腦心浸液肉湯(需氧菌培養(yǎng))、硫乙醇酸鈉肉湯(厭氧菌培養(yǎng))、沙保肉湯(真菌培養(yǎng)),37℃培養(yǎng)1周甚至更長(zhǎng),以防生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌漏檢。血平板和其它非選擇性培養(yǎng)基37℃至少培養(yǎng)5 d。推薦接種一份標(biāo)本于稍低溫度培養(yǎng),比如30℃或室溫,更適合環(huán)境微生物的生長(zhǎng)[15];也有研究推薦增加56℃培養(yǎng)[23]。液體培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁再接種固體培養(yǎng)基培養(yǎng)和顯微鏡鏡檢。渾濁可能接種后幾天出現(xiàn),但不一定是細(xì)菌生長(zhǎng),有可能是糞便和其它有機(jī)物沉淀。此法與國(guó)內(nèi)無(wú)菌動(dòng)物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)所使用培養(yǎng)基基本一致。

有研究使用腦心浸液肉湯、沙保肉湯以及營(yíng)養(yǎng)肉湯作為無(wú)菌檢測(cè)培養(yǎng)基[11],需氧和厭氧兩種環(huán)境37℃培養(yǎng)48 h。兩種環(huán)境下培養(yǎng)設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。最好使用厭氧菌來(lái)確定無(wú)氧環(huán)境。

國(guó)外無(wú)菌檢測(cè)的內(nèi)容和方法包括:(1)直接涂片鏡檢法:當(dāng)無(wú)菌動(dòng)物腸道中有大量細(xì)菌繁殖時(shí),可以利用相差顯微鏡快速的檢測(cè)腸道中的細(xì)菌,但因?yàn)榇朔?xì)菌未經(jīng)染色,會(huì)對(duì)有些比較小和不運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌造成漏檢,需要非常有經(jīng)驗(yàn)的操作者,對(duì)食物殘?jiān)图?xì)菌進(jìn)行辨別。(2)細(xì)菌染色鏡檢:包括革蘭染色鏡檢、DNA 染色法。(3)細(xì)菌、真菌培養(yǎng)。(4)分子生物學(xué)檢測(cè)。(5)病毒學(xué)檢測(cè)。(6)寄生蟲學(xué)檢測(cè)[15]。

1.2.5 無(wú)菌檢測(cè)培養(yǎng)方法的局限性

傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測(cè)方法,容易培養(yǎng)的是需氧和兼性厭氧菌,只占腸道細(xì)菌總量的小部分。比如乳酸桿菌、鏈球菌、腸球菌和葡萄球菌等。但是嚴(yán)格厭氧菌在腸道細(xì)菌中所占的比例極高,每克糞便中含1011個(gè)嚴(yán)格厭氧菌。通過(guò)培養(yǎng)容易檢測(cè)的嚴(yán)格厭氧菌的比例約每克糞便106個(gè),甚至更低[15]。

雖然微生物培養(yǎng)是比較敏感的方法,但它有一定的檢出限量,當(dāng)腸道細(xì)菌數(shù)量少于100 ～1000 CFU/g 糞便[24],不容易檢出。它的污染因素也有很多,比如實(shí)驗(yàn)室里常用的細(xì)菌的污染;實(shí)驗(yàn)室工作人員的皮膚和普通動(dòng)物糞便的污染;飼料、墊料、器械等高壓滅菌不徹底而傳進(jìn)隔離器造成的污染。實(shí)驗(yàn)室里細(xì)菌的污染通常都是人工培養(yǎng)基上能較好生長(zhǎng)的細(xì)菌。皮膚上的葡萄球菌和糞便中的大腸桿菌都能在人工培養(yǎng)基上較好生長(zhǎng)。微生物培養(yǎng)必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格無(wú)菌操作培訓(xùn)的專業(yè)人員進(jìn)行操作,必須在超凈臺(tái)或者生物安全柜中進(jìn)行,否則出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率還是挺高的。培養(yǎng)的標(biāo)本量的多少也會(huì)影響結(jié)果。因此,培養(yǎng)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果必須借助其他方法證實(shí)其結(jié)果的可靠性。

2 分子生物學(xué)技術(shù)

2.1 采樣

在無(wú)菌正壓隔離器中,取新鮮無(wú)菌動(dòng)物糞便和飼料,稱量約200 mg 于1.5 mL 無(wú)菌離心管中。按照無(wú)菌操作傳出隔離器,立即液氮冷凍并轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存,直到DNA 提取。

2.2 16S rRNA 基因測(cè)序應(yīng)用于無(wú)菌動(dòng)物無(wú)菌檢測(cè)

目前16S rRNA 基因測(cè)序是鑒定腸道細(xì)菌常用的分子生物學(xué)技術(shù)。利用16S rRNA 分析腸道微生物群至少包括1800 個(gè)種屬和40000 種細(xì)菌[25]。提取哺乳動(dòng)物新鮮糞便中的DNA,通過(guò)細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,再經(jīng)16S rRNA 基因測(cè)序,得到細(xì)菌的種類。一般細(xì)菌鑒定選擇細(xì)菌通用引物,最常用的引 物 是27F/1492R。27F:5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′,1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。有的文章中會(huì)使用不同的通用引物[26]。有文獻(xiàn)提到利用16S rRNA PCR 技術(shù)證明無(wú)菌動(dòng)物的無(wú)菌狀態(tài)[11]。RAPD PCR 用于鑒定已知定植菌動(dòng)物的污染[15]。國(guó)外對(duì)PCR、qPCR 等分子生物學(xué)技術(shù)在無(wú)菌動(dòng)物和已知菌動(dòng)物做了詳細(xì)的比較,結(jié)果16S rRNA PCR 最適用于無(wú)菌動(dòng)物的檢測(cè)[13]。

2.3 16S rRNA 在無(wú)菌動(dòng)物無(wú)菌檢測(cè)中的優(yōu)點(diǎn)

過(guò)去十幾年,分子生物學(xué)技術(shù)在腸道微生物中的應(yīng)用超過(guò)了細(xì)菌培養(yǎng)方法。16S rRNA 技術(shù)因具有快速、高效的特點(diǎn)。相對(duì)于細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù),PCR技術(shù)特異性較高,被用于細(xì)菌的種屬鑒定。16S rRNA 能夠鑒定難以分類的微生物種類,特別是需要嚴(yán)格厭氧的細(xì)菌,鑒定培養(yǎng)陰性的細(xì)菌?，F(xiàn)在人們開始使用16S rRNA 技術(shù)檢測(cè)無(wú)菌動(dòng)物是否污染,可以增加檢測(cè)的敏感性和最大限度的檢出生長(zhǎng)不良或較難檢出的細(xì)菌污染[27-29]。相比較其它細(xì)菌測(cè)序方法,16S rRNA 價(jià)格較便宜。分析時(shí)不需要太多的計(jì)算量。樣本數(shù)量越大, 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)越準(zhǔn)確[30]。

2.4 16S rRNA 在無(wú)菌動(dòng)物無(wú)菌檢測(cè)中的缺點(diǎn)

16S rRNA 技術(shù)相對(duì)于細(xì)菌培養(yǎng),敏感性較低,16S rRNA 對(duì)細(xì)菌的檢出限量約105CFU/g 糞便[16]。這與16S rRNA 技術(shù)是個(gè)非常敏感的檢測(cè)手段相矛盾。低于這個(gè)數(shù)量,就很難檢測(cè)出來(lái)。當(dāng)無(wú)菌動(dòng)物糞便中的含菌量低于這個(gè)數(shù)量,就很容易造成漏檢。但檢測(cè)污染嚴(yán)重的無(wú)菌動(dòng)物還是非常有效的。糞便樣本DNA 的提取結(jié)果和PCR 引物的選擇,對(duì)16S rRNA 鑒定的結(jié)果影響較大。16S rRNA 只能對(duì)細(xì)菌種屬鑒定,不能進(jìn)行細(xì)菌定量。無(wú)法辨別糞便中是死菌或活菌[30]。相對(duì)于細(xì)菌培養(yǎng)和革蘭染色鏡檢,16S rRNA 測(cè)序花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng),而且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。

雖然存在于腸道中的大部分微生物是細(xì)菌,但仍有部分真菌和古菌的存在[31]。利用16S rRNA 基因測(cè)序只能檢測(cè)腸道中的細(xì)菌種類。大量不同形態(tài)的真菌存在哺乳動(dòng)物的腸道中[32]。124個(gè)健康歐洲人的糞便標(biāo)本,利用宏基因組測(cè)序536112 個(gè)獨(dú)立基因,其中0.8%是古菌[33]。16S rRNA 只是鑒定細(xì)菌的污染。有方法提到利用專門的DNA 提取技術(shù)和qPCR 來(lái)鑒定真菌[34],古菌的擴(kuò)增引物也有被描述[35]。

2.5 16S rRNA 在無(wú)菌動(dòng)物無(wú)菌檢測(cè)中的影響因素

16S rRNA 在無(wú)菌動(dòng)物無(wú)菌檢測(cè)中,需防止樣本采樣中、分析中的污染。在無(wú)菌隔離器中采樣并稱重,保持樣本無(wú)菌包裝并密封。新鮮無(wú)菌動(dòng)物糞便從無(wú)菌隔離器中傳出后,應(yīng)盡快進(jìn)行PCR 分析,以盡量減少樣本和分析中的污染風(fēng)險(xiǎn)[11]。所有操作必須在超凈臺(tái)中進(jìn)行,每一步都必須無(wú)菌操作,且操作人員必須通過(guò)專業(yè)培訓(xùn)。檢測(cè)糞便樣本中含有較多的植物,聚合酶抑制劑可能會(huì)影響PCR 分析。這些因素可以通過(guò)設(shè)計(jì)用于糞便樣本中提取DNA 的試劑盒來(lái)減少[15]。食物中存在細(xì)菌的DNA應(yīng)該被考慮在內(nèi),低含量的DNA 通常在腸道中被檢測(cè)到,除非使用化學(xué)定義飲食[15]。輻照飼料中的葉綠素也會(huì)干擾DNA 的提取,不能確定是細(xì)菌DNA還是植物DNA,從而影響PCR 分析。需通過(guò)16S rRNA 測(cè)序進(jìn)一步來(lái)鑒定是否是細(xì)菌DNA。如是細(xì)菌DNA,需進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和革蘭染色確定是否為活菌[30]。DNA 的提取質(zhì)量至關(guān)重要,直接影響16S rRNA 測(cè)序的結(jié)果[30]。檢測(cè)樣本中含菌量的多少將會(huì)直接影響無(wú)菌檢測(cè)結(jié)果,16S rRNA 測(cè)序具有一定的檢出限量,需借助其它檢測(cè)方法進(jìn)一步檢測(cè)[16]。

3 食物經(jīng)過(guò)不同的滅菌方法對(duì)無(wú)菌檢測(cè)的影響

現(xiàn)在無(wú)菌動(dòng)物飼料的滅菌方法主要有兩種:高壓蒸汽滅菌與鈷60 輻照滅菌。滅菌飼料中的死菌會(huì)不會(huì)經(jīng)過(guò)腸道存在動(dòng)物糞便中。(1)當(dāng)無(wú)菌動(dòng)物飼喂輻照滅菌飼料,糞便微生物培養(yǎng)檢測(cè)陰性。革蘭染色鏡檢確存在典型的革蘭陽(yáng)性桿菌[15,36]。繼續(xù)喂食同一批飼料,到第4 天細(xì)菌數(shù)量開始下降,直至第8 天細(xì)菌完全消失。重新引入新一批輻照飼料飼喂無(wú)菌動(dòng)物,細(xì)菌重新出現(xiàn),并于第10 天消失。細(xì)菌數(shù)量未增加,證實(shí)不存在活菌。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間,死菌在腸道中會(huì)被分解消化[37]。(2)飼喂高壓滅菌飼料,糞便微生物檢測(cè)陰性。革蘭染色鏡檢也會(huì)觀察到少量死菌,但已經(jīng)失去典型的形態(tài)學(xué)特征[16]。

關(guān)于高壓滅菌飼料和輻照滅菌飼料利用PCR技術(shù)是否能檢測(cè)到細(xì)菌DNA,大部分僅介紹了PCR檢測(cè)結(jié)果,描述了滅菌過(guò)的飼料未檢測(cè)到細(xì)菌DNA,但對(duì)哪種滅菌方法未做詳細(xì)介紹[13]。我們對(duì)兩種飼料作了比較,高壓滅菌飼料經(jīng)PCR 擴(kuò)增不出細(xì)菌DNA。輻照滅菌的飼料由于含有葉綠體,PCR擴(kuò)增后,跑膠會(huì)出現(xiàn)明顯條帶,通過(guò)16S rRNA 測(cè)序證明會(huì)有極少數(shù)細(xì)菌DNA 未被完全破壞,可有少數(shù)死菌DNA 會(huì)被擴(kuò)增出來(lái),造成假陽(yáng)性。飼喂兩種飼料,利用16S rRNA PCR 技術(shù),無(wú)菌動(dòng)物糞便中均未擴(kuò)增出細(xì)菌DNA。這與報(bào)道的輻照飼料的細(xì)菌結(jié)構(gòu)未被破壞,有可能存在無(wú)菌動(dòng)物糞便中相吻合[15]。

4 無(wú)菌動(dòng)物的檢測(cè)頻率

國(guó)外對(duì)無(wú)菌動(dòng)物無(wú)菌檢測(cè)頻率未做規(guī)定,按照國(guó)外最近發(fā)行文章的無(wú)菌動(dòng)物檢測(cè)頻率要求:(1)空隔離器(動(dòng)物傳遞之前),濕棉拭子取隔離器表面,角落,通風(fēng)口標(biāo)本做1 次無(wú)菌培養(yǎng)及PCR 檢測(cè)。(2)對(duì)無(wú)菌隔離器內(nèi)飼料、墊料標(biāo)本每4周做1 次無(wú)菌培養(yǎng)。(3)無(wú)菌動(dòng)物糞便標(biāo)本每4周做1 次無(wú)菌培養(yǎng)及PCR 檢測(cè)。(4)3 ～6 個(gè)月做1 次動(dòng)物全身檢測(cè),包括無(wú)菌培養(yǎng),病毒檢測(cè)、寄生蟲檢測(cè)及PCR 檢測(cè)。(5)水、飼料、墊料每批滅菌均需滅菌指示劑合格,傳遞之前均需做無(wú)菌培養(yǎng)[15]。

一些機(jī)構(gòu)報(bào)道無(wú)菌檢測(cè)需2周1 次或者每周1次,PCR 檢測(cè)每月1 次[11]。檢測(cè)方法包括宏觀和微觀鏡檢、細(xì)菌和真菌培養(yǎng)和分子生物學(xué)方法[15]。美國(guó)charles river 實(shí)驗(yàn)室對(duì)飼養(yǎng)的無(wú)菌小鼠檢測(cè)頻率,每周對(duì)每個(gè)隔離器飼料、墊料、糞便做1 次細(xì)菌真菌培養(yǎng)和相差顯微鏡觀察有無(wú)活的微生物。每季度取一次無(wú)菌小鼠糞便,做16S rRNA PCR 檢測(cè)。每年做1 次動(dòng)物組織和器官病原體檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)、寄生蟲檢測(cè)等項(xiàng)目。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上所述,在無(wú)菌動(dòng)物的無(wú)菌檢測(cè)中,不管是培養(yǎng)方法、革蘭染色鏡檢及16S rRNA PCR。都有固有的缺陷和優(yōu)點(diǎn)。只有三種方法互相結(jié)合,取長(zhǎng)補(bǔ)短。把無(wú)菌動(dòng)物的無(wú)菌檢測(cè)漏檢率降到最低,才能有效的確保無(wú)菌動(dòng)物的無(wú)菌狀態(tài)。